生物學(xué)案：專題課題血紅蛋白的提取和分離

學(xué)必求其心得，業(yè)必貴于專精學(xué)必求其心得，業(yè)必貴于專精學(xué)必求其心得，業(yè)必貴于專精課題3血紅蛋白的提取和分離問題導(dǎo)學(xué)一、血紅蛋白提取和分離的原理活動與探究11．分離生物大分子的基本思路是什么？2．蛋白質(zhì)的分離和提取的原理是什么？3．凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理是什么？4．討論電泳的作用及其原理是什么.遷移與應(yīng)用1用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)時，相對分子質(zhì)量大的蛋白質(zhì)()。A．路程較長,移動速度較慢B．路程較長，移動速度較快C．路程較短，移動速度較慢D．路程較短，移動速度較快電泳方法瓊脂糖凝膠電泳SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳由于瓊脂糖本身不帶電荷，各種分子在電場中遷移速率決定于所帶電荷性質(zhì)的差異及分子的大小、形狀等在凝膠中加入SDS，使蛋白質(zhì)解聚成單鏈。SDS能與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物，使其遷移速率完全取決于分子的大小二、凝膠色譜法的實驗操作活動與探究21．思考洗滌紅細胞的目的和過程分別是什么。2．在血紅蛋白釋放的過程中加入蒸餾水和甲苯的目的分別是什么？3．觀察教材圖5－18，討論血紅蛋白釋放后的混合液經(jīng)離心后分為哪幾層?如何獲得血紅蛋白溶液?4．采用何種裝置進行透析？并說出透析的目的。5．試從凝膠色譜的分離原理分析凝膠的裝填要緊密、均勻的原因。6．滴加樣品時，應(yīng)注意什么問題?7．探究樣品洗脫時，紅色區(qū)帶可能會出現(xiàn)哪些情況？8．總結(jié)血紅蛋白提取和分離的完整過程。遷移與應(yīng)用2將經(jīng)處理破裂后的紅細胞混合液以2000r·min－1的速度離心10min后，離心管中的溶液分為四層，從上到下依次是(）。A．血紅蛋白、甲苯層、脂類物質(zhì)層、沉淀層B．甲苯層、沉淀層、血紅蛋白、脂類物質(zhì)層C．脂類物質(zhì)層、血紅蛋白、甲苯層、沉淀層D．甲苯層、脂類物質(zhì)層、血紅蛋白、沉淀層1．樣品處理、分離與純化的目的不同目的紅細胞洗滌去除雜質(zhì)，如血漿蛋白血紅蛋白釋放使紅細胞破裂，釋放血紅蛋白分離血紅蛋白溶液經(jīng)過離心使血紅蛋白與其他雜質(zhì)分離開透析除去樣品中分子較小的雜質(zhì)純化除去相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)2．分離血紅蛋白溶液的結(jié)果答案：課前·預(yù)習(xí)導(dǎo)學(xué)【預(yù)習(xí)導(dǎo)引】一、1．形狀和大小電荷親和力2．（1）相對分子質(zhì)量的大小分配色譜法多孔球體多糖類化合物貫穿的通道容易進入較慢較短相對分子質(zhì)量的不同（2)帶電粒子帶電性質(zhì)的差異分子本身的大小遷移速度瓊脂糖凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳分子的大小3．（1）緩沖劑緩沖劑的使用比例預(yù)習(xí)交流1：提示：細胞外液中主要的酸堿緩沖對有：H2CO3/NaHCO3、NaH2PO4/Na2HPO4等。二、1．（1)去除雜蛋白低速短時間離心黃色蒸餾水甲苯脂溶性沉淀層(2）透析袋透析袋磷酸緩沖液12h樣品中相對分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)（3）凝膠色譜(4）SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳2．（2）垂直緩慢均勻50cm磷酸緩沖液（3）緩沖液凝膠面頂端加樣后，打開下端出口，等樣品完全進入凝膠層后，關(guān)閉下端出口20mmol/L的磷酸緩沖液紅色的蛋白質(zhì)5mL3．（1）洗滌次數(shù)離心速度離心時間洗滌次數(shù)離心速度時間白細胞（2)洗脫液濕凝膠沸水?。?)氣泡洗脫次序分離效果（4）均勻一致預(yù)習(xí)交流2：(1)提示:凝膠色譜柱裝填的是凝膠顆粒,允許小分子進入，不允許大分子進入，通過延長小分子的路程使大分子與小分子分離。固定化酶的反應(yīng)柱裝填的是固定有酶的載體顆粒,既能催化反應(yīng)物的反應(yīng),又保證了酶與反應(yīng)物分子的分離，實現(xiàn)了酶的重復(fù)利用,節(jié)約了生產(chǎn)成本.（2）提示:不是。固定化酶的反應(yīng)柱能進行化學(xué)反應(yīng),凝膠色譜柱不能進行化學(xué)反應(yīng)。課堂·合作探究【問題導(dǎo)學(xué)】活動與探究1：1．提示：選用一定的物理或化學(xué)方法分離具有不同物理或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子。2．提示：根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異,如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)與多少、溶解度、吸附性質(zhì)和對其他分子的親和力等分離不同種類的蛋白質(zhì).3．提示：當(dāng)相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子通過凝膠時，相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)分子通過多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動快；相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)分子穿過多孔凝膠顆粒的內(nèi)部通道，路程長，流動慢。因此可將相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分離。4．提示：電泳能使帶電分子向與其所帶電荷相反的電極方向移動。由于待分離樣品中各種分子的帶電性質(zhì)的差異、分子大小及形狀不同，所以在電場中的遷移速度不同，從而實現(xiàn)分離。遷移與應(yīng)用1：D解析:凝膠顆粒內(nèi)部有許多貫穿的通道,當(dāng)相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時，相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)容易進入凝膠內(nèi)部的通道，路程較長，移動速度較慢；而相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)無法進入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動,路程較短，移動速度較快?；顒优c探究2：1．提示:（1）目的是去除血漿蛋白等雜蛋白.(2）過程：血液低速短時離心,去除上層黃色血漿→加生理鹽水再離心,去除黃色上清液→如此重復(fù)洗滌三次,獲得純凈的紅細胞。2．提示：加入蒸餾水是使紅細胞吸水脹破，甲苯的作用是溶解細胞膜.3．提示：（1）分為4層:第1層為無色透明的有機溶劑（甲苯)，第2層為白色的脂類物質(zhì),第3層為紅色透明的血紅蛋白溶液，第4層為暗紅色的紅細胞破碎物沉淀。（2）分層的液體→過濾除去脂溶性沉淀→分液得下層的血紅蛋白溶液。4．提示：透析袋。透析袋一般是用硝酸纖維素制成的，是一種半透膜，小分子能自由進出,大分子則保留在袋內(nèi)。因此透析的目的是除去小分子雜質(zhì)。5．提示：如果凝膠裝填得不夠緊密、均勻,就會在色譜柱內(nèi)形成無效的空隙，使本該進入凝膠內(nèi)部的樣品分子從這些空隙中通過，攪亂洗脫液的流動次序,影響分離的效果。6．提示：滴加樣品時，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動加樣，不要破壞凝膠面。7．提示:如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整,隨著洗脫液緩慢流出；如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，說明分離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關(guān)。8．提示：血紅蛋白提取和分離的程序包括:樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。首先通過洗滌紅細胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作收集到血紅蛋白溶液,即樣品的處理;再經(jīng)過透析去除相對分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)，即樣品的粗分離；然后通過凝膠色譜法將相對分子質(zhì)量較大的雜質(zhì)蛋白除去,即樣品的純化；最后經(jīng)SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳進行純度鑒定。遷移與應(yīng)用2：D解析：混合液經(jīng)離心后,按密度大小排列,在離心管中從上到下依次是:第1層為無色透明的甲苯層；第2層為白色薄層固體，是脂溶性物質(zhì)的沉淀層;第3層為紅色透明液體,是血紅蛋白的水溶液；第4層為暗紅色沉淀物,主要是紅細胞破碎物沉淀.當(dāng)堂檢測1．分離蛋白質(zhì)不必考慮的因素是（)。A．分子的形狀和大小B．蛋白質(zhì)所帶電荷的性質(zhì)和多少C．蛋白質(zhì)的溶解度D．蛋白質(zhì)肽鍵的結(jié)構(gòu)答案:D解析：所有蛋白質(zhì)的肽鍵結(jié)構(gòu)相同，均為“—NH—CO-”，不作為分離蛋白質(zhì)考慮的因素。2．關(guān)于凝膠色譜法的敘述錯誤的是（）。A．可根據(jù)相對分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)B．凝膠大多數(shù)由多糖類化合物構(gòu)成C．相對分子質(zhì)量大的蛋白質(zhì)優(yōu)先離開色譜柱D．所用的凝膠是一些微小的無孔球體答案:D解析:凝膠色譜法的凝膠是一些微小的多孔球體，允許小分子蛋白質(zhì)進入，不允許大分子蛋白質(zhì)進入，因而增加了小分子蛋白質(zhì)穿過色譜柱的距離，從而使大分子蛋白質(zhì)優(yōu)先離開色譜柱，從而將相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分離。3．在利用凝膠電泳法分離蛋白質(zhì)時，一定要加入緩沖溶液,其作用主要是（）。A．使酶的活性最高B．使蛋白質(zhì)的活性最高C．維持蛋白質(zhì)所帶的電荷D．使蛋白質(zhì)帶上電荷答案：C解析：蛋白質(zhì)具有兩性，在一定pH下，蛋白質(zhì)分子的某些基團會帶上正電荷或負電荷。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動。電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小、形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度,從而實現(xiàn)樣品中各種分子的分離。因此，加緩沖溶液的目的是維持蛋白質(zhì)所帶的電荷不發(fā)生改變而不是使蛋白質(zhì)帶上電荷。4．下列有關(guān)透析的敘述中，錯誤的是（）。A．用于透析的薄膜要具有選擇透過性B．透析膜一般是用硝酸纖維素制成的C．透析能使大分子保留在袋內(nèi),小分子自由進出D．透析可用于更換樣品的緩沖液答案：A解析：透析袋一般是用硝酸纖維素（又稱玻璃紙)制成的，它沒有生物活性，故不具有選擇透過性(活的生物膜才具有選擇透過性）。透析袋能使小分子物質(zhì)自由進出，而將大分子保留在袋內(nèi)。透析可以去除樣品中相對分子質(zhì)量較小的雜質(zhì),或用于更換樣品的緩沖液。5．對在凝膠柱上加入樣品和洗脫的操作不正確的是（）。A．加樣前要使柱內(nèi)凝膠面上的緩沖液下降到與凝膠面平齊B．讓吸管管口沿管壁環(huán)繞移動,貼壁加樣至