《缺血性腦卒中動(dòng)物模型評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范 第2部分：非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物》（編制說(shuō)明）

《缺血性腦卒中動(dòng)物模型評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范第2部分：非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物》編制說(shuō)明一、工作簡(jiǎn)況（一）任務(wù)來(lái)源缺血性腦卒中(cerebralischemicstroke,CIS)，指腦血循環(huán)障礙病因?qū)е履X血管堵塞或嚴(yán)重狹窄，使腦血流灌注下降，進(jìn)而缺血、缺氧導(dǎo)致腦血管供血區(qū)腦組織死亡。流行病學(xué)調(diào)查顯示，CIS是我國(guó)排名第二的致死性疾病，年發(fā)病率約為247/10萬(wàn)人，死亡率約為115/10萬(wàn)人，未來(lái)隨著人口結(jié)構(gòu)的老齡化，我國(guó)CIS的發(fā)病率將持續(xù)升高，高致死和致殘率將給社會(huì)和家庭造成嚴(yán)重負(fù)擔(dān)，因此，近年來(lái)CIS已經(jīng)成為重大慢性非傳染性疾病研究的熱點(diǎn)方向之一。非人靈長(zhǎng)類腦結(jié)構(gòu)與人類高度相似是開(kāi)展腦疾病研究最理想的模式動(dòng)物。非人靈長(zhǎng)類構(gòu)建的缺血性腦卒中動(dòng)物模型在國(guó)內(nèi)外已被廣泛應(yīng)用于CIS發(fā)病機(jī)制研究和藥物評(píng)價(jià)，本標(biāo)準(zhǔn)基于廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所參與國(guó)家重點(diǎn)領(lǐng)域研發(fā)“十三五”項(xiàng)目（急性局灶性腦缺血后全腦保護(hù)評(píng)估體系及轉(zhuǎn)化研究）和主持“十四五”項(xiàng)目（基于非人靈長(zhǎng)類的人類疾病動(dòng)物模型創(chuàng)建及關(guān)鍵技術(shù)研究開(kāi)展缺血性腦卒中動(dòng)物模型制備技術(shù)研究基礎(chǔ)上，結(jié)合模型應(yīng)用的實(shí)踐，本標(biāo)準(zhǔn)將依據(jù)經(jīng)典的非人靈長(zhǎng)類CIS模型制備方法，對(duì)缺血性腦卒中動(dòng)物模型制備技術(shù)進(jìn)行規(guī)范。（二）協(xié)作單位標(biāo)準(zhǔn)牽頭單位為廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所，協(xié)作單位中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院、廣西醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院、深圳市藥品檢驗(yàn)研究院（深圳市醫(yī)療器械檢測(cè)中心）。（三）主要工作過(guò)程1.起草階段并結(jié)合具體臨床應(yīng)用的實(shí)際需求為主要參考依據(jù)，提出制定團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)《缺血性腦卒中動(dòng)物模型制備技術(shù)規(guī)范》的計(jì)劃。本標(biāo)準(zhǔn)由廣東省精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)應(yīng)用學(xué)會(huì)組織，廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所牽頭制定，其它單位參與，于2022年11月提交團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)《缺血性腦卒中動(dòng)物模型評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》的立項(xiàng)申請(qǐng)書(shū)，經(jīng)學(xué)會(huì)秘書(shū)長(zhǎng)審批通過(guò)后，于11月1日正式發(fā)布立項(xiàng)公告，并于同日在全國(guó)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)平臺(tái)發(fā)布立項(xiàng)公示。立項(xiàng)公示后，起草工作組開(kāi)展標(biāo)準(zhǔn)的編制工作并組織多次起草工作組的會(huì)議討論。經(jīng)過(guò)多輪研討和修改，2023年6月在廣東省精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)應(yīng)用學(xué)會(huì)主辦的第三屆華南疾病模型與臨床研究論壇之疾病模型標(biāo)準(zhǔn)撰寫(xiě)與宣講研討會(huì)上，本標(biāo)準(zhǔn)起草工作組就標(biāo)準(zhǔn)初稿內(nèi)容進(jìn)行了匯報(bào)，并同與會(huì)專家進(jìn)行了充分交流。經(jīng)研究，起草工作組形成共識(shí)并提出以下建議：在同一標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目下，優(yōu)先分為《缺血性腦卒中動(dòng)物模型評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范第1部份：嚙非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物》兩個(gè)部分來(lái)進(jìn)行編制，2023年9月，《缺血性腦卒中動(dòng)物模型制備技術(shù)規(guī)范第2部分：非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物》開(kāi)展了立項(xiàng)審查和發(fā)布工作。標(biāo)準(zhǔn)起草工作組于2024年9月完成了編寫(xiě)，上報(bào)學(xué)會(huì)標(biāo)委會(huì)秘書(shū)處，于10月完成了對(duì)本標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容的審核和格式重排，并啟動(dòng)發(fā)布征求意見(jiàn)公示工作。2.征求意見(jiàn)階段2024年11月學(xué)會(huì)標(biāo)委會(huì)秘書(shū)處將標(biāo)準(zhǔn)編制說(shuō)明和征求意見(jiàn)稿通過(guò)全國(guó)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)平臺(tái)發(fā)布公示，面向相關(guān)行業(yè)的單位和個(gè)人征求意見(jiàn)。截至到2023年12月，共收集到？條征求意見(jiàn)，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)起草工作組討論，采納？條，不采納？條。3.審查及報(bào)批階段標(biāo)準(zhǔn)起草工作組將收集到的意見(jiàn)進(jìn)行認(rèn)真分析和處理，對(duì)征求意見(jiàn)稿進(jìn)行最后修改，形成標(biāo)準(zhǔn)送審稿。由學(xué)會(huì)標(biāo)委會(huì)秘書(shū)處組織技術(shù)審查。標(biāo)準(zhǔn)起草工作組根據(jù)審查意見(jiàn)修改整理后，最終形成標(biāo)準(zhǔn)草案報(bào)批稿，報(bào)廣東省精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)學(xué)會(huì)報(bào)批。（四）起草組成員及其工作主要起草人：李舸，關(guān)雅倫，范玉華，劉競(jìng)麗，黃忠強(qiáng)，張健，黨超，葉子明，陳相任，劉堯，李韻峰，金毅，秦超，曾進(jìn)勝，張鈺。主要起草成員皆參與了本標(biāo)準(zhǔn)的研究、討論和不同章節(jié)的編二、標(biāo)準(zhǔn)編制原則和確定標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容（一）標(biāo)準(zhǔn)編制原則標(biāo)準(zhǔn)制定遵守國(guó)家和地方相關(guān)法律、法規(guī)、方針、政策，在廣東省精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)學(xué)會(huì)章程規(guī)定的業(yè)務(wù)范圍內(nèi)，符合精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)相關(guān)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)制定范圍，是學(xué)會(huì)疾病動(dòng)物模型分會(huì)發(fā)展規(guī)劃內(nèi)容。2.公正性原則標(biāo)準(zhǔn)制定遵循開(kāi)放、透明、公平、公正的原則，本著動(dòng)物模型制備需要滿足相似性、重復(fù)性、可依性、適用性和可控性、易行性和經(jīng)濟(jì)性的原則，吸納醫(yī)療機(jī)構(gòu)、檢測(cè)機(jī)構(gòu)、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究機(jī)構(gòu)代表參團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)制定。3.先進(jìn)性原則按照有利于科學(xué)合理利用資源，有利于提高經(jīng)濟(jì)效益、社會(huì)效益、生態(tài)效益的原則，做到技術(shù)上先進(jìn)、經(jīng)濟(jì)上合理，有利于精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)行業(yè)發(fā)展。4.正確性原則標(biāo)準(zhǔn)編寫(xiě)依據(jù)國(guó)家重點(diǎn)領(lǐng)域研發(fā)結(jié)果，編寫(xiě)過(guò)程中，對(duì)技術(shù)方法、評(píng)價(jià)參數(shù)等內(nèi)容進(jìn)行核驗(yàn)，保證其正確性。通過(guò)使用精準(zhǔn)的描寫(xiě)詞匯、緊湊嚴(yán)密的語(yǔ)句結(jié)構(gòu)來(lái)準(zhǔn)確表達(dá)目的，力求讓不同知識(shí)水平不同專業(yè)背景的人充分理解標(biāo)準(zhǔn)所述內(nèi)容。5.簡(jiǎn)明性原則標(biāo)準(zhǔn)編寫(xiě)時(shí)注意標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容簡(jiǎn)潔明了，力求讓標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容通俗易懂，并通過(guò)使用大眾化語(yǔ)言使使用者在參照本標(biāo)準(zhǔn)時(shí)能夠正確理解和執(zhí)行。5.本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了非人靈長(zhǎng)類缺血性腦卒中模型制備的動(dòng)物質(zhì)量和飼養(yǎng)要求、制備方法、評(píng)價(jià)方法和結(jié)果判定。本標(biāo)準(zhǔn)適用于非人靈長(zhǎng)類缺血性模型的制備及應(yīng)用評(píng)價(jià)。（二）標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容本標(biāo)準(zhǔn)由范圍、規(guī)范性引用文件、術(shù)語(yǔ)和定義、動(dòng)物質(zhì)量和飼養(yǎng)要求、動(dòng)物模型制備方法、評(píng)價(jià)方法和結(jié)果判定共7部分組成。主要技術(shù)內(nèi)容如下。本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了非人靈長(zhǎng)類缺血性腦卒中模型制備的動(dòng)物質(zhì)量和飼養(yǎng)要求、制備方法、評(píng)價(jià)方法和結(jié)果判定。本標(biāo)準(zhǔn)適用于非人靈長(zhǎng)類缺血性模型的制備及應(yīng)用評(píng)價(jià)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB14922.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物寄生蟲(chóng)學(xué)等級(jí)及檢測(cè)GB14922.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物學(xué)等級(jí)及監(jiān)測(cè)GB/T14924.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物配合飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB14924.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物配合飼料營(yíng)養(yǎng)成分GB14925實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境及設(shè)施T/CALAS104實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)猴神經(jīng)行為評(píng)價(jià)規(guī)范3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1缺血性腦卒中cerebralischemicstroke是指各種原因?qū)е碌哪X組織血液供應(yīng)障礙，并由此產(chǎn)生的缺血缺氧性壞死，進(jìn)而出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙的一類臨床綜合征。3.2神經(jīng)功能評(píng)價(jià)量表neurologicalfunctionassessmentscale用于評(píng)估動(dòng)物模型神經(jīng)功能缺損程度和恢復(fù)情況的工具，評(píng)價(jià)內(nèi)容包括意識(shí)水平、感覺(jué)系統(tǒng)、運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)和骨骼肌協(xié)調(diào)等。3.3運(yùn)動(dòng)能力評(píng)價(jià)motorfunctionassessment利用不同動(dòng)物運(yùn)動(dòng)評(píng)價(jià)設(shè)備，如步態(tài)分析系統(tǒng)等，觀察動(dòng)物在不同情境下的運(yùn)動(dòng)行為變化，用于測(cè)試和評(píng)價(jià)動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)能3.4延遲記憶評(píng)價(jià)long-termmemoryassessment利用動(dòng)物認(rèn)知測(cè)試設(shè)備，如威斯康辛通用測(cè)試裝置等，觀察動(dòng)物辨別物體能力以及對(duì)刺激信號(hào)的反應(yīng)，用于測(cè)試和評(píng)價(jià)動(dòng)物的工作記憶行為學(xué)變化。3.5核磁共振成像magneticResonanceImaging（MRI）利用原子核在磁場(chǎng)中產(chǎn)生的磁共振信號(hào)來(lái)生成動(dòng)物組織器官內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化的圖像。4動(dòng)物質(zhì)量及飼養(yǎng)要求4.1非人靈長(zhǎng)類質(zhì)量應(yīng)符合GB14922的要求。4.2飼養(yǎng)環(huán)境應(yīng)符合GB14925的要求。4.3飼料應(yīng)符合GB/T14924.2和GB14924.3的要求。5動(dòng)物模型制備方法非人靈長(zhǎng)類缺血性卒中模型制備方法通常包括電凝法、栓塞法和光化學(xué)法等。非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物缺血性腦卒中模型構(gòu)建的常用方法，手術(shù)操作簡(jiǎn)單。通過(guò)電凝器永久性阻斷實(shí)驗(yàn)猴的大腦中動(dòng)脈（MCA），造成腦缺血損傷。具體方法如下：進(jìn)行麻醉、備皮、消毒等準(zhǔn)備工作。2）麻醉。術(shù)前注射麻醉劑進(jìn)行誘導(dǎo)麻醉，術(shù)中采用呼吸麻醉機(jī)進(jìn)行維持麻醉，手術(shù)過(guò)程中保溫。3）手術(shù)。非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物側(cè)放固定在手術(shù)臺(tái)上，頭固定于立體定位儀上。通過(guò)開(kāi)顱手術(shù)暴露大腦中動(dòng)脈（MCA）。使用電凝器對(duì)MCA進(jìn)行電凝處理，阻斷其血流，造成腦缺血損傷。電凝的位置和程度需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行精確控制。動(dòng)物蘇醒后，放入飼養(yǎng)籠中進(jìn)行護(hù)理。4）術(shù)后護(hù)理。術(shù)后動(dòng)物比較虛弱，需注射抗生素3-5天，給予流質(zhì)食物。必要時(shí)注射甘露醇降低顱內(nèi)壓，減少動(dòng)物死亡。術(shù)后6小時(shí)后可通過(guò)MRI掃描確定腦梗死情況。5.2栓塞法非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物缺血再灌注模型構(gòu)建的常用方法。利用X射線成像設(shè)備或DSA的精確成像能力，結(jié)合微導(dǎo)管技術(shù)，將栓塞材料精準(zhǔn)地送入目標(biāo)血管（如大腦中動(dòng)脈從而實(shí)現(xiàn)血管的閉塞。具體方法如下：1）術(shù)前準(zhǔn)備。非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物術(shù)前禁食12小時(shí)，自進(jìn)行麻醉、備皮、消毒等準(zhǔn)備工作。2）麻醉。術(shù)前注射麻醉劑進(jìn)行誘導(dǎo)麻醉，術(shù)中采用呼吸麻醉機(jī)進(jìn)行維持麻醉，手術(shù)過(guò)程中需保溫。3）手術(shù)。非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物仰臥固定在手術(shù)臺(tái)上，通過(guò)X射線成像設(shè)備或DSA對(duì)腦血管進(jìn)行造影檢查，明確大腦中動(dòng)脈的位置、形態(tài)及血流情況。根據(jù)動(dòng)物血管大小選擇合適的導(dǎo)管，在X射線成像設(shè)備或DSA的引導(dǎo)下，將微導(dǎo)管經(jīng)股動(dòng)脈穿刺置入，并引導(dǎo)至大腦中動(dòng)脈的預(yù)定位置。通過(guò)微導(dǎo)管向大腦中動(dòng)脈注入栓塞材料（如自體血栓凝塊、彈簧圈、球囊等），觀察成像圖像以確認(rèn)手術(shù)過(guò)程中去除部分顱瓣降低顱內(nèi)壓，減少動(dòng)物死亡。4）術(shù)后護(hù)理。術(shù)后動(dòng)物比較虛弱，需注射抗生素3-5天，給予流質(zhì)食物。必要時(shí)注射甘露醇降低顱內(nèi)壓，減少動(dòng)物死亡。術(shù)后6小時(shí)后可通過(guò)MRI掃描確定腦梗死情況。5.3光化學(xué)法非人靈長(zhǎng)類缺血性腦卒中模型構(gòu)建的常用方法，創(chuàng)傷面小，可精準(zhǔn)定位。利用光敏劑（如玫瑰紅）在特定強(qiáng)度光照下發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，在大腦的照射局部產(chǎn)生腦水腫和血小板微血栓，進(jìn)而形成局灶性腦梗死。具體方法如下：1）術(shù)前準(zhǔn)備。非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物術(shù)前禁食12小時(shí)，自進(jìn)行麻醉、備皮、消毒等準(zhǔn)備工作。2）麻醉。術(shù)前注射麻醉劑進(jìn)行誘導(dǎo)麻醉，術(shù)中采用呼吸麻醉機(jī)進(jìn)行維持麻醉，手術(shù)過(guò)程中需保溫。3）手術(shù)。選定大腦中動(dòng)脈遠(yuǎn)端或其他需要模擬卒中的腦區(qū)作為照射部位，插入光纖，靜脈注射玫瑰紅（35mg/KG）3分鐘，使用激光（15mW）光源對(duì)選定的部位進(jìn)行連續(xù)照射30分鐘，移去光源，縫合骨膜、皮膚。必要時(shí)注射甘露醇降低顱內(nèi)壓，減少動(dòng)物死亡。術(shù)后6小時(shí)后可通過(guò)MRI掃描確定腦梗死情況。6評(píng)價(jià)方法6.1腦損傷磁共振掃描評(píng)價(jià)6.1.1非人靈長(zhǎng)類腦缺血性卒中模型可分為4期，超急性期（0-6小時(shí)），急性期（6-72小時(shí)），亞急性期（3-10天），慢性期（10天以后）。6.1.2檢測(cè)檢測(cè)腦水腫變化可采用彌散加權(quán)成像（Diffusionweightedimaging，DWI）。T2WI）。6.1.4腦梗死體積測(cè)定采用磁共振掃描獲得T2WI圖像，在每個(gè)腦冠狀切片上圈選出腦梗死灶邊界及對(duì)側(cè)正常半腦邊界，利用ImageJ軟件計(jì)算梗死面積，將所有切面梗死灶面積和對(duì)側(cè)正常半腦面積相加后乘以切片厚度，得到梗死灶體積及對(duì)側(cè)正常半腦體積。腦梗死體積比（%）=（患側(cè)半腦梗死組織體積÷對(duì)側(cè)正常6.2神經(jīng)功能評(píng)價(jià)參照T/CALAS104中6.1和7.1進(jìn)行。6.3運(yùn)動(dòng)功能評(píng)價(jià)6.3.1利用步態(tài)分析設(shè)備評(píng)價(jià)動(dòng)物四肢行走及協(xié)調(diào)能力。實(shí)驗(yàn)應(yīng)在獨(dú)立安靜的環(huán)境中開(kāi)展，測(cè)試前動(dòng)物需禁食。造模前對(duì)動(dòng)物進(jìn)行訓(xùn)練，確保動(dòng)物在勻速運(yùn)動(dòng)的跑步機(jī)上正常行走。造模后動(dòng)物可以正常飲食和運(yùn)動(dòng)后，連續(xù)3天對(duì)動(dòng)物進(jìn)行步態(tài)視頻錄制，錄制時(shí)長(zhǎng)不少于10s。利用運(yùn)動(dòng)軌跡分析軟件，對(duì)錄制視頻中動(dòng)物各個(gè)標(biāo)記關(guān)節(jié)進(jìn)行分析，獲得動(dòng)物行走過(guò)程中的步頻、步幅、步長(zhǎng)、步間隔等數(shù)據(jù)，評(píng)價(jià)動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)功能。6.4延遲記憶評(píng)價(jià)參照T/CALAS104中6.2和7.2進(jìn)行。6.5組織病理診斷動(dòng)物安樂(lè)死后，對(duì)腦組織進(jìn)行灌注固定，分離腦組織，在4%多聚甲醛中進(jìn)行固定保存，經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明后進(jìn)行石蠟包埋制成蠟塊，切成4μm厚度切片，進(jìn)行蘇木素-伊紅或尼氏染色并封片。組織切片應(yīng)包含梗死灶及周邊半暗帶組織，觀察梗死灶和半暗帶組織神經(jīng)元壞死及炎癥細(xì)胞活化情況。7.1磁共振成像病變特征1)超急性期在梗死區(qū)域DWI可顯示明顯的高信號(hào)，病變區(qū)表現(xiàn)為腦回部腫脹、腦溝部變淺、灰白質(zhì)界限不清晰。2)急性期T1WI呈低信號(hào)、T2WI呈高信號(hào)、DWI高信號(hào)，腦室由于受壓會(huì)出現(xiàn)變形、移位，中線結(jié)構(gòu)向?qū)?cè)移位，表現(xiàn)為局部的腦溝和腦裂消失。3)亞急性期表現(xiàn)T1WI低信號(hào)、T2WI高信號(hào)、梗死區(qū)DWI低信號(hào)。增強(qiáng)掃描可出現(xiàn)腦回狀強(qiáng)化，顯影逐漸變淡。4)慢性期病灶逐漸液化，周邊膠質(zhì)增生帶呈高信號(hào)、DWI呈低信號(hào)。梗死區(qū)域局灶性腦萎縮，形成軟化灶，類似于腦脊液的7.2腦梗死體積磁共振成像計(jì)算動(dòng)物腦梗死體積比，評(píng)價(jià)造模后梗死體積大小。7.3神經(jīng)功能神經(jīng)功能評(píng)分由意識(shí)水平（0-28分感覺(jué)系統(tǒng)（0-22分運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)（0-32分），骨骼肌協(xié)調(diào)性（0-18分）組成，總分越高表明神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重。7.4運(yùn)動(dòng)功能7.4.1利用步態(tài)分析設(shè)備進(jìn)行步態(tài)評(píng)價(jià)，連續(xù)3天評(píng)價(jià)的平均數(shù)作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果，造模后的各肢體采集數(shù)據(jù)與造模前相比出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異時(shí)可判定動(dòng)物出現(xiàn)四肢行走及協(xié)調(diào)功能損傷。7.4.2利用山和谷階梯任務(wù)裝置開(kāi)展運(yùn)動(dòng)感知行為評(píng)價(jià)，連續(xù)5天評(píng)價(jià)的平均分?jǐn)?shù)作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果，造模后的分?jǐn)?shù)與造模前相比出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性降低時(shí)可判定動(dòng)物出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)功能損傷。7.5延遲記憶利用威斯康辛通用測(cè)試裝置開(kāi)展延遲記憶評(píng)價(jià)，連續(xù)5天選擇食盒的平均正確率作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果，造模后的正確率與造模前相比出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性降低時(shí)可判定出現(xiàn)記憶功能損傷。7.6組織病理動(dòng)物處死后，病理診斷可見(jiàn)梗死灶內(nèi)大量神經(jīng)細(xì)胞壞死，神經(jīng)元核固縮、胞漿呈嗜酸性，在半暗帶區(qū)可見(jiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度活化，膠質(zhì)細(xì)胞胞體增大和大量聚集以及炎癥細(xì)胞三、主要試驗(yàn)（或驗(yàn)證）的分析、綜述報(bào)告，技術(shù)經(jīng)濟(jì)論證，預(yù)期的經(jīng)濟(jì)效果相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)編制單位在國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃“急性局灶性腦缺血后全腦保護(hù)評(píng)估體系及轉(zhuǎn)化研究”期間，完成從嚙齒類到非人靈長(zhǎng)類的腦缺血模型構(gòu)建，建立影像學(xué)、行為學(xué)的評(píng)價(jià)體系。項(xiàng)目的結(jié)題報(bào)告、相關(guān)的成果可體現(xiàn)的標(biāo)準(zhǔn)模型的可行性。1.MRI掃描出現(xiàn)典型腦梗死病變特征。磁共振結(jié)構(gòu)和功能聯(lián)合掃描是檢測(cè)非人靈長(zhǎng)類腦缺血?jiǎng)討B(tài)變化的重要手段(Soulasetal.2023)，Pubmed檢索顯示該方法在18篇已發(fā)表的有關(guān)非人靈長(zhǎng)類缺血性腦卒中模型論文中被應(yīng)用，且70%的論文是在近10年發(fā)表的。我們使用光化學(xué)法構(gòu)建的腦中動(dòng)脈缺血性卒中模型，超急性期（0-6小時(shí)）動(dòng)物腦病變不顯著，T1WI在梗死灶位置呈現(xiàn)低信號(hào)，T2WI呈現(xiàn)高信號(hào)，在梗死灶及周邊位置呈現(xiàn)低信號(hào)，T2WI則在大范圍內(nèi)呈現(xiàn)高信號(hào)，DWI在梗死灶區(qū)域呈現(xiàn)高信號(hào)；亞急性期（3-10天T1WI在梗死灶位置呈現(xiàn)低信號(hào)，T2WI呈現(xiàn)高信號(hào)，DWI在梗死灶區(qū)域仍保持高信號(hào)。慢性期（10天以后），病灶逐漸液化，T1WI信號(hào)不明顯，T2WI在梗死灶位置呈現(xiàn)高信號(hào)，DWI在梗死灶區(qū)域信號(hào)降低（圖1）。2.腦梗死體積測(cè)定。腦梗死體積主要基于磁共振T2W1圖像掃描進(jìn)行測(cè)定(Westetal.2009)，Pubmed檢索顯示該方法在25篇已發(fā)表的有關(guān)非人靈長(zhǎng)類缺血性腦卒中模型論文中被應(yīng)用。我們使用電凝法構(gòu)建的腦缺血性組中模型，實(shí)驗(yàn)猴左側(cè)半腦出現(xiàn)典型梗死灶（圖2和表1）。造模后1個(gè)月和3個(gè)月腦梗死體積明顯增加。表1開(kāi)顱電凝法構(gòu)建實(shí)驗(yàn)猴腦缺血模型梗死體積測(cè)定神經(jīng)功能評(píng)價(jià)依據(jù)常用的非人靈長(zhǎng)類神經(jīng)功能評(píng)價(jià)量表開(kāi)展(Kitoetal.2001)，Pubmed檢索顯示該方法在38篇已發(fā)表的有關(guān)非人靈長(zhǎng)類缺血性腦卒中模型論文中被應(yīng)用。我們使用電凝法構(gòu)建的腦缺血性卒中模型，造模后1個(gè)月和3個(gè)月進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，造模后實(shí)驗(yàn)猴腦神經(jīng)功能評(píng)分顯著升高（圖3）。圖3電凝法構(gòu)建實(shí)驗(yàn)猴腦缺血模型神經(jīng)功能評(píng)價(jià)4.運(yùn)動(dòng)功能評(píng)價(jià)。步態(tài)分析常用于評(píng)價(jià)非人靈長(zhǎng)類四肢運(yùn)動(dòng)能力和協(xié)調(diào)性(Liangetal.2023)，Pubmed檢索顯示該方法在12篇已發(fā)表的實(shí)驗(yàn)猴疾病模型相關(guān)論文中被應(yīng)用。正常實(shí)驗(yàn)猴步態(tài)分析表明，動(dòng)物四肢的步長(zhǎng)、步幅和步頻無(wú)明顯差異（圖4）。山和谷階梯任務(wù)常用于評(píng)價(jià)非人靈長(zhǎng)類腦缺血后上肢運(yùn)動(dòng)功能(MarshallandRidley2003)，Pubmed檢索顯示該方法在6篇已發(fā)表的實(shí)驗(yàn)猴缺血性腦卒中模型論文中被應(yīng)用。我們使用電凝法構(gòu)建的缺血性腦卒中模型，造模后1個(gè)月和3個(gè)月進(jìn)行運(yùn)動(dòng)功能評(píng)價(jià)，實(shí)驗(yàn)猴右側(cè)上肢無(wú)法完成山和谷階梯任務(wù)，左側(cè)上肢運(yùn)動(dòng)功能無(wú)異常，右側(cè)上肢運(yùn)動(dòng)功能受損（圖5）。圖5電凝法構(gòu)建實(shí)驗(yàn)猴腦缺血模型山和谷階梯任務(wù)評(píng)價(jià)5.延遲記憶評(píng)價(jià)。威斯康辛通用測(cè)試裝置（WGTA）常用于非人靈長(zhǎng)類延遲記憶評(píng)價(jià)研究(TsujimotoandSawaguchi2002)，Pubmed檢索顯示該方法在34篇已發(fā)表的相關(guān)非人靈長(zhǎng)類腦疾病模型論文中被應(yīng)用。我們使用電凝法構(gòu)建實(shí)驗(yàn)猴腦缺血腦卒中模型造模后1個(gè)月和3個(gè)月進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶功能評(píng)價(jià)，造模后實(shí)驗(yàn)猴腦學(xué)習(xí)記憶功能顯著受損（圖6）。圖6電凝法構(gòu)建實(shí)驗(yàn)猴腦缺血模型學(xué)習(xí)記憶功能評(píng)價(jià)6.組織病理診斷。組織病理診斷是評(píng)價(jià)非人靈長(zhǎng)類腦缺血模型組織細(xì)胞變化的經(jīng)典方法(CookandTymianski2012)。我們用光化學(xué)法誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)猴腦缺血性卒中模型，對(duì)梗死灶進(jìn)行磁共振掃描并與腦組織大體解剖定位（圖7A，7B紅色圈為梗死）進(jìn)行組織切片染色，HE染色結(jié)果顯示，在局部腦缺血90天后，梗死灶形成液化性壞死，并被膠質(zhì)細(xì)胞（以星膠細(xì)胞和小膠細(xì)胞為主）包裹（圖7C梗死灶中可見(jiàn)大量壞死的神經(jīng)元（圖7D，紅色箭頭）和活化的膠質(zhì)細(xì)胞（圖7D，綠色箭頭）。圖7光化學(xué)法誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)猴腦缺血模型組織病理四、標(biāo)準(zhǔn)涉及的相關(guān)知識(shí)產(chǎn)權(quán)說(shuō)明1.沒(méi)有違反相關(guān)法律法規(guī)及強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)，目前暫無(wú)相關(guān)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。2.參考的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)管理相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，與制定的團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)不沖突。GB14922實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物、寄生蟲(chóng)學(xué)等級(jí)及檢測(cè)GB/T14924.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物配合飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB14924.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物配合飼料營(yíng)養(yǎng)成分GB14925實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境及設(shè)施T/CALAS104實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)猴神經(jīng)行為評(píng)價(jià)規(guī)范五、采用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的程度與水平的簡(jiǎn)要說(shuō)明目前，缺血性腦卒中造模和模型評(píng)價(jià)方法主要由國(guó)外實(shí)驗(yàn)室建立，我國(guó)在這方面的研究起步較晚，主要沿用國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道的評(píng)價(jià)方法，且國(guó)內(nèi)外尚未針對(duì)相關(guān)評(píng)價(jià)方法建立統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。我們?cè)谇捌谘芯恐校⑷毖阅X卒中臨床前多中心評(píng)價(jià)體系（廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所，中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣西醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，深圳市藥品檢驗(yàn)研究院（深圳市醫(yī)療器械檢測(cè)中心通過(guò)構(gòu)建非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物腦卒中模型，并通過(guò)神經(jīng)功能，梗死體積，學(xué)習(xí)記憶運(yùn)動(dòng)功能等方面進(jìn)行評(píng)價(jià)，建立了多中心評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，并在多個(gè)團(tuán)隊(duì)進(jìn)行測(cè)試，證明該方案漸變可行，完全滿足評(píng)價(jià)要求，具有推廣應(yīng)用價(jià)值。六、重大意見(jiàn)分歧的處理經(jīng)過(guò)和依據(jù)七、其他應(yīng)予說(shuō)明的事項(xiàng)Cook,D.J.&M.Tymianski(2012)Nonhumanprimatemodelsofstrokefortranslationalneuroprotectionresearch.Neurotherapeutics,9,371-9.Kito,G.,A.Nishimura,T.Susumu,R.Nagata,Y.Kuge,C.Yokota&K.Minematsu(2001)Experimentalthromboembolicstrokeincynomolgusmonkey.JNeurosciMethods,105,45-53.Liang,F.,S.Yu,S.Pang,X.Wang,J.Jie,F.Gao,Z.So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