新生兒溶血病實(shí)驗(yàn)室檢查（臨床輸血檢驗(yàn)課件）

臨床輸血檢驗(yàn)技術(shù)

常規(guī)檢查病例分析病例資料：患兒，女，3天【主訴】皮膚黃染3天，伴嗜睡，少動(dòng)【現(xiàn)病史】患兒母親孕1產(chǎn)1，自然分娩，生后24h內(nèi)出現(xiàn)皮膚黃染，且進(jìn)行性加重，伴嗜睡。精神萎靡，少吃，少動(dòng)。院外退黃治療效果不佳，為進(jìn)一步治療，遂來(lái)我院，門(mén)診以“新生兒黃疸”收入我科?！炯易迨贰科淠秆蜑镺型，Rh陽(yáng)性，無(wú)有毒物質(zhì)接觸史，孕期體健，無(wú)高血液、抽搐等病史，其父血型為A型，身體健康。問(wèn)題：1.根據(jù)以上資料，判斷該患兒可能患有什么疾??？2.為了診斷該疾病，還需要做哪些常規(guī)檢查？血常規(guī)檢查紅細(xì)胞、血紅蛋白可正?；蛳陆稻W(wǎng)織紅細(xì)胞常增多白細(xì)胞可增高血小板計(jì)數(shù)可正常血涂片可見(jiàn)有核紅細(xì)胞和球形紅細(xì)胞血液膽紅素測(cè)定

胎兒紅細(xì)胞破壞增多，血紅蛋白釋放增加，血液中膽紅素增高，以未結(jié)合膽紅素升高為主，若溶血病患兒出生后黃疸逐漸加深，膽紅素應(yīng)動(dòng)態(tài)檢測(cè)。羊水膽紅素含量測(cè)定

正常羊水無(wú)色透明，嚴(yán)重溶血時(shí)羊水呈黃色，測(cè)定羊水膽紅素含量有助于胎兒病情及考慮母體終止妊娠時(shí)間。

臨床輸血檢驗(yàn)技術(shù)

新生兒溶血病概述1.掌握新生兒溶血病的定義及發(fā)病原因2.熟悉新生兒溶血病的臨床表現(xiàn)3.了解新生兒溶血病的發(fā)病機(jī)制學(xué)習(xí)要求新生兒溶血病——定義廣義狹義

各種病因使胎兒或新生兒紅細(xì)胞破壞增多的疾病，病因除母嬰血型不合之外、還有紅細(xì)胞葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺陷、遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥、地中海貧血等。

特指母嬰血型不合，母親體內(nèi)產(chǎn)生與胎兒血型抗原不合的血型抗體，這種抗體通過(guò)胎盤(pán)進(jìn)入胎兒體內(nèi)，引起胎兒或新生兒同種免疫性溶血性疾病，常見(jiàn)由ABO和Rh血型系統(tǒng)的血型不合。新生兒溶血病---發(fā)病原因ABO-HDN發(fā)病原因O/A型O型A型

以左圖為例，若母親為O型，孩子為A型，則孩子必定獲得了由父親遺傳來(lái)而母親所缺乏的顯性基因A基因。理論上來(lái)講，O型母親孕育A/B型胎兒、A型母親孕育B/AB型胎兒、B型母親孕育A型胎兒都有可能發(fā)生HDN，但臨床上最多見(jiàn)于O型母親，A/B型胎兒，其他則比較少見(jiàn)。新生兒溶血病---發(fā)病原因Rh-HDN發(fā)病原因RhD陰性RhD陽(yáng)性RhD陽(yáng)性

在Rh血型不合引起的HDN中，多為RhD陰性母親孕育了RhD陽(yáng)性的胎兒。母嬰ABO血型不合對(duì)Rh血型不合的HDN有一定的保護(hù)作用。Rh陽(yáng)性胎兒紅細(xì)胞進(jìn)入Rh陰性母體后，由于同時(shí)存在ABO血型不合，母體內(nèi)ABO抗體可破壞帶有相應(yīng)ABO血型抗原的胎兒紅細(xì)胞，減少胎兒Rh血型抗原對(duì)母體的刺激和相應(yīng)抗體產(chǎn)生，減輕Rh溶血。

Rh血型不合的HDN發(fā)生率少數(shù)民族比漢族人高。新生兒溶血病----發(fā)病機(jī)制

正常妊娠下，母體與胎兒的血液循環(huán)系統(tǒng)獨(dú)立存在，胎兒血細(xì)胞一般不進(jìn)入母體。但在妊娠后期由于胎盤(pán)早剝或產(chǎn)道損傷或胎盤(pán)剝離過(guò)程使胎兒紅細(xì)胞通過(guò)破損子宮絨毛膜進(jìn)入母體，刺激母體產(chǎn)生相應(yīng)抗體。一般情況下，首次妊娠，母體產(chǎn)生的抗體基本為IgM類抗體，不能通過(guò)胎盤(pán)。再次妊娠時(shí)，如果胎兒紅細(xì)胞再次進(jìn)入母體，母體短期內(nèi)產(chǎn)生大量IgG類抗體,可以通過(guò)胎盤(pán),進(jìn)入胎兒血液循環(huán),使胎兒紅細(xì)胞破裂,發(fā)生溶血.血型抗體（IgG和IgM)免疫抗體IgG天然抗體IgM二聚體，分子量小，易透過(guò)胎盤(pán)?！皟蓚€(gè)手”，鹽水中不能出現(xiàn)肉眼凝集。五聚體，分子量大，不能透過(guò)胎盤(pán)?！笆畟€(gè)手”，鹽水中可見(jiàn)肉眼凝集新生兒溶血病----發(fā)病機(jī)制母體中抗體以IgM類為主的:A型/B型母體中抗體以IgG類為主的:O型故90%以上ABO-HDN是母親為O型，胎兒或新生兒血型為A型或B型，且第一胎即可發(fā)生ABO-HDN（自然界廣泛存在A、B血型抗原物質(zhì)）自然界存在A或B型物質(zhì)，如某些植物、寄生蟲(chóng)、傷寒疫苗、破傷風(fēng)及白喉類毒素。ABO-HDN發(fā)病機(jī)制新生兒溶血病----發(fā)病機(jī)制是不是所有O型母親都會(huì)導(dǎo)致新生兒溶血的發(fā)生呢？新生兒溶血病----發(fā)病機(jī)制ABO-HDN發(fā)病影響因素ABO抗原的強(qiáng)弱

ABO抗原在5～6周的胎兒身上已經(jīng)可以檢測(cè)出來(lái)，但直至出生其抗原發(fā)育仍不完全，抗原表達(dá)若，抗原位點(diǎn)少，所以每個(gè)新生兒紅細(xì)胞上只能結(jié)合很少I(mǎi)gG抗A/抗B以及抗AB抗體，可能不會(huì)導(dǎo)致ABO-HDN.新生兒溶血病----發(fā)病機(jī)制ABO-HDN發(fā)病影響因素孕婦體內(nèi)IgG抗A、抗B的濃度

當(dāng)母體內(nèi)存在能夠破壞胎兒紅細(xì)胞的IgG類ABO血型抗體，并不意味著新生兒一定罹患ABO新生兒溶血病，一般認(rèn)為只有當(dāng)該抗體效價(jià)≥64時(shí)才有可能造成新生兒溶血病。新生兒溶血病----發(fā)病機(jī)制ABO-HDN發(fā)病影響因素血型物質(zhì)的含量某些胎兒的體液中含有可溶性A或B物質(zhì)，這種物質(zhì)能中和抗A或抗B的抗體，從而保護(hù)胎兒紅細(xì)胞＋胎兒RBC血型物質(zhì)IgG類抗體新生兒溶血病----發(fā)病機(jī)制ABO-HDN發(fā)病影響因素IgG亞類IgG1和IgG3型抗體的量與溶血嚴(yán)重性有線性關(guān)系。IgG4則關(guān)系不大。新生兒溶血病----發(fā)病機(jī)制ABO-HDN發(fā)病影響因素胎盤(pán)屏障作用

胎盤(pán)上IgG受體數(shù)量和種類、吸收IgG抗體的速度都與新生兒溶血病的嚴(yán)重程度有關(guān)。新生兒溶血病----發(fā)病機(jī)制

RhD血型不合多為RhD陰性母親孕育RhD陽(yáng)性胎兒所致，RhD陰性人體內(nèi)無(wú)天然Rh抗體，初次免疫反應(yīng)抗體基本為IgM類,故一般第一胎不發(fā)病,Rh-HDN發(fā)病機(jī)制如下圖：

Rh-HDN發(fā)病機(jī)制Rh陰性孕婦初次妊娠分娩時(shí)胎兒Rh陽(yáng)性紅細(xì)胞進(jìn)入母體刺激母體產(chǎn)生抗D抗體胎兒娩出后母體內(nèi)存在大量IgG類抗D抗體再次懷Rh陽(yáng)性胎兒，母體IgG抗D抗體進(jìn)入胎盤(pán)，對(duì)胎兒紅細(xì)胞進(jìn)行破壞，造成溶血初次分娩再次懷孕新生兒溶血病----發(fā)病機(jī)制

什么情況下Rh-HDN可發(fā)生第一胎呢？新生兒溶血病----發(fā)病機(jī)制第一胎Rh-HDN發(fā)病因素

外祖母屬于Rh陽(yáng)性血型，孕婦在兒時(shí)受到其母親即胎兒外祖母Rh陽(yáng)性紅細(xì)胞致敏,故Rh陰性血型的孕婦在妊娠第一胎時(shí)就可發(fā)生新生兒溶血。既往輸血史、流產(chǎn)史導(dǎo)致體內(nèi)產(chǎn)生Rh抗體“外祖母學(xué)說(shuō)”新生兒溶血病----發(fā)病機(jī)制Rh-HDN發(fā)病影響因素

母親體內(nèi)IgG的效價(jià)是決定HDN嚴(yán)重程度的關(guān)鍵因素.新生兒溶血病----臨床表現(xiàn)

水腫黃疸溶血肝脾腫大膽紅素腦?。ê它S疸）癥狀取決于母親抗體滴度、胎兒紅細(xì)胞抗原強(qiáng)弱、抗體與紅細(xì)胞結(jié)合程度、胎兒代償性造血能力等因素。新生兒溶血病----臨床表現(xiàn)黃疸ABO/Rh溶血胎兒血中膽紅素↑胎盤(pán)母親肝臟娩出時(shí)黃疸不明顯新生兒處理膽紅素↓新生兒黃疸新生兒溶血病----臨床表現(xiàn)膽紅素腦病新生兒處理膽紅素↓血清UCB過(guò)高膽紅素腦病

血腦屏障

發(fā)熱、嗜睡、吸吮反射減低、痙攣、肌張力低下或增高甚至死亡，存活患兒后期可出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)障礙、治理不全等后遺癥。新生兒溶血病----臨床表現(xiàn)貧血胎兒紅細(xì)胞溶血重胎兒重度貧血Rh-HDN貧血癥狀明顯，出生后萎靡、嗜睡、少吃、少哭，甚至發(fā)生心力衰竭。新生兒溶血病----臨床表現(xiàn)水腫胎兒貧血嚴(yán)重時(shí)低蛋白血癥心力衰竭胎兒全身水腫新生兒溶血病----臨床表現(xiàn)肝脾腫大胎兒貧血嚴(yán)重時(shí)髓外造血↑肝脾腫大臨床特點(diǎn)ABO溶血病Rh溶血病發(fā)生頻率常見(jiàn)不常見(jiàn)發(fā)生的母子血型主要發(fā)生在母O型胎兒A型或B型母缺少任一Rh抗原胎兒卻具有該Rh抗原發(fā)生胎次第一胎可發(fā)?。s半數(shù)）一般發(fā)生在第二胎；第一胎也可發(fā)病下一胎情況不一定大多數(shù)更嚴(yán)重臨床表現(xiàn)較輕較重，嚴(yán)重者甚至死胎黃疸生后第2～3天出現(xiàn)24小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)并迅速加重貧血

輕可有嚴(yán)重貧血或伴心力衰竭肝脾大

很少發(fā)生多有不同程度的肝脾增大晚期貧血很少發(fā)生可發(fā)生，持續(xù)至生后3～6周

臨床輸血檢驗(yàn)技術(shù)

新生兒血清學(xué)“三項(xiàng)試驗(yàn)”1.掌握新生兒血清學(xué)“三項(xiàng)試驗(yàn)”試驗(yàn)原理2.熟悉新生兒溶血“三項(xiàng)試驗(yàn)”操作步驟3.了解新生兒溶血“三項(xiàng)試驗(yàn)”臨床意義學(xué)習(xí)要求直接抗人球蛋白試驗(yàn)

在鹽水介質(zhì)中，不完全抗體可以致敏人紅細(xì)胞，但不能讓紅細(xì)胞凝集。加入抗人球蛋白試劑后，抗人球蛋白分子Fab段能與包被在紅細(xì)胞上球蛋白分子的Fc段結(jié)合，借助其橋梁作用，從而使已被不完全抗體致敏的紅細(xì)胞出現(xiàn)凝集，而未被抗體包被的紅細(xì)胞則不出現(xiàn)凝集。原理【直接檢測(cè)新生兒紅細(xì)胞上是否被不完全抗體所致敏】直接抗人球蛋白試驗(yàn)器材與試劑【器材】試管架、試管、記號(hào)筆、微量加樣器、37℃水浴箱、塑料吸管、離心機(jī)、顯微鏡、玻片、微柱凝膠孵育器、微柱凝膠離心機(jī)【試劑】多特異抗人球蛋白試劑或抗IgG和抗C3d單價(jià)抗球蛋白血清、IgG抗D致敏的2%~5%RhD陽(yáng)性紅細(xì)胞懸液、2%~5%正常人紅細(xì)胞懸液和生理鹽水、Coombs微柱凝膠卡等。直接抗人球蛋白試驗(yàn)操作（試管法）取受檢者紅細(xì)胞用生理鹽水洗滌3次，最后一次洗滌后將上清液棄去，再用濾紙將管口附著的上清液吸盡，配成5%紅細(xì)胞懸液。1取小試管3支，分別標(biāo)明被檢管、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照2被檢管加受檢者5%紅細(xì)胞懸液1滴，陽(yáng)性對(duì)照管加IgG抗D致敏的2%~5%RhD陽(yáng)性紅細(xì)胞懸液，陰性管加2%~5%正常人紅細(xì)胞懸液1滴3在3管中分別加抗多特異性球蛋白試劑1滴，混勻后以1000g離心15s.4配制5%懸紅標(biāo)記試管加樣加抗人球試劑直接抗人球蛋白試驗(yàn)操作（試管法）輕晃試管，先用肉眼觀察有無(wú)凝集，然后在顯微鏡下觀察確認(rèn)。鏡下顯示3個(gè)及其以上紅細(xì)胞堆積在一起，并均勻分布在游離紅細(xì)胞中為陽(yáng)性，無(wú)凝集為陰性。5陽(yáng)性對(duì)照管凝集，陰性對(duì)照管不凝集，受檢紅細(xì)胞凝集者為直接抗人球蛋白試驗(yàn)抗陽(yáng)性，不凝集者為陰性。6陽(yáng)性者應(yīng)繼續(xù)用單特異性抗球蛋白血清檢測(cè)，方法同多特異性抗球蛋白試劑。7結(jié)果觀察結(jié)果判斷單特異性檢測(cè)直接抗人球蛋白試驗(yàn)操作（微柱凝膠法）將受檢者紅細(xì)胞、陽(yáng)性對(duì)照紅細(xì)胞和正常人RhD陽(yáng)性對(duì)照紅細(xì)胞配制0.8%紅細(xì)胞懸液取出Coombs微柱凝膠卡，標(biāo)記檢測(cè)孔、陽(yáng)性孔和陰性孔在三孔中分別加入多特異性球蛋白試劑50ul分別取0.8%待檢者紅細(xì)胞、0.8%陽(yáng)性對(duì)照紅細(xì)胞、0.8%正常人紅細(xì)胞懸液各50ul分別加入檢測(cè)孔、陽(yáng)性孔和陰性孔。將加好的凝膠卡置于微柱凝膠孵育器內(nèi)，37℃孵育15min.將孵育好的凝膠卡置于微柱凝膠離心機(jī)內(nèi)，1000r/min離心10min取出微柱凝膠卡觀察結(jié)果直接抗人球蛋白試驗(yàn)操作（微柱凝膠法）直接抗人球蛋白試驗(yàn)質(zhì)量控制1.要證實(shí)直抗試驗(yàn)陽(yáng)性不是補(bǔ)體體外致敏結(jié)果，用EDTA抗凝標(biāo)本，抗凝后立即試驗(yàn)，以免放置過(guò)久造成假陽(yáng)性結(jié)果。若懷疑冷抗體引起DAT陽(yáng)性，標(biāo)本凝固應(yīng)保持在37℃，直至血清分離出來(lái)。2.每次試驗(yàn)都必須設(shè)立陰性和陽(yáng)性對(duì)照。被污染、全凝集或冷凝集均可出現(xiàn)假陽(yáng)性。3.標(biāo)本若為直抗陽(yáng)性需區(qū)別直抗類型，即用單特異性IgG抗體、C3d抗體重復(fù)上述操作以鑒別致敏在細(xì)胞上免疫分子種類。4.Rh新生兒溶血病的直抗結(jié)果都相對(duì)強(qiáng)，一般≧2+。而ABO新生兒溶血病的直抗呈弱陽(yáng)性甚至陰性。因此新生兒直抗強(qiáng)弱是區(qū)別ABO和Rh-HDN的主要標(biāo)志。血漿游離抗體試驗(yàn)原理

用新生兒血清加上A、B型紅細(xì)胞懸液，做酶法及間接抗人球蛋白試驗(yàn)，并以此試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證新生兒血清中是否存在與其紅細(xì)胞不配合的IgG抗A或抗B，這些來(lái)自于母親的IgG抗體可與新生兒紅細(xì)胞結(jié)合，嬰兒可能受害，引起新生兒溶血病。血漿游離抗體試驗(yàn)操作（試管法）1取靜脈血3~5ml,離心分離血清備用。2取3支試管，分別標(biāo)記Ac、Bc、Oc管。3于每支試管中各加入待檢血清2滴，在相應(yīng)標(biāo)記管中分別加入5%A、B、O型試劑紅細(xì)胞懸液各1滴，混勻，37℃致敏30min4以1000g離心15s，肉眼或顯微鏡觀察凝集結(jié)果并記錄。若某管出現(xiàn)凝集，說(shuō)明該管有相應(yīng)鹽水抗體，不必繼續(xù)操作5若無(wú)凝集，用生理鹽水洗滌3次后，加入多特異抗球蛋白1滴，以3400r/min離心15s，肉眼及顯微鏡下觀察凝集結(jié)果血漿游離抗體試驗(yàn)操作（微柱凝膠法）A取靜脈血3~5ml,離心分離血清備用。B取Coombs凝膠卡一張，用筆在相鄰3孔下面標(biāo)記Ac、Bc、OcC于每孔中加50ul待檢血清，在相應(yīng)標(biāo)記孔加入Ac、Bc、Oc試劑紅細(xì)胞，陰性及陽(yáng)性對(duì)照紅細(xì)胞各50ulD將加樣完畢的Coombs卡放入微柱凝膠卡孵育器內(nèi)，37℃孵育15minE將孵育好的Coombs微柱凝膠卡放入微柱凝膠離心機(jī)內(nèi)1000r/min離心10min,取出Coombs微柱凝膠卡，觀察并記錄結(jié)果。血漿游離抗體試驗(yàn)檢測(cè)意義指示紅細(xì)胞

意義AcBcOc+---+-++-+/-+/-+---

游離的抗-A游離的抗-B游離的抗-A、抗-B或者抗-AB游離的ABO系統(tǒng)以外抗體無(wú)游離抗體血漿游離抗體試驗(yàn)質(zhì)量控制1.微柱凝膠卡式法檢測(cè)血清游離抗體時(shí)應(yīng)根據(jù)說(shuō)明書(shū)配制紅細(xì)胞懸液濃度。2.游離試驗(yàn)陽(yáng)性常發(fā)生在新生兒溶血病早期或病情嚴(yán)重時(shí)，應(yīng)在出生后3-7天內(nèi)進(jìn)行檢查，避免致敏紅細(xì)胞被破壞導(dǎo)致假陰性結(jié)果。但游離試驗(yàn)陰性并不說(shuō)明病情較輕，該試驗(yàn)在新生兒溶血病檢測(cè)中僅起到輔助診斷作用。3.游離抗體陽(yáng)性必須是可以檢測(cè)到能與患兒紅細(xì)胞起反應(yīng)的抗體，不依據(jù)患兒血型則無(wú)法準(zhǔn)確判斷該實(shí)驗(yàn)結(jié)果紅細(xì)胞抗體放散試驗(yàn)放散實(shí)驗(yàn)紅細(xì)胞上的抗原與血清中的抗體在適當(dāng)條件下能發(fā)生凝集或致敏，這種反應(yīng)是可逆的，如果改變某些條件，抗體又可以從結(jié)合的細(xì)胞上放散下來(lái)，再用相應(yīng)紅細(xì)胞鑒定放散液內(nèi)抗體的種類，從而進(jìn)行新生兒溶血病的診斷。常用方法熱放散法冷放散法乙醚放散法紅細(xì)胞抗體放散試驗(yàn)熱放散試驗(yàn)

結(jié)合在紅細(xì)胞上的抗體可以用加熱的方式進(jìn)行分離，然后再進(jìn)行抗體種類鑒定。用生理鹽水洗滌待檢紅細(xì)胞，將離心后形成的壓積紅細(xì)胞放入56℃水浴中振搖一定時(shí)間后，再高速離心后取上清液（放散液）與已知紅細(xì)胞反應(yīng)看是否凝集來(lái)鑒定放散液中抗體種類。熱放散試驗(yàn)1將受檢者紅細(xì)胞用生理鹽水洗滌3次，以3000r/min離心5min,棄去上清液。在壓積紅細(xì)胞中加入等量生理鹽水，混勻。2將試管置于56℃水浴振蕩箱不斷振搖10min，取出試管，立即以900g-1000g離心2min。3分離上清液置于另一試管中即為放散液4取3支潔凈試管，分別標(biāo)明Ac、Bc、Oc管，各管加入放散液2滴，然后按標(biāo)記各管加入相應(yīng)（A、B、O）2%-5%酶處理紅細(xì)胞一滴，混勻，37℃水浴30min5孵育后用生理鹽水洗滌3次，棄上清液，各管加入多特異性抗人球蛋白試劑2滴，以1000g離心15s，肉眼觀察結(jié)果熱放散試驗(yàn)熱放散試驗(yàn)質(zhì)量控制1.56℃溫度要準(zhǔn)確，在加熱時(shí)要不斷振蕩試管，使抗體從紅細(xì)胞上完全分離下來(lái)。溫度過(guò)高，抗原抗體變性；溫度過(guò)低，已被放散下來(lái)的抗體會(huì)重新與紅細(xì)胞結(jié)合，因此在離心時(shí)要使用經(jīng)過(guò)預(yù)熱的離心杯。2.制備得到的放散液應(yīng)立即進(jìn)行鑒定，否則放散液中的抗體容易變性。如果需要保存，應(yīng)在放散液中加入AB型血清或牛血清蛋白。3.最后一次洗滌液中應(yīng)檢查是否有殘存抗體，如果最后一次洗滌液中檢出了殘存抗體，說(shuō)明洗滌不充分，會(huì)影響放散效果。乙醚放散試驗(yàn)

乙醚是種較強(qiáng)的有機(jī)溶劑，與紅細(xì)胞結(jié)合后破壞溶解紅細(xì)胞，使結(jié)合抗體解離下來(lái)，再用標(biāo)準(zhǔn)譜紅細(xì)胞測(cè)定放散液中抗體特異性?？蓹z測(cè)吸附于紅細(xì)胞上的各種IgG抗體乙醚放散試驗(yàn)操作將受檢者紅細(xì)胞用生理鹽水洗滌3次,以3000r/min離心5min,棄上清液。在壓積紅細(xì)胞中加入等體積的生理鹽水和2倍體積的乙醚，用塞子塞緊試管口，充分混勻振搖10minA1000g離心5min，輕輕取出試管，離心后液體分為三層，上層為乙醚層，中間層為紅細(xì)胞層，下層為放散液層B將下層深紅色的放散液移至另一試管中，置于37℃孵育30min，除盡乙醚C取另一支試管，加入放散液2滴，再加標(biāo)準(zhǔn)譜紅細(xì)胞懸液1滴，37℃孵育30min，充分洗滌后，棄上清液，加入多特異抗人球蛋白血清1滴D1000g離心15s，輕輕取出試管，輕彈試管，肉眼觀察凝集和溶血情況，必要時(shí)在顯微鏡下觀察，記錄凝集情況E乙醚放散試驗(yàn)質(zhì)量控制1.操作過(guò)程中應(yīng)注意安全，乙醚為危險(xiǎn)化學(xué)試劑，防止放散液溢出。2.與所有標(biāo)準(zhǔn)譜紅細(xì)胞均發(fā)生凝集可能由于自身抗體所致。因此，用標(biāo)準(zhǔn)譜紅細(xì)胞鑒定放散液中抗體時(shí)應(yīng)同時(shí)做自身對(duì)照試驗(yàn)。冷放散試驗(yàn)

紅細(xì)胞冰凍導(dǎo)致細(xì)胞破碎，膜上結(jié)合抗體解離，用標(biāo)準(zhǔn)譜紅細(xì)胞鑒定放散液中抗體性質(zhì)。冷放散試驗(yàn)操作01將受檢者紅細(xì)胞用生理鹽水洗滌3次，以3000r/min離心5min，棄上清液，保留壓積紅細(xì)胞。03將試管放置平穩(wěn)，置-70℃~-20℃低溫冷凍柜中快速冷凍10min.051000g離心5min,立即將上清液移至另一已標(biāo)記的試管中，即放散液待用02標(biāo)記試管，取0.5ml壓積紅細(xì)胞，加0.15ml生理鹽水，混勻。塞住試管口，轉(zhuǎn)動(dòng)試管，使細(xì)胞懸液在試管內(nèi)壁形成薄層04取出試管，立即用流動(dòng)溫水沖洗試管外壁，使紅細(xì)胞快速融化。06取潔凈試管3支，分別標(biāo)明Ac、Bc、Oc管，各管加入放散液2滴，然后按標(biāo)記各管加入相應(yīng)的2%-5%標(biāo)準(zhǔn)A、B、O紅細(xì)胞懸液1滴，混勻，置37℃水浴箱孵育30min07孵育后用生理鹽水洗滌3次，棄上清液，各管加多特異抗人球蛋白試劑2滴，以1000g離心15s，肉眼觀察結(jié)果冷放散試驗(yàn)質(zhì)量控制1.操作中充分冰凍，獲得更多的放散液2.放散液平均分配在試管中，保證觀察結(jié)果準(zhǔn)確。紅細(xì)胞抗體放散試驗(yàn)方法學(xué)評(píng)價(jià)

ABO血型不合的HDN采用熱放散法，由于Rh血型抗體與紅細(xì)胞結(jié)合能力較強(qiáng)，熱放散效果不佳

Rh血型及其他血型系統(tǒng)HDN通常采用乙醚放散法，乙醚放散試驗(yàn)所用致敏紅細(xì)胞濃度高，所以在“三項(xiàng)試驗(yàn)”中該試驗(yàn)敏感度最高新生兒血清學(xué)“三項(xiàng)試驗(yàn)”臨床應(yīng)用新生兒溶血“三項(xiàng)試驗(yàn)”直接抗人球蛋白試驗(yàn)檢查新生兒紅細(xì)胞是否已被母親不完全抗體致敏游離抗體試驗(yàn)檢測(cè)新生兒血清中是否有游離的IgG血型抗體放散試驗(yàn)檢查新生兒致敏紅細(xì)胞上釋放到放散液的抗體共同輔助診斷HDN并對(duì)制定治療方案提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)新生兒血清學(xué)“三項(xiàng)試驗(yàn)”

臨床輸血檢驗(yàn)技術(shù)

血型的血清學(xué)檢查病例分析病例資料：患兒母親，28歲，平時(shí)體健，孕1產(chǎn)1.患兒，女，孕39周，自然分娩，體重2.8kg，出生后3天全身及鞏膜出現(xiàn)黃染，逐漸加重，延及軀干、四肢及手足心，無(wú)哭聲尖直，無(wú)四肢抽搐。發(fā)病以來(lái)精神欠佳，無(wú)發(fā)熱，已開(kāi)奶，無(wú)吐奶、嗆奶，已排胎便，小便量可，色黃，染尿布。問(wèn)題：1.患兒診斷什么疾??？2.造成這種疾病的原因可能有？3.有哪些實(shí)驗(yàn)室方法可以早期預(yù)防并監(jiān)測(cè)這種疾??？血型鑒定

血型鑒定包括夫妻雙方的ABO血型系統(tǒng)和Rh血型系統(tǒng)，以確定夫妻血型是否配合。有條件允許可做胎兒羊水ABO血型物質(zhì)檢查，可進(jìn)一步排除ABO血型不合的HDN。若母親與胎兒血型相同或不同但是胎兒為O型都可以排除ABO血型不合的溶血，但不能排除其他血型系統(tǒng)的溶血的可能。夫妻ABO、Rh血型相合的判斷如下表血型鑒定妻子血型丈夫配合血型丈夫不配合血型OOA、B、ABAO、AB、ABBO、BA、ABABO、A、B、AB/RhD陽(yáng)性RhD陽(yáng)性、RhD陰性/RhD陰性RhD陰性RhD+母親血清Ig抗體效價(jià)測(cè)定IgG抗A/抗B效價(jià)測(cè)定

當(dāng)母親血清中IgG抗A/抗B效價(jià)≧1：64時(shí)，提示血型不合，胎兒有可能發(fā)生溶血。所以檢測(cè)母親血清中有無(wú)IgG性質(zhì)的抗體并測(cè)定其效價(jià)，即可預(yù)計(jì)ABO-HDN發(fā)生的可能性。為什么要做抗體效價(jià)測(cè)定？母親血清Ig抗體效價(jià)測(cè)定原理

血清以2-巰基乙醇或二硫蘇糖醇處理后，IgM抗體分子裂解為6~7s亞單位。此種亞單位雖然仍有與抗原結(jié)合能力，但已失去與其相應(yīng)紅細(xì)胞凝集作用。IgG抗體分子則不被2-Me或DDT滅活，保持與相應(yīng)紅細(xì)胞致敏的血清學(xué)特性，所以通過(guò)2-Me或DDT處理血清后，可達(dá)到檢測(cè)血清中IgG抗體的目的.母親血清Ig抗體效價(jià)測(cè)定器材母親血清Ig抗體效價(jià)測(cè)定試劑母親血清Ig抗體效價(jià)測(cè)定操作方法抗人球蛋白法微柱凝膠介質(zhì)法基礎(chǔ)延伸母親血清Ig抗體效價(jià)測(cè)定抗人球蛋白法1破壞IgM抗體:取受檢者血清0.2ml，加2-Me或DTT應(yīng)用液0.2ml,混合，使用封口膜將試管口封住，室溫放置30min或水浴10min.2編號(hào)：排列小試管兩排，每排10支編號(hào)，每排從第2管開(kāi)始加生理鹽水0.2ml.3倍比稀釋：第1管加處理后血清0.4ml,取出0.2ml移至第2管內(nèi)，混合，再?gòu)牡?管吸出0.2ml移至第3管內(nèi)，混勻，以此類推，做倍比稀釋至第10管，最后一管混勻后吸出0.2ml丟棄。上述1-10管稀釋濃度分別為：1:2、1:4、···1:1024。4加懸紅：第1排每管各加2%-5%A型紅懸0.2ml,第2排每管各加2%-5%B型紅懸0.2ml,37℃水浴箱溫育30min,觀察有無(wú)凝集。母親血清Ig抗體效價(jià)測(cè)定抗人球蛋白法5678洗滌：若無(wú)凝集，將紅細(xì)胞用PBS洗滌3次，棄去最后一次上清液。每管各加2滴PBS，充分混勻。加抗人球蛋白：每管再加入最適稀釋度的抗人球蛋白試劑1滴，混合。離心：3400r/min離心15s，輕輕搖動(dòng)試管，觀察結(jié)果判斷結(jié)果：用顯微鏡判斷凝集強(qiáng)度，1＋以上紅細(xì)胞凝集為陽(yáng)性，以1＋以上紅細(xì)胞凝集的最高稀釋度倒數(shù)為IgG抗A/抗B效價(jià)母親血清Ig抗體效價(jià)測(cè)定結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：4+：紅細(xì)胞凝集成結(jié)實(shí)大凝塊，背景清晰透明，無(wú)游離紅細(xì)胞。3+：紅細(xì)胞凝集成數(shù)個(gè)凝塊，背景尚清晰，極少游離紅細(xì)胞。2+：紅細(xì)胞凝塊分散成許多中小凝塊，背景稍渾濁，周?chē)梢?jiàn)到游離紅細(xì)胞1+：肉眼可見(jiàn)大顆粒，背景渾濁，鏡下許多凝集，有較多游離紅細(xì)胞—：紅細(xì)胞呈均勻懸液，鏡下未見(jiàn)紅細(xì)胞凝集，紅細(xì)胞分布均勻。母親血清Ig抗體效價(jià)測(cè)定質(zhì)量控制1.稀釋操作時(shí)要準(zhǔn)備，避免稀釋不均，出現(xiàn)“跳管”現(xiàn)象。2.2-Me或DTT應(yīng)用液未用完的放回4℃冰箱保存。3.IgG抗A（B）效價(jià)測(cè)定，第1管的血清已經(jīng)使用等體積的2-Me或DTT應(yīng)用液破壞，故已經(jīng)稀釋一倍，所以起始效價(jià)為2。4.注意操作時(shí)間控制，因?yàn)?-Me破壞IgM是可逆的,一旦2-Me揮發(fā)過(guò)多，則IgM會(huì)重新形成。母親血清Ig抗體效價(jià)測(cè)定微柱凝膠介質(zhì)法破壞IgM抗體:取受檢者血清0.2ml，加2-Me或DTT應(yīng)用液0.2ml,混合，使用封口膜將試管口封住，室溫放置30min或水浴10min.編號(hào)：排列小試管兩排，每排10支編號(hào)，每排從第2管開(kāi)始加生理鹽水0.2ml.倍比稀釋：第1管加處理后血清0.4ml,取出0.2ml移至第2管內(nèi)，混合，再?gòu)牡?管吸出0.2ml移至第3管內(nèi)，混勻，以此類推，做倍比稀釋至第10管，最后一管混勻后吸出0.2ml丟棄。上述1-10管稀釋濃度分別為：1:2、1:4、···1:1024。標(biāo)記微柱凝膠卡：取Coombs微柱凝膠卡,標(biāo)記被檢者的姓名、性別、年齡及編號(hào)，同時(shí)標(biāo)明A1-A10孔和B1-B10孔。1234母親血清Ig抗體效價(jià)測(cè)定微柱凝膠介質(zhì)法加懸紅：在A1-A10和B1-B10孔中加入50ul不同稀釋度血清。然后各孔對(duì)應(yīng)分別加入50ul2%-5%A、B型標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞懸液56孵育：將加好的凝膠卡置于微柱凝膠孵育器內(nèi)，37℃孵育15min.7離心：將孵育好的凝膠卡置于微柱凝膠離心機(jī)內(nèi)，1000r/min離心10分鐘。8觀察結(jié)果：紅細(xì)胞抗原與相應(yīng)抗體在微柱凝膠中形成的特異性抗原抗體復(fù)合物懸浮在凝膠表面或凝膠中為陽(yáng)性：沉于凝膠的尖底部為陰性反應(yīng)，以出現(xiàn)1+陽(yáng)性反應(yīng)的最高稀釋度倒數(shù)為IgG抗A或抗B效價(jià)。母親血清Ig抗體效價(jià)測(cè)定母親血清Ig抗體效價(jià)測(cè)定結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：4+：紅細(xì)胞復(fù)合物（凝集）位于凝膠表面。3+：大部分紅細(xì)胞復(fù)合物位于凝膠表面，少部分位于凝膠中上部2+：大部分紅細(xì)胞復(fù)合物位于凝膠中部，少部分位于凝膠中上部1+：紅細(xì)胞復(fù)合物位于凝膠中下部?！杭t細(xì)胞完全沉積在凝膠管尖底部。母親血清Ig抗體效價(jià)測(cè)定質(zhì)量控制1.微柱凝膠卡必須保存在室溫中，使用前應(yīng)檢查微柱凝膠卡是否膠質(zhì)均勻、膠面整齊、有無(wú)氣泡。2.紅細(xì)胞標(biāo)本避免受細(xì)菌污染，否則易出現(xiàn)假陽(yáng)性。3.在微柱凝膠卡中出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，提示為紅細(xì)胞抗原-抗體反應(yīng)，但也不排除其他原因所致溶血，需作認(rèn)真分析。母親血清Ig抗體效價(jià)測(cè)定方法學(xué)評(píng)價(jià)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)抗人球蛋白法成本低操作繁瑣，不能保存，不利于復(fù)查微柱凝膠介質(zhì)法靈敏度、可靠性較高，結(jié)果直觀準(zhǔn)確，可以長(zhǎng)時(shí)間保存易受干擾，需專用設(shè)備，檢測(cè)成本高金無(wú)足赤人無(wú)完人母親血清Ig抗體效價(jià)測(cè)定Rh血型不規(guī)則抗體及效價(jià)測(cè)定留取標(biāo)本排除IgM不規(guī)則抗體篩查不規(guī)則抗體鑒定抗體效價(jià)測(cè)定可能無(wú)不規(guī)則抗體孕婦3~5ml血清、夫婦雙方抗凝血3-5ml鹽水介質(zhì)法抗人球蛋白法－＋確定特異性是否繼續(xù)做不規(guī)則抗體鑒定依據(jù)篩查時(shí)實(shí)驗(yàn)方法靈敏度母親血清Ig抗體效價(jià)測(cè)定操作步驟紅細(xì)胞懸液配制：篩選紅細(xì)胞、丈夫紅細(xì)胞及母體紅細(xì)胞用生理鹽水洗滌3次，配制5%紅細(xì)胞懸液A在標(biāo)記的所有試管中分別加母親血清1滴。分別加5%篩選紅細(xì)胞懸液、丈夫及母親紅細(xì)胞懸液各1滴B1000g離心15s，觀察結(jié)果。C若有凝集，取母體血清0.2ml,加2-Me或DTT應(yīng)用液0.2ml，混合，使用封口膜將試管口封住，室溫放置30min或孵育10min.處理后血清重復(fù)以上步驟后繼續(xù)進(jìn)行下一步。D若無(wú)凝集，則將試管