《養(yǎng)牛與牛病防控技術(shù)》課件-16. 繁殖新技術(shù)

養(yǎng)牛與牛病防控技術(shù)繁殖新技術(shù)任務(wù)目標(biāo)知識目標(biāo)：能夠準(zhǔn)確識別肉牛品種；掌握常見肉牛品種的經(jīng)濟(jì)類型、外貌特征、生產(chǎn)性能。能力目標(biāo)：能夠結(jié)合生產(chǎn)情況選擇適宜的肉牛品種；評價品種適應(yīng)性。素質(zhì)目標(biāo)：認(rèn)識中國肉牛品種與中國自主知識產(chǎn)權(quán)的重要性，品種是核心競爭力。小結(jié)目前全世界有60多個專門化的肉牛品種，按體型大小和產(chǎn)肉性能，大致可分為下列三大類中、小型早熟品種大型歐洲品種含瘤牛血液的品種5.動物克隆(animalcloning)：利用無性繁殖的方式產(chǎn)生一系列遺傳物質(zhì)完全相同動物的過程。6.胚胎細(xì)胞(embryoniccell)：胚胎卵裂球細(xì)胞或內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞。7.胚胎干細(xì)胞(embryonicstemcell)：從胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或原始生殖腺分離出來的能在體外無限增殖且具有全能性的細(xì)胞。

8.細(xì)胞全能性(celltotipotency)：細(xì)胞所具有的由一種細(xì)胞分化形成生物所有的組織細(xì)胞（包括生殖腺在內(nèi)）的能力。9.細(xì)胞多能性(cellmultipotency)：細(xì)胞所具有的由一種細(xì)胞分化形成兩種或兩種以上細(xì)胞或組織的特性。（二）利用胚胎分割法克隆動物(Cloninganimalbyembryosplitting)1．用胚胎分割法克隆動物基本概念（basicconcept）：就是利用機(jī)械分割的方法將一個胚胎分割為若干等份，使分割的胚胎都能發(fā)育成個體的過程。2、操作程序：

2.基本程序（basicprogram）（1）準(zhǔn)備切割器具(prepareinstrumentortool)：顯微操作儀、體視顯微鏡、倒置顯微鏡、胚胎固定管和分割針（2）處理胚胎(dealwithEmbryo)：將胚胎用鏈霉蛋白酶處理，軟化透明帶。（3）分割胚胎(splittingEmbryo)：用機(jī)械切割法（刀，針）將胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或卵裂球分割為若干部分（4）移植細(xì)胞于透明帶內(nèi)(transferembryoniccellintopellucidzone)：將多個卵裂球細(xì)胞或內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞移植入去胚胎細(xì)胞的透明帶中。

（5）培養(yǎng)胚胎(cultureembryos)：采用受體培養(yǎng)法或體外培養(yǎng)法培養(yǎng)胚胎。受體培養(yǎng)法就是將胚胎放在動物輸卵管或子宮角，利用動物體內(nèi)條件培養(yǎng)胚胎。（6）移植胚胎(transferembryos)：將分割胚胎移植給經(jīng)同期發(fā)情處理的受體動物的子宮角或輸卵內(nèi)。（7）受體動物妊娠和分娩（Thepregnancyofreceptorandparturition）：移植的克隆胚胎在受體動物體內(nèi)發(fā)育，形成克隆動物。

3.胚胎分割法克隆動物研究進(jìn)展（progressonanimalcloningbysplittingembryo）（1）1904年，Spemann將蛙的胚胎進(jìn)行分割，獲得了同胚雙生后代。（2）1930年，Pinus將兔子的單個2-細(xì)胞卵裂球培養(yǎng)成為體積較小的亞囊胚。（3）1970年，Mullen分離小鼠2-細(xì)胞胚胎卵裂球，獲得同卵雙生后代。（4）1978年，Moustafa將小鼠桑椹胚分割，獲得同卵雙生后代（5）80年代，Willadsen對綿羊早期胚胎進(jìn)行分割，獲得四分之一、八分之一分割胚胎后代。（6）1986年，由竇忠英教授完成的我國第一個胚胎分割牛在西北農(nóng)業(yè)大學(xué)誕生（四分胚）。（7）1988年，由張涌教授完成的我國第一個胚胎分割二分胚小鼠在西北農(nóng)業(yè)大學(xué)誕生。目前已有豬、馬、牛、羊、兔、小鼠、人分割胚后代。

4．胚胎分割克隆動物的意義（Thefunctionofcloninganimal）（1）提高胚胎利用率，充分發(fā)揮母畜繁殖潛力（2）獲得遺傳基礎(chǔ)同一的個體，為利用后裔評價種畜育種值提供實(shí)驗(yàn)材料（3）為胚胎性別鑒定提供材料。（4）為轉(zhuǎn)基因胚胎的鑒定提供實(shí)驗(yàn)材料（5）為藥物和飼料營養(yǎng)價值的評定提供實(shí)驗(yàn)材料，消除遺傳因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。5．目前存在的問題（Theproblemofanimalcloningbysplittingembryosatpresent）（1）初生重低（Lowofbirthweight）（2）遺傳一致性（geneticidentical）（3）所獲克隆動物數(shù)量少（afewofcloneanimalbysplittingembryo）

（4）先天性畸形，發(fā)育不良（三）用細(xì)胞核移植克隆動物（cloninganimalbycellnucleartransplantation）1.細(xì)胞核移植是指利用顯微操作技術(shù)將一種動物細(xì)胞移入同種或異種動物的去核成熟卵母細(xì)胞內(nèi)，形成核質(zhì)雜種新細(xì)胞。并通過激活，融合，形成胚胎的過程。2.細(xì)胞核移植的意義（1）大幅度提高良種動物繁殖效率分割或消化早期胚胎進(jìn)行移植，能克隆多個子代個體；（2）為外源基因?qū)爰?xì)胞（或基因敲除）創(chuàng)造條件；研究基因的功能。（3）為進(jìn)一步研究細(xì)胞核質(zhì)關(guān)系奠定基礎(chǔ)；（4）加速動物育種進(jìn)程避免自然條件下選種動物育種周期長和生育效率低的限制。（5）為動物遺傳資源保存提供支撐1）保存細(xì)胞就等于保存?zhèn)€體。2）搶救瀕危動物（6）用于動物生長發(fā)育規(guī)律的研究（7）為動物科學(xué)、人類醫(yī)學(xué)發(fā)展提供同源性實(shí)驗(yàn)材料。

（8）為生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物提供技術(shù)支持，利用轉(zhuǎn)基因動物作生物反應(yīng)器，增加產(chǎn)品數(shù)量，提高產(chǎn)品質(zhì)量，創(chuàng)造新產(chǎn)品，提高畜牧業(yè)的生產(chǎn)效率。3.細(xì)胞核移植克隆動物技術(shù)核質(zhì)融合與激活胚胎細(xì)胞分離妊娠產(chǎn)仔卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)胚胎移植卵母細(xì)胞去核去核卵母細(xì)胞重構(gòu)細(xì)胞胚胎培養(yǎng)細(xì)胞核移植克隆動物胚胎4.細(xì)胞核移植發(fā)展史（1）德國胚胎學(xué)家漢斯.施佩曼博士首先提出細(xì)胞核移植試驗(yàn)；（2）1952年，美國人羅伯特.布里格斯等利用蛙卵建立了細(xì)胞核移植技術(shù)，1955年，將豹蛙囊胚細(xì)胞核移入去核卵母細(xì)胞中，細(xì)胞發(fā)育為蝌蚪，部分成為成體蛙；（3）1977年，美國杰克遜培育出7只單親小鼠；1981年，瑞士卡爾.伊爾門澤等首次進(jìn)行小鼠核移植成功；（4）1997年，英國威爾姆特獲得世界上首例體細(xì)胞克隆羊“Dolly”國內(nèi)：（1）1961年，中科院童第周等首次成功進(jìn)行了魚類不同亞科間核移植；（2）1980年，中國科學(xué)院武漢水生生物所獲得鯽魚核移植幼魚；（3）1989年，中科院童第周等首次獲得核質(zhì)雜交“鯉鯽核魚”；（4）1990年，西北農(nóng)林科技大學(xué)首次獲得體細(xì)胞核移植山羊。目前，我國的核移植研究基本與世界水平接近，許多留學(xué)生以第一作者在Nature、Science、PNAS等頂級雜志已發(fā)表相關(guān)研究論文數(shù)十篇。5．用于細(xì)胞核移植全能性供體細(xì)胞（Thedonortotipotencycellforcellnucleartransplantation）（1）胚胎細(xì)胞(embryoniccell)（2）胚胎干細(xì)胞(embryonicstemcell)（3）內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞(innercellmasscell)（4）原始生殖細(xì)胞(primarygermcell)

6．用于細(xì)胞核移植的非全能性細(xì)胞（1）皮膚上皮細(xì)胞(epitheliacell)（2）成纖維細(xì)胞(fibroblasticcell)（3）顆粒細(xì)胞(cumuluscell)（4）乳腺上皮細(xì)胞(mammaryepitheliacell)（5）神經(jīng)細(xì)胞（nervecell）7．細(xì)胞核移植克隆動物的分類（ThetypeofcloneAnimalbycellnucleartransplantation）（1）體細(xì)胞核移植克隆動物（Cloneanimalbysomaticcellnucleartransplantation）（2）胚胎細(xì)胞核移植克隆動物（Cloneanimalbyembryoniccellnucleartransplantation）（3）胚胎干細(xì)胞核移植克隆動物（Cloneanimalbyembryonicstemcellnucleartransplantation）（4）內(nèi)細(xì)胞團(tuán)核移植克隆動物（Cloneanimalbyinnercellmasscellnuclear

）8.細(xì)胞核移植克隆動物的技術(shù)要點(diǎn)（Thekeymethordofanimalcloningbycellnucleartransplantation）（1）分離和培養(yǎng)供體細(xì)胞（separatingandculturingdonorcell）（2）獲取卵母細(xì)胞（Obtainoocyte）（3）體外培養(yǎng)卵母細(xì)胞（oocyteculturinginvitro）處理供體細(xì)胞(dealwithdonorcell)（4）卵母細(xì)胞去核(removeoocytenuclear)（5）將供體細(xì)胞注射入去核卵母細(xì)胞中

transplantationdonorcellintooocyteremovednuclear（6）融合與激活（syncretizeandactivation）（7）克隆胚胎培養(yǎng)（cloneembryocultureinvitro）（8）胚胎移植(embryostransplantation)（9）生產(chǎn)克隆動物(producecloneanimal)

9.細(xì)胞核移植方法（胚胎細(xì)胞核移植為例）（1）概念：將未著床的早期胚胎分割或消化分散為單個細(xì)胞，并將其注射入去核卵母細(xì)胞，使其與去核（染色體）的卵母細(xì)胞融合，體外發(fā)育成早期胚胎后，移入受體產(chǎn)生后代的技術(shù)，稱為胚胎細(xì)胞核移植。因?yàn)槭菬o性繁殖，又稱克隆。（2）技術(shù)路線

收集卵母細(xì)胞早期胚胎體外培養(yǎng)卵母細(xì)胞體外成熟胚胎分割或離散獲得胚胎細(xì)胞注入卵母細(xì)胞去核核移植胚胎體外培養(yǎng)移植產(chǎn)生核移植后代（3）方法（以牛卵母細(xì)胞核移植為例）

①牛卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)

A.獲取卵母細(xì)胞

采牛、羊卵巢，放入37℃含雙抗生理鹽水中,6h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。用35～37℃的加有雙抗滅菌生理鹽水清洗卵巢3次,用注射器吸卵巢表面直徑為2～5mm卵泡的卵泡液。將抽吸物緩慢注入檢卵杯中,靜置,檢卵。B.篩選卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體將檢出卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體分級。A級：顆粒細(xì)胞層完整且緊密,一般為4～6層,胞質(zhì)均勻；B級：顆粒細(xì)胞層較少,一般為2～4層,胞質(zhì)均勻；C級：顆粒細(xì)胞層不全或?yàn)槁懵?。只選擇A，B級卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體用于成熟培養(yǎng)。C.卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)

牛卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)條件為5%CO2，39℃，飽和濕度。成熟培養(yǎng)前2h制作微滴，上蓋石蠟油后置CO2培養(yǎng)箱中平衡。用培養(yǎng)液對牛卵母細(xì)胞進(jìn)行成熟培養(yǎng)D.卵母細(xì)胞成熟鑒定將培養(yǎng)19～22h的牛卵母細(xì)胞分別用D-hank液清洗3遍,放入含有0.3%透明質(zhì)酸酶的D-hank液內(nèi),培養(yǎng)箱中孵育10min，用150μm的毛細(xì)玻璃管輕輕吹打以除去顆粒細(xì)胞,鏡檢裸卵母細(xì)胞。如果出現(xiàn)第一極體說明卵母細(xì)胞已培養(yǎng)成熟，可以進(jìn)行顯微操作。②供體細(xì)胞準(zhǔn)備采用顯微切割或胰酶消化的方法，將囊胚期前的胚胎分成幾份或成單個胚胎細(xì)胞。③卵母細(xì)胞去核顯微操作，盡可能將卵母細(xì)胞核去掉。去核操作后，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30min，形態(tài)結(jié)構(gòu)完整者用于構(gòu)建克隆胚胎。⑤重構(gòu)胚激活將胚胎細(xì)胞直接注射入去核卵母細(xì)胞后，將其復(fù)合體移入M199中洗三次，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min，待成熟24~26時用化學(xué)方法激活重構(gòu)胚。⑥重構(gòu)胚體外培養(yǎng)將活化的重構(gòu)胚放入培養(yǎng)液中，在38.5℃，5％CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48h后觀察卵裂情況。⑦重構(gòu)胚移植通過非手術(shù)的方法，將發(fā)育到桑椹胚或囊胚的重構(gòu)胚（桑葚胚或囊胚）移入到受體母牛子宮，使妊娠，產(chǎn)犢。（受體母牛處于排卵后第7，8天）。體外重構(gòu)胚發(fā)育情況10.體細(xì)胞核移植（1）概念分離組織成單個細(xì)胞，將單個體細(xì)胞注射入去核卵母細(xì)胞中，并通過激活、融合使其分裂、發(fā)育形成早期胚胎代的技術(shù)，稱為體細(xì)胞核移植。（2）技術(shù)路線

收集卵母細(xì)胞組織卵母細(xì)胞體外成熟消化離散為單個細(xì)胞注射卵母細(xì)胞去核培養(yǎng)細(xì)胞外源基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞

核移植胚胎體外培養(yǎng)移植產(chǎn)生核移植后代（3）方法

卵母細(xì)胞的獲?。和咛ゼ?xì)胞核移植卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng)：同胚胎細(xì)胞核移植供體細(xì)胞的獲?。翰捎妹赶姆椒?，從組織中獲取單個的結(jié)構(gòu)完整的細(xì)胞，作供體細(xì)胞。卵母細(xì)胞去核：同胚胎細(xì)胞核移植細(xì)胞核移植：同胚胎細(xì)胞核移植激活、融合：同胚胎細(xì)胞核移植早期胚胎的培養(yǎng)：同胚胎細(xì)胞核移植胚胎移植：同胚胎細(xì)胞核移植11.動物克隆存在的問題（theproblemofanimalcloningbycellnucleartransplantation）（1）技術(shù)尚不成熟，成功率低目前所得到的克隆動物具有極大的偶然性和隨機(jī)性，技術(shù)尚不成熟。如，共克隆綿羊胚胎277，獲得1個“Dolly”。（2）死亡率和疾病率高由于是無性繁殖，克隆后代一些隱性有害基因更易顯性，壽命、疾病易嚴(yán)重發(fā)生。如，“Dolly”僅活5，且患嚴(yán)重關(guān)節(jié)炎。在操作過程中，可能對細(xì)胞造成潛在的危害。（3）有性繁殖是自然進(jìn)化的結(jié)果，克隆是否本身就是倒退？（4）人的克隆有背于社會學(xué)和倫理學(xué)利用胚胎干細(xì)胞核移植生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物示意圖利用胚胎干細(xì)胞核移植生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物示意圖二、動物胚胎干細(xì)胞與組織干細(xì)胞（一）干細(xì)胞1.概念干細(xì)胞（stemcell,SC)是一類具有無限自我更新能力的細(xì)胞，能夠產(chǎn)生至少一種類型的、高度分化的子代細(xì)胞，能在體外大量擴(kuò)增、凍存而不失其原有特性。2.分類

（1）根據(jù)發(fā)生學(xué)來源分為以下兩大類：

胚胎干細(xì)胞：是從早期胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或原始生殖細(xì)胞經(jīng)體外分化抑制培養(yǎng)篩選分離出來的具有發(fā)育全能性的細(xì)胞。它既可以象其它細(xì)胞一樣在體外培養(yǎng)、增值、冷凍、保存、操作和篩選，又可通過嵌合或核移植參與各種組織的發(fā)育，形成克隆動物。

成體干細(xì)胞：是存在于一種已經(jīng)分化組織中的未分化細(xì)胞，這種細(xì)胞能夠自我更新且能特化形成組成該類型組織的細(xì)胞。目前發(fā)現(xiàn)的成體干細(xì)胞主要有：造血干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、胰腺干細(xì)胞等（2）根據(jù)干細(xì)胞分化的潛能大小分類全能干細(xì)胞：具有自我更新和分化成任何類型細(xì)胞的能力，有形成完整個體的分化潛能，如胚胎干細(xì)胞。多能干細(xì)胞：具有具有自我更新和產(chǎn)生多種類型細(xì)胞的能力，但卻喪失了發(fā)育成完整個體的能力，發(fā)育潛能受到一定的限制。如存在于骨髓的造血干細(xì)胞科分化出至少12種血細(xì)胞。

單能干細(xì)胞：具有自我更新能力，只能向單一方向分化，產(chǎn)生一種類型細(xì)胞。如雞肉中的成纖維細(xì)胞等。（3）還可以根據(jù)干細(xì)胞存在的部位分類：如胚胎干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、成骨干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、皮膚干細(xì)胞、胰腺干細(xì)胞、精原干細(xì)胞3.干細(xì)胞工程（1）定義：體外分離培養(yǎng)干細(xì)胞，并對其進(jìn)行各種操作的工藝體系，其目的是研究其生物學(xué)特性，應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和臨床治療。（2）研究范圍：1）分離、純化、克隆、保存干細(xì)胞，建立干細(xì)胞系；2）研究干細(xì)胞的生物學(xué)特性，如形態(tài)、生長、表達(dá)、分化等特性與規(guī)律；3）借助干細(xì)胞，研究細(xì)胞分化形成組織及發(fā)育生物學(xué)問題；4）干細(xì)胞與轉(zhuǎn)基因；5）臨床應(yīng)用，治療疾病4.干細(xì)胞的應(yīng)用前景（1）作為細(xì)胞治療、組織器官替代治療的種子細(xì)胞；（2）揭示人和動物發(fā)育過程中的發(fā)育機(jī)制及有關(guān)影響因素；（3）利用胚胎干細(xì)胞克隆動物，提高繁殖效率，保存稀有動物遺傳資源，創(chuàng)造新物種；（4）為藥物篩選、藥理研究及新藥開發(fā)建立平臺；（5）建立各種實(shí)驗(yàn)動物模型（6）生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物的有力工具。（7）研究基因功能的有力工具。（二）動物胚胎干細(xì)胞1.概念與特性（1）.胚胎干細(xì)胞(embryonicstemcell)概念：從胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或原始生殖腺分離出來的能在體外無限增殖且具有全能性的細(xì)胞。（2）胚胎干細(xì)胞的特性①.細(xì)胞全能性(celltotipotency)：細(xì)胞所具有的由一種細(xì)胞分化形成生物所有的組織細(xì)胞（包括生殖腺在內(nèi)）的能力。②.具有無限增殖的能力2.胚胎干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)的技術(shù)路線胚胎干細(xì)胞建系的方法很多，主要包括以下幾種：（1）從胚胎的囊胚期內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中直接分離胚胎干細(xì)胞技術(shù)路線：培養(yǎng)胚胎分離出內(nèi)細(xì)胞團(tuán)離散細(xì)胞團(tuán)形成多個細(xì)胞的集落接種在小鼠成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上或也只分化的培養(yǎng)液中---培養(yǎng)，使細(xì)胞生長挑出未分化單克隆細(xì)胞團(tuán)離散單個或多個細(xì)胞再接種培養(yǎng)、擴(kuò)增。從胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離胚胎干細(xì)胞示意圖（2）從原始生殖細(xì)胞分離和培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞技術(shù)路線：消化人胚胎原始生殖脊---分離出原始生殖細(xì)胞接種于小鼠成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層上生長----挑出未分化單克隆細(xì)胞團(tuán)-----離散------再接種擴(kuò)增。（3）利用細(xì)胞核移植胚胎分離胚胎干細(xì)胞：將成體組織細(xì)胞或胚胎細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞注射入去核卵母細(xì)胞-----激活，融合---體外培養(yǎng)形成早期胚胎----體外培養(yǎng)成囊胚----消化內(nèi)細(xì)胞團(tuán)----分離出內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞----接種于成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層培養(yǎng)---胚胎干細(xì)胞集落----挑出未分化單克隆細(xì)胞團(tuán)----離散-----再接種擴(kuò)增。從核移植胚胎中獲取胚胎干細(xì)胞3.動物胚胎干細(xì)胞分離與克隆方法(1)飼養(yǎng)層制備選擇妊娠12-16日齡昆明系小白鼠胎兒制備原代小鼠胎兒成纖維細(xì)胞，

①小鼠胎兒的獲取與處理斷頸處死妊娠母鼠，用75%酒精消毒腹部，用外科手術(shù)器械無菌取出胎兒，置于無鈣鎂PBS中，去除頭、四肢及內(nèi)臟，用無鈣鎂PBS洗滌3～5次，去除血液，再用眼科剪剪碎胎兒組織備用。②小鼠胎兒成纖維細(xì)胞的制備將小鼠胎兒組織置于三角瓶中,加入2-5ml0.25%Trypsin+0.04%EDTA,室溫磁力攪拌器攪拌10-30分鐘,將組織消化為糊狀,加入3-7ml培養(yǎng)液終止消化,用無菌濾紗將細(xì)胞過濾于15ml離心管中,3000rpm離心5分鐘,棄去上清液,加入1-2ml培養(yǎng)液,用移液管輕輕吹打細(xì)胞團(tuán),使細(xì)胞離散.再加入5ml培養(yǎng)液,使細(xì)胞懸浮,1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘.棄上清液,③細(xì)胞計(jì)數(shù)準(zhǔn)確加入適量細(xì)胞培養(yǎng)液,懸浮細(xì)胞,取少量細(xì)胞懸浮液,按常規(guī)法計(jì)數(shù)④接種細(xì)胞:取適量細(xì)胞,接種于含有細(xì)胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中,2-3天換一次細(xì)胞培養(yǎng)液.⑤細(xì)胞培養(yǎng):在37℃,飽和濕度,5%CO2中培養(yǎng).⑥成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層制備將鋪滿皿底的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液移去，加入含1μg/ml絲裂霉素C養(yǎng)液(用DMEM+15%NBS配制)，將培養(yǎng)皿置于37°C，5%CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～4h；移去絲裂霉素C液，用PBS洗滌培養(yǎng)細(xì)胞4～5次，加入4ml0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA消化液消化1～2分鐘，用1ml加樣器吹打細(xì)胞，使細(xì)胞離散，再加入等體積培養(yǎng)液終止消化，制成細(xì)胞懸液；將細(xì)胞懸液置于離心管1000轉(zhuǎn)/分鐘離心4～5分鐘，棄去上清液，加入培養(yǎng)液，將細(xì)胞濃度調(diào)至2～4×105個/ml；在4孔板的每個孔中加入0.6ml細(xì)胞懸液，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；該培養(yǎng)體系用于培養(yǎng)胚胎之前，需更換新鮮培養(yǎng)液。胚胎處理和胚胎培養(yǎng)條件

①采用超數(shù)排卵的方法處理動物,選取發(fā)情靜止期(外陰呈白色)小鼠于晚二十點(diǎn)時腹腔注射PMSG(10IU/只)，48h后腹腔注射HCG(10IU/只)，按1∶1公母比例合籠，次日上午八點(diǎn)以前檢查，若母鼠有陰道栓，確認(rèn)其交配受精，在見栓后84～96h內(nèi)，用常規(guī)方法從子宮沖取胚胎。

②培養(yǎng)液:為DMEM(低糖)+15mL/LNBS+0.1mmol/Lβ-巰基乙醇+0.1μmol/LNa2SeO3+1000IU/mLLIF+10ng/mL胰島素生長因子。③胚胎的培養(yǎng)將小鼠胚胎置于胎兒成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為37℃、5mL/100mLCO2、飽和濕度。牛胚胎培養(yǎng)條件為38℃、5mL/100mLCO2、飽和濕度。若干天后，出現(xiàn)鳥巢狀的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)集落。(3)ICM獲取:ICM初次傳代體外培養(yǎng)ICM細(xì)胞6～7天，細(xì)胞數(shù)量增殖到一定程度后，選擇生長集中、隆起明顯、呈鳥巢狀，形態(tài)上仍保持未分化的ICM集落進(jìn)行傳代。具體程序是，用玻璃針剝離ICM表面覆蓋的滋養(yǎng)層細(xì)胞，再將ICM挑出。用無鈣鎂離子PBS洗滌一次，置于0.25g/100mL胰蛋白酶+0.04g/100mLEDTA消化液中，在37℃條件下處理3～5min，再轉(zhuǎn)入含血清(15mL/100mL)的培養(yǎng)液中，用毛細(xì)管玻璃針撥離，吹打，制備細(xì)胞團(tuán)懸液(每個細(xì)胞團(tuán)含3～10個ICM細(xì)胞)。將ICM細(xì)胞團(tuán)懸液接種于鋪有新制備飼養(yǎng)層(提前12～24小時制備)的4孔板中。在38℃，飽和濕度和5%CO2的條件下培養(yǎng)，每2-3天更換1次培養(yǎng)液。(5)ES細(xì)胞繼代克隆培養(yǎng)3-5天后，當(dāng)飼養(yǎng)層表面出現(xiàn)類ES集落時，棄去培養(yǎng)液，加入無鈣鎂PBS沖洗2～3次。用玻璃針撥離隆起明顯、細(xì)胞排裂緊密的ES樣細(xì)胞集落，使其脫離PMEF飼養(yǎng)層。用吸管將集落轉(zhuǎn)移至消化液中，37℃處理。再將集落移入培養(yǎng)液中，用毛細(xì)管玻璃針撥離集落，制成ES細(xì)胞塊懸液。將ES細(xì)胞接種于新鮮飼養(yǎng)層表面，加入培養(yǎng)液，以后每3～5天傳代1次。4.動物胚胎干細(xì)胞的應(yīng)用（1）生產(chǎn)克隆動物為克隆動物生產(chǎn)提供供體細(xì)胞（2）為醫(yī)學(xué)提供醫(yī)用材料利用胚胎干細(xì)胞，定向誘導(dǎo)分化形成組織，可為器官移植提供材料（3）生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物：培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞，并用外源基因轉(zhuǎn)染胚胎干細(xì)胞，經(jīng)過篩選，可獲取轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，以此為材料，克隆動物，可獲取轉(zhuǎn)基因動物。改良動物，制備生物反應(yīng)器。（4）建立藥物評價模型：細(xì)胞（5）研究細(xì)胞分化、組織形成的基本規(guī)律（6）研究基因的功能：缺失，突變（7）制備動物模型5.動物胚胎干細(xì)胞的鑒定（1）形態(tài)：形成胚胎干細(xì)胞的典型形態(tài)—“鳥巢狀”細(xì)胞團(tuán)；（2）生長特性：能無限克隆性生長；（3）標(biāo)記物：表達(dá)胚胎干細(xì)胞的多種標(biāo)記物，如磷酸堿性酶、端粒酶活性高等；（4）分化特性，包括體內(nèi)、體外分化，具有全能性（5）遺傳學(xué)特性：核型分析6.胚胎干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化與發(fā)育（1）神經(jīng)細(xì)胞（2）造血細(xì)胞（3）肌細(xì)胞（4）血管和內(nèi)皮細(xì)胞（5）胰島細(xì)胞。

（6）骨細(xì)胞

7.胚胎干細(xì)胞研究面臨的困難（1）胚胎干細(xì)胞體外擴(kuò)增易發(fā)生分化胚胎干細(xì)胞無論在體內(nèi)、外均具有自我分化潛能，極易分化為其它細(xì)胞。目前研究添加白血病抑制因子可抑制分化。（2）定向誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為功能性器官目前條件、機(jī)制不清最近的研究表明，只要將干細(xì)胞注射到患病部位，干細(xì)胞能自我分化，發(fā)揮修復(fù)作用。但器官的形成復(fù)雜，利用干細(xì)胞人造器官任重而道遠(yuǎn)；（3）胚胎干細(xì)胞的安全性問題（4）涉及倫理、社會、道德的爭議胚胎的發(fā)育歷程牛胚胎干細(xì)胞源于原始生殖細(xì)胞的胚胎干細(xì)胞源于胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的胚胎干細(xì)胞1.牛桑椹胚2。牛孵化胚3。牛內(nèi)細(xì)胞團(tuán)4。小鼠胚胎干細(xì)胞集落1。猴胚胎干細(xì)胞2。牛胚胎干細(xì)胞3。小鼠胚胎干細(xì)胞胰腺干細(xì)胞集落源于胚胎干細(xì)胞的神經(jīng)樣細(xì)胞源于胚胎干細(xì)胞的網(wǎng)狀組織源于胚胎干細(xì)胞的成骨細(xì)胞四、轉(zhuǎn)基因動物的生產(chǎn)（theproductionoftransgenicanimal）（一）有關(guān)轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)的概念

conceptoftransgenicanimalproduction1.轉(zhuǎn)基因（transgenic）：把分離獲得的目的基因?qū)雽?dǎo)受體細(xì)胞或受精卵中去的過程。2.受體細(xì)胞（receptorcell）：接受目的基因的細(xì)胞。3.目的基因（targeticgene）：目的基因也稱為目標(biāo)基因，是指具有特定功能，需要導(dǎo)入到動物基因組或需要進(jìn)行遺傳操作的基因。4.基因組（genegroup）：是指動物個體或群體所包含的所有類型基因的總和。5.轉(zhuǎn)染（transfection）：將目的基因插入受體細(xì)胞的基因組的特定部位的過程。6.轉(zhuǎn)化（transformation）：目的基因連接于染色體基因組，并進(jìn)行表達(dá)的現(xiàn)象。7.載體（vector）：攜帶目的基因的DNA片段。8.轉(zhuǎn)基因動物（transgenicanimal）：是指對動物基因組進(jìn)行遺傳操作（導(dǎo)入目的基因或改變原有基因結(jié)構(gòu)），并使這種改變的遺傳信息能夠在后代穩(wěn)定遺傳的動物，稱為轉(zhuǎn)基因動物。9.動物生物反應(yīng)器（biologyreactorbyanimalproduction）：能夠從血液、乳汁或其它產(chǎn)品中提取和生產(chǎn)具有很高價值的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因動物。（二）轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)的程序（theprotocalforproductionoftransgenicanimal）1.分離和克隆目的基因（1）人工合成DNA片段：以已知DNA片段為模板合成DNA。（2）人工合成cDNA

提取mRNA，利用反轉(zhuǎn)錄酶以mRNA為模板合成cDNA。（3）由蛋白質(zhì)推測DNA結(jié)構(gòu)，合成目的DNA片段。外源基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)：將轉(zhuǎn)基因細(xì)胞移植到去核卵母細(xì)胞，使其表達(dá)外源基因利用胚胎細(xì)胞嵌合法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物示意圖利用胚胎干細(xì)胞進(jìn)行核移植生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物示意圖2.重組DNA（1）將目的基因用連接酶與載體連接。（2）載體連接有標(biāo)記基因和調(diào)控基因。（3）標(biāo)記基因?qū)δ撤N藥物具有抗藥性（抗土霉素基因、抗新霉素基因），在含有抗生素培養(yǎng)基中生存的細(xì)胞為轉(zhuǎn)基因細(xì)胞（攜帶外源基因），死亡的細(xì)胞為非轉(zhuǎn)染外源基因的細(xì)胞。（4）調(diào)控基因包含有啟動子、轉(zhuǎn)錄子、增強(qiáng)子和操縱子。（5）重組DNA包含有結(jié)構(gòu)基因、調(diào)控基因和標(biāo)記基因。載體能將目的基因、調(diào)控基因和標(biāo)記基因插入基因組的特定位置。3.克隆重組DNA在體外，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增重組DNA，當(dāng)重組DNA濃度達(dá)到一定數(shù)量時，用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞。4.將外源基因?qū)雱游锘蚪M的途徑（1）顯微注射法利用顯微操作儀將重組DNA注射到受精卵原核（雌性原核或雄性原核），卵裂球DNA在復(fù)制過程中，將重組DNA整合到胚胎DNA中。這種導(dǎo)入重組DNA的方法操作繁瑣，基因整合隨機(jī)性強(qiáng)，轉(zhuǎn)基因效率低。（2）精子載體法先將重組DNA用一定方法處理，再將重組DNA與精子共同孵育，使重組DNA進(jìn)入精子內(nèi)，利用受精過程將重組DNA導(dǎo)入到受精卵。優(yōu)點(diǎn)是操作簡單，缺點(diǎn)是整合效率低。（3）反轉(zhuǎn)錄病毒感染法將外源基因插入到反轉(zhuǎn)錄病毒RNA特定部位，利用病毒感染細(xì)胞，將重組DNA攜帶入受體細(xì)胞，并進(jìn)一步整合至細(xì)胞基因組。優(yōu)點(diǎn)是操作簡單，整合效率高，單位點(diǎn)、單拷貝整合。缺點(diǎn)是攜帶外源基因長度不能超過15kb。（4）SV40載體（Vectorofsimianvacuolatingvirus40，SV40，猿猴空泡病毒載體）。（5）乳頭狀瘤病毒載體法（papilloma）（6）腺病毒載體法（adenovirus）（7）胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法（introductionoftargetgenebyEScell）將重組DNA導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞，利用胚胎干細(xì)胞核移植或胚胎嵌合的方法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物。（8）體細(xì)胞介導(dǎo)法（introductionoftargetgenebysomaticcell）將重組DNA導(dǎo)入體細(xì)胞，利用體細(xì)胞核移植的方法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物。5.將外源基因?qū)爰?xì)胞的方法（1）磷酸鈣沉淀法將外源基因與CaCl混合，再加入Hepers-磷酸鹽緩沖液，制備DNA-磷酸鹽沉淀物，將沉淀物移至單層細(xì)胞表面，進(jìn)行培養(yǎng)，使外源基因轉(zhuǎn)移至動物細(xì)胞內(nèi)。（2）DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)基因技術(shù)將二乙胺基葡聚糖（diethylaminoethyl-dextran，DEAE-dextran）與重組DNA混合，加入細(xì)胞表面，外源基因就會進(jìn)入動物細(xì)胞內(nèi)。（3）電脈沖法將DNA與經(jīng)秋水仙素處理的細(xì)胞混合，用高壓脈沖電流刺激細(xì)胞，使細(xì)胞膜瞬間打開，使重組DNA進(jìn)入受體細(xì)胞。（4）脂質(zhì)體載體介導(dǎo)法；利用脂質(zhì)體包埋重組DNA，將其與經(jīng)PGE處理的細(xì)胞共同培養(yǎng)。6.轉(zhuǎn)基因細(xì)胞體外培養(yǎng)（cultureoftransgeniccellinvitro）7.轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的篩選將細(xì)胞在特定培養(yǎng)基中培養(yǎng)，能存活的即為攜帶外源基因的細(xì)胞。對轉(zhuǎn)染外源基因的細(xì)胞進(jìn)行篩選篩選轉(zhuǎn)染外源基因細(xì)胞的程序8.外源基因整合、轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的檢測（1）Southern雜交制備目的DNA探針（以目的DNA為模板，以經(jīng)過標(biāo)記的堿基為原料，利用PCR技術(shù)，擴(kuò)增生產(chǎn)目的DNA探針），從細(xì)胞中提取并純化DNA，擴(kuò)增DNA，酶切DNA，變性、電泳、轉(zhuǎn)移目的DNA片段，用目的DNA探針進(jìn)行雜交，陽性者為目的DNA已整合到基因組中。（2）Northern雜交目的DNA探針與受體細(xì)胞mRNA雜交，呈陽性者，為外源基因已經(jīng)轉(zhuǎn)錄。（3）Western雜交標(biāo)記蛋白質(zhì)與受體細(xì)胞蛋白質(zhì)雜交，呈陽性者，為外源基因已經(jīng)翻譯。（4）免疫法9.轉(zhuǎn)基因胚胎的生產(chǎn)（1）轉(zhuǎn)基因細(xì)胞核移植法（2）胚胎嵌合法10.誘導(dǎo)發(fā)情與胚胎移植11.受體動物妊娠、分娩產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物12.轉(zhuǎn)基因動物品系或品種的建立選種、選配，固定目的基因，使其穩(wěn)定遺傳

（三）轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)研究的意義（Thefunctionoftransgenicanimalproduction）1.研究細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系2.研究基因轉(zhuǎn)錄、基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制3.研究動物細(xì)胞分化以及組織、器官和個體發(fā)育的調(diào)控機(jī)制4.創(chuàng)建人類遺傳疾病的動物模型，為疾病的治療提供實(shí)驗(yàn)材料5.提高家畜生產(chǎn)力（轉(zhuǎn)生長激素基因動物）6.提高家畜產(chǎn)品品質(zhì)（轉(zhuǎn)瘦肉基因，肥胖基因）7.培育抗逆性強(qiáng)的動物品種（病毒衣殼蛋白基因，熱應(yīng)激蛋白基因）8.制備生物反應(yīng)器（乳、血液）9.可供移植用的組織器官（四）存在問題（Theproblemoftransgenicanimalproduction）1.效率低，成本高2.外源基因隨機(jī)整合，異常表達(dá)3.發(fā)病率高（五）發(fā)展趨勢（thetendencyofdevelopmentfortransgenicanimal）1.提高效率，降低成本2.簡化操作3.進(jìn)行基因定位操作與整合研究4.進(jìn)行基因共適應(yīng)性研究5.進(jìn)行相關(guān)應(yīng)用研究正常小鼠與轉(zhuǎn)基因（生長素）小鼠五、性別控制技術(shù)的基本概念(basicconceptofsexcontrol)1.性別控制：通過人為控制的方法，使成年動物繁殖出人們期望得到的雌性動物或雄性動物的方法，稱為性別控制2.性別控制的理論基礎(chǔ)（1）動物的性別主要取決于精子的類型，哺乳動物，y精子與卵子結(jié)合，產(chǎn)生雄性動物，X精子與卵子結(jié)合，產(chǎn)生雌性動物。在家禽，雄性為ZZ型，雌性為ZW型。（2）動物雄性配子與雌性配子理化性質(zhì)不同。密度、帶電量、對環(huán)境需求的差異。（3）y精子性別決定基因含有SRY序列（sexdetermingregionoftheYchomosome，SRY），該序列可編碼性別決定蛋白。（4）雄性動物和雌性動物在性別發(fā)育中所需環(huán)境不同。例如，水溫變化與魚類性別密切相關(guān)。（5）伴性遺傳控制某些性狀的基因與性別決定基因連鎖，或性別決定基因的表達(dá)對某些性狀的表達(dá)產(chǎn)生影響。

3.性別控制技術(shù)的意義（1）及時淘汰或終止不需要性別的動物，提高畜牧業(yè)生產(chǎn)效益。（奶牛，奶山羊、蛋雞雌性后代價值高，雄性價值低，肉牛、肉豬、肉雞雄性生長速度快）（2）轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)在轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)中，雌性動物具有利用價值，雄性動物利用價值小。（3）胚胎移植異性胚胎移植經(jīng)常導(dǎo)致孿生不育。（4）增加所希望的性別動物的比例，有利于提高選種強(qiáng)度。（5）預(yù)測性別，預(yù)防伴性遺傳病的發(fā)生。（二）性別控制的方法（Themeasureofsexcontrol）1．特異性殺滅雄性（Y精子）（1）酸堿度調(diào)節(jié)法酸性環(huán)境有利于x精子存活，堿性環(huán)境有利于y精子存活，調(diào)節(jié)母畜生殖道內(nèi)環(huán)境酸堿度，以殺滅不需要的精子。（2）抗原—抗體法：制備Y精子抗體，輸精時在精液中加有Y精子抗體，可特異性殺滅Y精子。（3）食物調(diào)節(jié)法

2．精子篩選法（1）密度梯度離心法：根據(jù)x精子和Y精子密度的差異，采用梯度離心法將x精子和Y精子分離。（2）電泳法：根據(jù)x精子和Y精子表面攜帶電荷與質(zhì)量的差異，采用電泳法將x精子和Y精子分離。（3）流式細(xì)胞器分離法根據(jù)x精子和Y精子DNA含量的差異，用DNA特異性染料對精子進(jìn)行活體染色，用激光束照射染色后的精子，發(fā)光強(qiáng)的為x精子，發(fā)光弱的為Y精子，感光系統(tǒng)將這種光信號傳遞給計(jì)算機(jī)，計(jì)算機(jī)控制充電器，給發(fā)光強(qiáng)的x精子帶正電荷，發(fā)光弱的Y精子帶負(fù)電荷，當(dāng)帶電荷的精子通過電場時，就可將x精子和Y精子分離。

3．胚胎性別鑒定法（1）核型分析法采取少量胚胎細(xì)胞，用秋水仙素處理，制片，顯微攝影，進(jìn)行核型分析。（2）SRY基因探針檢測法利用SRY-PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）體外擴(kuò)增SRY基因探針。提取胚胎細(xì)胞DNA，以SRY基因的一段堿基為引物，以胚胎細(xì)胞DNA為模板，擴(kuò)增含SRY基因有胚胎細(xì)胞DNA，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Southern雜交，出現(xiàn)陽性者，為雄性胚胎，出現(xiàn)陰性者，為雌性胚。（3）免疫學(xué)法：Y精子中含有雄性特異性組織相容性抗原（malespecificminorHistocompatibilityYantigen，簡稱H-Y抗原）。從雄性動物體內(nèi)提取H-Y抗原）。從雄性動物體內(nèi)提取H-Y抗原，將該抗原接種免疫雌性動物，產(chǎn)生抗H-Y抗原的血清。或利用細(xì)胞融合法制備H-Y抗原單克隆抗體。在培養(yǎng)液中添加H-Y抗原抗體或H-Y抗原的抗血清，發(fā)育停止或死亡的胚胎為雄性胚胎，能夠發(fā)育的為雌性胚胎。（4）熒光免疫法A為H-Y抗原單克隆抗體，B為用熒光標(biāo)記的山羊抗小鼠

求蛋白，C為雄性胚胎細(xì)胞H-Y抗原。將A加入培養(yǎng)液中培養(yǎng)胚胎，形成A-C復(fù)合體，再將B加入胚胎細(xì)胞表面，雄性胚胎可形成B-A-C復(fù)合體，雌性胚胎不可能形成B-A-C復(fù)合體。在熒光顯微鏡下，B-A-C復(fù)合體顯熒光，顯熒光的胚胎為雄性胚胎。六、動物胚胎嵌合技術(shù)（一）有關(guān)概念（Theconceptofchimeraanimal）1.動物嵌合體（chimeraanimal）：由兩種或兩種以上基因型細(xì)胞構(gòu)成的動物。2.分類（1）種內(nèi)嵌合體（2）種間嵌合體（二）嵌合體動物的生產(chǎn)productionofMammalianchimeras1.獲得供體細(xì)胞（1）胚胎卵裂球（Blastomere）（2）胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞（Innercellmass，ICM）（3）胚胎干細(xì)胞（embryonicstemcell，ESC）(4)畸胎瘤細(xì)胞（embryoniccarcinomacell，ECC）2.將多個供體細(xì)胞注射入受體胚胎中或?qū)蓚€胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)聚集在一起，裝于空透明帶中。3.培養(yǎng)胚胎：37℃,5%CO2,飽和濕度，細(xì)胞培養(yǎng)液（DMEM)4.進(jìn)行嵌合體鑒定（1）毛色等外型鑒定；（2）生化指標(biāo)如同功酶鑒定：用報告基因標(biāo)記⑴綠色熒光蛋白基因（GFP）;⑵β-半乳糖苷酶基因(LacZ）;⑶氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(CAT);⑷人生長激素基因(hGH)（3）分子雜交（4）測交試驗(yàn)：40~100%毛色嵌合♂鼠與供胚來源品系♀

5.進(jìn)行胚胎移植（三）意義

ThefunctionofproductionofMammalianchimeras1.生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物2.搶救瀕危稀有動物3.培育新品種4.研究基因結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系5.生產(chǎn)人造組織器官用聚合法生產(chǎn)嵌合體動物示意圖利用三明治法生產(chǎn)嵌合體胚胎示意圖毛色嵌合體β－半乳糖苷酶

標(biāo)記嵌合體動物（beta-galactosidase