《藥物分離與純化技術(shù)》課件-第六章

雙語在線開放課程藥物分離技術(shù)DrugSeparationTechnology化學(xué)工程學(xué)院6.1色譜峰洗脫曲線樣液色譜柱檢測器餾分信號色譜原理--分離過程三種人參皂苷制備色譜圖三種人參皂苷分析色譜圖（1）色譜圖←色譜峰保留時(shí)間（分）基線↓峰高峰寬響應(yīng)值←色譜峰保留時(shí)間（分）基線↓響應(yīng)值A(chǔ)BCDEO保留時(shí)間（分）響應(yīng)值正常峰前延峰拖尾峰不對稱峰對稱峰←色譜峰保留時(shí)間（分）基線↓峰高峰寬響應(yīng)值A(chǔ)BCDEO1）峰位---保留時(shí)間:進(jìn)樣開始到某組分色譜峰頂點(diǎn)的時(shí)間間隔tRDtRAtRBtRCtRE峰高：峰的最高點(diǎn)至基線的垂直距離。峰面積：色譜峰與基線所包圍的面積。cdefh2）峰高、峰面積峰高或峰面積操作條件樣品濃度進(jìn)樣量檢測器靈敏度對于對稱的色譜峰

A=1.065hW1/2對于非對稱的色譜峰

A=1.065h(W0.15+W0.85)/2峰底：峰的起點(diǎn)與終點(diǎn)之間連接的線段距離峰寬：在峰兩側(cè)拐點(diǎn)處所作切線與基線相交兩點(diǎn)之間的距離半（高）峰寬：通過峰高的中點(diǎn)作平行于基線的直線，其與峰兩側(cè)相交兩點(diǎn)之間的距離cdefh1/23）色譜峰的區(qū)域?qū)挾雀咚狗宓奶卣鲗挾萕i=拐點(diǎn)處的色譜峰度W1/2h—半峰寬Wb—峰寬

用來衡量色譜峰區(qū)域?qū)挾鹊膮?shù)，有三種表示方法：（1）標(biāo)準(zhǔn)偏差(

)：即0.607倍峰高處色譜峰寬度的一半或是正態(tài)分布曲線上兩拐點(diǎn)間距離的一半。（2）半峰寬(W１／２h)：色譜峰高一半處的寬度W１／２h

=2.353

（3）峰寬(Wb)：Wb=4

（2）分配系數(shù)比（

）分離因子（也稱為選擇性因子）也可用來衡量兩物質(zhì)的分離程度，用α表示。分配系數(shù)K、容量因子k與分配系數(shù)比α的關(guān)系

分配系數(shù)、容量因子與保留時(shí)間的關(guān)系

分配系數(shù)（或容量因子）越小，組分的遷移速度越快，保留時(shí)間越短，即先流出色譜柱；反之亦然。α=1組分不能分離；α組分分離很好。

分配系數(shù)（或容量因子）的差異是組分分離的前提。色譜分離中的四種典型情況：①分離效果差，選擇性（

）差，柱效低，峰寬②基本分離，選擇性（

）差，柱效高，峰窄③完全分離，選擇性（

）好，柱效低，峰寬④完全分離，選擇性（

）好，柱效高，峰窄（3）分離參數(shù)分離度：相鄰兩個(gè)峰的保留時(shí)間之差與兩峰寬度平均值之比。《中國藥典》2015年版規(guī)定：

作定量分析時(shí)，為了獲得較好

的精密度和準(zhǔn)確度，應(yīng)使R≥1.5。

Ｒ＜１.0兩峰有部分重疊。Ｒ＝１.0兩組分能分開，滿足分析要求。Ｒ≥１.5兩個(gè)組分能完全分開。Ｒ＜１.0Ｒ＝１.0Ｒ≥１.5問題1.兩組分分離的前提條件是什么？2.兩相鄰色譜峰完全分離的判斷依據(jù)是什么？

6.1-2層析分離技術(shù)分類1按色譜流動相分類2按色譜分離規(guī)模分類3按色譜分離原理分類4按色譜展開操作方法分類5按色譜固定相承載形式分類制備規(guī)模(100mg～20g)1.按層析分離規(guī)模分類層析分離的規(guī)模色譜分析規(guī)模(小于10mg)半制備規(guī)模(10～100mg)工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模>20g。氣相色譜氣液色譜氣固色譜液液色譜液固色譜色譜流動相固定相液體固體2.按流動相分類液相色譜

(1)氣相色譜圖1圖2圖3(2)液相色譜圖4圖5圖6液相色譜組成示意圖圖8中壓制備液相色譜儀圖7自動液相層析裝置Waters2695一體式高效液相色譜島津LC-30A積木式高效液相色譜3.按分離原理分類分離原理吸附分配離子交換排阻親和利用不同組分與固定相的高度專屬性親和力進(jìn)行分離的方法親和色譜法利用凝膠的結(jié)構(gòu)特性根據(jù)試樣分子的尺寸進(jìn)行分離的方法凝膠色譜法利用組分在固定液（固定相）中溶解度不同而達(dá)到分離的方法分配色譜法利用組分在吸附劑（固定相）上的吸附能力強(qiáng)弱不同而得以分離的方法吸附色譜法離子交換色譜法利用組分在離子交換劑（固定相）上的親和力大小不同而達(dá)到分離的方法4.按展開操作方法分類展開操作方法

將混合物樣品加在色譜柱的頂端，然后自頂端加入頂替劑（流動相）頂替法（取代法）將混合物樣品加在色譜柱管頂端，然后自頂端連續(xù)不斷加入一種沖洗劑（即流動相）洗脫法（沖洗法）以試樣本身作流動相，將樣品通過色譜儀的流動相供給系統(tǒng)連續(xù)加入到色譜柱。迎頭法（前沿法）ABCDABC

AB

A

試樣（A+B+C+D）混合物，E頂替劑C+EEB+E

EA+EE圖9洗脫法試樣（A+B+C+D）混合物，E洗脫劑圖11迎頭法圖10頂替法試樣（A+B+C+D）混合物ED+EEDCBA已知：試樣各組分與固定相結(jié)合力大小為A<B<C<D圖12色譜分離洗脫過程5.按固定相的承載形式分類紙色譜法色譜過程在固定相構(gòu)成的層析濾紙內(nèi)進(jìn)行的色譜法薄層色譜法色譜過程在固定相構(gòu)成的薄板層內(nèi)進(jìn)行的色譜法柱色譜法將固定相裝于柱管內(nèi)構(gòu)成色譜柱，色譜過程在色譜柱內(nèi)進(jìn)行的色譜法氣相色譜液相色譜分配色譜法吸附色譜法程序升溫高效

固定相承載形式展開操作方法分離原理色譜流動相色譜分離規(guī)模總結(jié)6.2紙層析與薄層層析1紙層析和薄層層析分離過程2操作步驟3薄層層析操作錄像4薄層層析定性與定量5薄層層析特點(diǎn)及應(yīng)用6薄層層析技術(shù)發(fā)展7思考題1.紙層析和薄層層析分離過程紙層析薄層層析紙巾通過毛細(xì)作用吸收液體紙層析操作過程

比移值2.操作步驟薄層制備點(diǎn)樣展開顯色檢測（1）薄層的制備薄層的制備紙層析的選擇與裁剪薄層制備薄板的制備濕法制板加入粘合劑干法制板不加粘合劑和水各種型號硅膠板區(qū)別硅膠G硅膠CMC硅膠GF254硅膠H硅膠HF254煅石膏CMC-Na沒有粘合劑添加煅石膏和熒光劑不添加有粘合劑，添加熒光劑(2)點(diǎn)樣2mm(3)展開紙層析展開薄層層析展開上行展開下行展開二維展開展開方式常見溶劑的極性大?。菏兔眩á耦?，30~60℃）＜正己烷＜石油醚（Ⅱ類，60~90℃）＜環(huán)己烷＜二硫化碳＜四氯化碳＜甲苯＜苯＜二氯乙烷＜二氯甲烷＜氯仿＜乙醚＜乙酸乙酯＜正丁醇＜四氫呋喃＜丙酮＜丙醇＜乙醇＜二甲基甲酰胺（DMF）＜乙腈＜甲醇＜水<吡啶<乙酸展開劑溶劑體系的配制弱極性溶劑體系中等極性的溶劑體系強(qiáng)極性溶劑正己烷和水氯仿和水正丁醇和水乙酸乙酯、乙醇、甲醇乙酸乙酯、乙醇、甲醇黃酮、極性弱的萜類和生物堿等的分離蒽醌、香豆素、極性較大的木脂素和萜類的分離極性很大的生物堿類化合物的分離待測組分的Rf在0.2～0.8之間可使各成分間有較好的分離對所需成分有良好的溶解性混合溶劑最好新鮮配制展開后組分斑點(diǎn)圓且集中沸點(diǎn)適中，黏度較小不與待測組分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)展開劑選擇僅僅考慮溶劑的極性大小排列順序石油醚（Ⅰ類，30~60℃）＜正己烷＜石油醚（Ⅱ類，60~90℃）＜環(huán)己烷＜二硫化碳＜四氯化碳＜甲苯＜苯＜乙醚＜二氯乙烷＜二氯甲烷＜氯仿＜乙酸乙酯＜四氫呋喃＜正丁醇＜丙酮＜吡啶＜正丙醇＜異丙醇＜乙酸＜乙醇＜乙腈＜二甲基甲酰胺（DMF）＜甲醇＜水

(4)顯色、檢測3.薄層層析技術(shù)發(fā)展薄層色譜掃描儀普通硅膠薄層色譜板高效硅膠薄層色譜板粒徑：10-15μm涂層厚度：250μm分離時(shí)間：30-200min粒徑：5-10μm涂層厚度：200μm分離時(shí)間：3-20min6.3吸附分離柱層析介紹固定相承載方式紙層析薄層層析柱層析吸附柱層析離子交換柱層析分配柱層析凝膠過濾柱層析親和柱層析柱層析是按固定相的承載方式分類簡易層析裝置柱層析操作裝置手動層析裝置自動層析系統(tǒng)裝置層析操作裝置圖01吸附柱層析原理式中Cs-------組分在固定相中的濃度；

Cm-----組分在流動相中的濃度柱層析三要素在色譜分離中固定不動、對樣品產(chǎn)生保留的一相固定相混合物中各組分待分離物質(zhì)色譜過程中攜帶待測組分向前移動的物質(zhì)，與固定相處于平衡狀態(tài)、帶動樣品向前移動的另一相流動相吸附解吸加樣洗脫吸附柱層析原理形象化解釋龍舟行進(jìn)快慢物質(zhì)分離先后龍舟水阻力人推力待分離組分固定相吸附力流動相解吸力龍舟比賽層析分離02吸附介質(zhì)吸附介質(zhì)硅膠氧化鋁聚酰胺羥基磷灰石由聚硅酸脫水制得的顆粒狀吸附劑由Al(OH)３脫水制得的顆粒吸附劑由己內(nèi)酰胺聚合而成的白色多孔性非晶形粉末由Ca3(PO4)2和CaCO3按一定比例同時(shí)注入高壓水蒸氣在高溫下反應(yīng)制備而成[Ca5(PO4)3OH]2吸附介質(zhì)具備條件被吸附物質(zhì)的理化性質(zhì)吸附劑本身性質(zhì)吸附介質(zhì)選擇原則吸附介質(zhì)選擇原則可逆吸附粒度均勻不易破碎溶解性能和化學(xué)性能穩(wěn)定較大比表面積吸附介質(zhì)具備條件“相似相溶”原理6.4

離子交換柱色譜離子交換柱色譜操作示意圖21梯度混合器色譜柱（φ1.0×20cm）恒流泵核酸蛋白檢測儀記錄儀部分收集器DEAE-SepharoseFastFlow1、50ml20mmol/LTris-HCl，pH7.3緩沖液2、50ml20mmol/LTris-HCl，（1mol/LNaCl）pH7.3緩沖液胰島素離子交換柱色譜裝置01裝柱均勻平整沒有氣泡垂直安裝當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)為陰離子時(shí)，在pH5.5-9.0的范圍內(nèi)，可選擇DEAE纖維素當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)為陽離子時(shí)，在pH3.5-4.5的范圍內(nèi)，可選擇CM纖維素蛋白質(zhì)骨架選擇12346789105pH+-蛋白質(zhì)凈電荷等電點(diǎn)吸附陰離子交換樹脂吸附陽離子交換劑pH<pI（+）pH=pI（0）pH>pI（-）穩(wěn)定范圍平衡緩沖液的用量----至少2BV平衡緩沖液的流速----略高平衡終點(diǎn)以流出液的pH值與緩沖液一致為準(zhǔn)02色譜柱平衡pH<pI正電荷pH=pI凈電荷為零pH>pI負(fù)電荷陽離子交換樹脂：選擇小于pI值的pH緩沖液平衡陰離子交換樹脂：選擇大于pI值的pH緩沖液平衡進(jìn)樣量--------介質(zhì)交換容量的10-20%；樣品濃度-------不宜太高交換容量：離子交換樹脂中全部可交換的離子或功能基團(tuán)的總數(shù)03樣品進(jìn)柱（上樣）固定相----離子交換樹脂平衡離子---可交換離子HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH恒定洗脫階段洗脫梯度洗脫102030405060708090溶液濃度（離子強(qiáng)度）或pH值04樣品洗脫溶液濃度（離子強(qiáng)度）或pH值溶液濃度（離子強(qiáng)度）或pH值梯度洗脫21梯度混合器色譜柱（φ1.0×20cm）恒流泵檢測器記錄儀部分收集器pH值離等電點(diǎn)越遠(yuǎn)，所帶凈電荷越大蛋白質(zhì)洗脫順序的判斷陽離子樹脂分離該蛋白質(zhì)，可采用pH值梯度不斷增大的方法將各蛋白質(zhì)洗脫下來陰離子樹脂分離該蛋白質(zhì)，可采用pH值梯度不斷減小的方法將各蛋白質(zhì)洗脫下來12346789105pH+-蛋白質(zhì)凈電荷等電點(diǎn)吸附陰離子交換樹脂吸附陽離子交換劑pH<pI（+）pH=pI（0）pH>pI（-）穩(wěn)定范圍1.有一蛋白質(zhì)混合物，分子量相近，等電點(diǎn)分別為：A=9.7；B＝6.8；C＝4.5；

D＝8.5；E＝7.0。選擇用CMC-纖維素離子交換柱分離純化，用pH=3緩沖溶液中平衡柱子。如果用逐步增加洗脫液pH值的方法來進(jìn)行梯度洗脫，則各蛋白質(zhì)的洗脫順序?yàn)椋ǎ?/p>

C.A>D>E>B>C

B.C>B>E>D>AA.A>B>C>D>E

D.A>D>B>E>CB05思考題6.5凝膠過濾柱層析介紹01凝膠層析概念02凝膠層析原理

Vt：柱床“總?cè)莘e”；Vo：即存在于柱床內(nèi)凝膠顆粒外面空隙

之間的水相容積；Vi：即凝膠顆粒內(nèi)部所含水相的容積；Vg：凝膠本身的容積；Vt＝Vo十Vi十Vg或Vt-Vo=Vi十Vg03凝膠體積

三種不同分子量物質(zhì)的混合樣品用某種規(guī)格的凝膠柱進(jìn)行分離。樣品加入，以水或其他溶液進(jìn)行洗脫，即得洗脫曲線。04凝膠分離過程

（1）最先流出物質(zhì)Ⅰ，Ⅰ分子量最大，完全不能進(jìn)入顆粒內(nèi)部，只能從顆粒間隙流過，“全排阻”。其洗脫體積最小，等于外水體積V0。

（2）最后流出物質(zhì)Ⅲ，它分子量最小，其分子可以自由進(jìn)入凝膠顆粒，“全滲入”。洗脫體積是外水體積與內(nèi)水體積之和V0+Vi（3）物質(zhì)Ⅱ分子量介于滲入限與排阻限之間，其分子能夠部分地進(jìn)入凝膠顆粒中?！安糠峙抛琛被颉安糠譂B入”。洗脫體積Ve=V0+KdVi五、

05凝膠分配系數(shù)當(dāng)Kd=1時(shí)，洗脫體積Ve=V0+Vi，為全滲入。當(dāng)Kd=0時(shí)，洗脫體積Ve=V0，為全排阻。當(dāng)0<Kd<1時(shí)，洗脫體積Ve=V0+KdVi，為部分滲入。06凝膠過濾柱層析過程1.脫鹽07凝膠層析的應(yīng)用2.去熱源3.濃縮蛋白質(zhì)通過凝膠柱的速度即洗脫體積與其分子量有關(guān):LogM=k1-k2Ve（Ve為洗脫體積）先測得幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的Ve，并以其分子量對數(shù)對Ve作圖得一直線，再測出待測樣品的Ve，查標(biāo)準(zhǔn)曲線即可確定分子量。LogMABCLogM測Ve測4.測定分子量

葡聚糖凝膠及離子交換樹脂柱層析純化制備單組分胰島素工藝流程：結(jié)晶胰島素粗品—→水溶解—→Sephadex-G50純化—→QAE-SephadexA-25純化—→收集液濃縮—→透析脫鹽—→冷凍干燥—→結(jié)晶—→單組分胰島素5.純化Sephadex-G50純化胰島素，除去胰島素中前胰島素和其它大分子抗原物質(zhì)。胰島素凝膠柱層析裝置2.在凝膠層析柱中分離某有效成分時(shí)，洗脫體積為140ml,其外水體積和

總體積分別為60和200ml，求分配系數(shù)是多少？（凝膠體積忽略）08思考題

1.在凝膠過濾（分級范圍是5000~400000）中，下列哪種蛋白質(zhì)最先

被洗脫下來（）A．細(xì)胞色素C（13370）

B．肌球蛋白（400000）C．過氧化氫酶（247500）

D．血清清蛋白（68500）B

6.6親和柱層析親和層析：利用共價(jià)連接有特異配體的層析介質(zhì)，分離蛋白質(zhì)混合物中能特異結(jié)合配體的目的蛋白質(zhì)或其他分子的層析技術(shù)。01親和層析概述1.親和層析概念加樣用平衡液清洗用與配體親和力更強(qiáng)的配基洗靶蛋白不能與配體結(jié)合的雜蛋白配體帶有配體的凝膠球混合樣品繼續(xù)清洗2.生物大分子的識別功能酶：底物、抑制劑底物類似物抗體：抗原、病毒細(xì)胞激素：受體外源凝集素：糖蛋白表面受體蛋白核酸：互補(bǔ)堿基鏈段組蛋白蛋白質(zhì)的結(jié)合部位及各種結(jié)合力應(yīng)用分離純化酶、抗原、抗體.分離純化核酸.研究酶的結(jié)構(gòu)與功能.+待純化分子配體（基）理論依據(jù)：待純化分子和配體間具有親和性+基質(zhì)（載體）b.活性基質(zhì)與配體結(jié)合產(chǎn)生親和吸附劑++雜質(zhì)c.待純化分子與親和吸附劑結(jié)合，與雜質(zhì)分離+d.偶聯(lián)復(fù)合物經(jīng)解離后，得到純的待純化分子sephadex、sepharose、聚丙烯酰胺凝膠、纖維素基質(zhì)（載體）02親和層析原理（1）待分離物質(zhì)與配體專一性結(jié)合，分辨率高，操作簡單，通過一次性操作即可得到較高純度的分離物質(zhì)。（2）具有濃縮作用，可以從含量很低的溶液中得到高濃度的樣品，有的純化倍數(shù)達(dá)幾千倍。（3）利用生物學(xué)的特異性進(jìn)行分離，所以分離條件比較溫和，能夠很好地保持樣品原有的生物學(xué)性質(zhì)03親和層析特點(diǎn)04親和介質(zhì)的結(jié)構(gòu)①有機(jī)小分子類主要有苯基類、烷基類、氨基酸類、核苷酸類等。②生物大分子類主要有酶類、抑制劑類、蛋白質(zhì)、抗原抗體類等。③染料類主要有藍(lán)色葡聚糖、熒光染料等親和層析介質(zhì)的配體有很多，歸納起來主要有以下幾類：1.配體纖維素(cellulose)葡聚糖凝膠(sephadex)聚丙烯酰胺凝膠(Bio-Gel)多孔玻璃(Bio-Glass)瓊脂糖凝膠(sepharose)聚丙烯酰胺-瓊脂糖凝膠(Ultro-gel)2.載體（基質(zhì)）常用的幾種活化劑：溴化氰(CNBr)環(huán)氧氯丙烷1，4-丁二醚戊二醛、高碘酸鹽等。3.載體的活化1.配體的選擇2.載體（基質(zhì)）的選擇3.活化劑與偶聯(lián)反應(yīng)4.封閉5.親和介質(zhì)的技術(shù)指標(biāo)05親和介質(zhì)的制備配體必備條件：①能與活化劑的活化基團(tuán)發(fā)生偶聯(lián)作用，偶聯(lián)后不影響配體和目標(biāo)分子的專一結(jié)合特性。②專一親和性要強(qiáng)，能有效地分離目標(biāo)分子。③配體與目標(biāo)分子結(jié)合后，在一定條件下能夠被解吸附，且不破壞目標(biāo)分子的生物活性。④在分離過程中配體與目標(biāo)分子無空間阻礙。1.配體的選擇酶----底物、底物類似物、抑制劑、輔因子（輔酶、金屬離子等）抗體----抗原、病毒、細(xì)胞激素、維生素----受體蛋白、載體蛋白外源凝集素----多糖化合物、糖蛋白、細(xì)胞表面受體蛋白、細(xì)胞核酸----互補(bǔ)堿基鏈段、組蛋白、核酸聚合物、核酸結(jié)合蛋白常用的配體理想載體的特性：

①不溶于水，但具有高度親水性。②具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和良好的流動性和滲透性。③機(jī)械性能良好，在一定靜水壓下不變形。④有足夠數(shù)量的化學(xué)基團(tuán)與大量的配基相偶聯(lián)。⑤化學(xué)惰性，無或微弱的非特異性吸附作用。⑥有良好的物理和化學(xué)的穩(wěn)定性。2、載體（基質(zhì)）的選擇纖維素葡聚糖凝膠

聚丙烯酰胺凝膠

多孔玻璃瓊脂糖凝膠交聯(lián)瓊脂糖凝膠聚丙烯酰胺-瓊脂糖凝膠常用的載體①凝膠介質(zhì)上的羥基容易被多種活化劑活化，引入不同的基團(tuán)。②具有大孔性和親水性，凝膠內(nèi)部的羥基得到活化，有較高的活化效率。③剛性較好，珠狀結(jié)構(gòu)對流動向的阻力最小，分離效率高。④非特異吸附極低，理化性質(zhì)較穩(wěn)定。3.凝膠類載體的特點(diǎn)（1）在較廣的pH范圍內(nèi)正常工作（2）對去污劑、解離試劑保持穩(wěn)定（3）用0.1mol／LNaOH或0.1mol／LHCl處理2～3h不引起凝膠顆粒的變化。（4）不被乙醇、丙酮等有機(jī)試劑所破壞。（5）能耐受6mol／L鹽酸胍或7mol／L尿素處理（6）吸附劑能夠再生并重復(fù)使用。凝膠類載體理化性質(zhì)穩(wěn)定性的要求（1）以生物大分子為配體的偶聯(lián)反應(yīng)（2）活化載體（基質(zhì)）“接臂”

4.活化劑的選擇與偶聯(lián)反應(yīng)（1）以生物大分子為配基的偶聯(lián)反應(yīng)①溴化氰活化載體與蛋白質(zhì)配基偶聯(lián)反應(yīng)②環(huán)氧氯丙烷活化載體與蛋白質(zhì)配基偶聯(lián)反應(yīng)（2）活化載體“接臂”②長臂(接臂)親和介質(zhì)①短臂(未接臂)親和介質(zhì)5.封閉加入過量的小分子伯氨基試劑封閉多余的活化基團(tuán)封閉的試劑有乙醇胺、葡萄糖胺、甘氨酸、谷氨酸、甘露糖等。在弱堿性pH下過夜或在Tris—HCl緩沖液(pH8)中2h被水解。1、親和層析操作流程親和層析介質(zhì)

預(yù)處理裝柱、平衡與上樣品洗去未吸附雜質(zhì)

洗脫收集洗脫峰

06親和層析