世界衛(wèi)生組織人類精液及精子-宮頸粘液相互作用實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)手冊(cè)第五版

本手冊(cè)的出版由UNDP/UNFPA/WHO/世界銀行人類生殖研究、發(fā)展和研究(UniversityofCalifornia,Davis,CA,USA)提供形態(tài)學(xué)顯微照片以及對(duì)媒體文件的精子細(xì)胞；DrGaryNClarke(TheRoyalWomen′sHospital,Carlton,Australia),DrRoelofMenkveld(TygerbergAcademicHospitalandUniversityofStellenbosch,這個(gè)版本的手冊(cè)是為紀(jì)念已故前WHO男性生育調(diào)控方法學(xué)工作組負(fù)責(zé)人AIartificialinsemination人工授精AIDartificialinseminationwithdonorsemen供精人工AIHartificialinseminationwithhusband’ssemen夫精人ALHamplitudeoflateralheaddisplacement頭側(cè)擺振幅ANOVAanalysisofvariance變量分析APAAPalkalinephosphatase:anti-alkalinephosphatasecomplex堿性磷酸酶:抗ARacrosome-reacted頂體反應(yīng)ARTassistedreproductivetechnology輔助生殖ASAanti-spermantibody抗精子BCFbeat-crossfrequency(Hz)交打BWWBiggers,WhittenandWhittingham試液CASAcomputer-aidedspermanalysisCASMAcomputeraidedspermmorphometricassessment計(jì)算機(jī)輔助精子形態(tài)評(píng)估CBAVDcongenitalbilateralabsenceofthevasdeferens先天性雙側(cè)輸精管缺失CDcytoplasmicdropleCD45clusterofdetermination45(pan-leukocytemarker)決定簇45(全白細(xì)胞標(biāo)CD46clusterofdetermination46(acrosomalantigen)決定簇4DNAdeoxyribonucleicacid脫氧DPBSDulbecco’sphosphate-bufferedsalineDulbecco’s磷DVDdigitalversatiledisc數(shù)字externalqualityassurancexcessresidualcytoplagameteintrafallopiantransfer輸hydrogenperoxide過氧化氫Hanks’balancedsaltsolutionHankshCGhumanchorionicgonadotrophin人絨毛膜促性腺HIVhumanimmunodefciencyvirus人免疫HOPhamsteroocytepenetration倉HOShypo-osmoticswelling低滲HPFhighpowerfield高倍HRPhorseradishperoxidase辣根過HSAhumanserumalbuminxivHTFhumantubalfuid人輸IBTimmunobeadtest免ICSIintracytoplasmicsperminjection胞Igimmunoglobulin免IUIintrauterineinsemination宮腔內(nèi)KRMKrebs-RingerMediumKrebs-Ringer培LLQlowerlimitofquantifcation定量下限LPFlowpowerfieldMADmeanangulardisplacement平MAImultipleanomaliesindex復(fù)合異MARmixedantiglobulinreaction混合抗球NAnumericalaperture數(shù)值孔徑NPnon-progressive(motilityPBSphosphate-bufferedsaline磷酸緩PMSGpregnantmareserumgonadotrophin孕PNPGp-nitrophenolglucopyranoside對(duì)硝基苯酚吡PSAPisumsativumagglutinin碗RCFrelativecentrifugalforce相RIrefractiveindex屈光RNAribonucleicacid核糖ROSreactiveoxygenspecies活性氧rpmrevolutionsperminute每分鐘轉(zhuǎn)速SOPstandardoperatingprTBSTris-bufferedsTGGTyrode’sglucoseTZIteratozoospermiaindex畸VAPaveragepathvelocity平均軌道VSLstraight-line(rectilinear)velocity直線速率WHOWorldHealthOrganization世界衛(wèi)WOBwobble(VAP/VCL)擺動(dòng)該手冊(cè)已改版三次，被譯成多國(guó)語言。過去30年中，該手冊(cè)作為全球范圍內(nèi)的些試驗(yàn)用于某些特定情況下或由實(shí)驗(yàn)人員選擇研究試驗(yàn)（這些試驗(yàn)?zāi)壳安蛔鞯綄?duì)睪丸和附睪獲得精子的制備。本手冊(cè)中散在分布的方法學(xué)注釋框有注解(方法學(xué)解釋)、評(píng)論（結(jié)果解釋）以及說明框精液分析章節(jié)包括涉及工作溶液的配制、操作流程、精子計(jì)數(shù)及對(duì)結(jié)果解釋的詳細(xì)描述，以使所有給出的方法學(xué)都非常完整，與手冊(cè)中其它章節(jié)內(nèi)容的擴(kuò)展了精子制備部分的內(nèi)容，增加了關(guān)于精子冷凍保存的新章節(jié)。與宮頸粘液分析相關(guān)的操作規(guī)程被分到可供選擇的試驗(yàn)章節(jié)及附錄中粘液特征的檢查與先前的版本相比，第五版的附錄內(nèi)容減少。這部分內(nèi)容僅限于特殊的或者精子數(shù)目的評(píng)估。對(duì)于一份精液標(biāo)本的檢查，精液的稀釋度和評(píng)估精子數(shù)目所需觀察的計(jì)數(shù)池區(qū)域的大小均有所改變，每次需計(jì)數(shù)200條精子。新版手冊(cè)中強(qiáng)調(diào)了抽樣誤差的重要性及計(jì)數(shù)結(jié)果的確定性。編輯委員會(huì)認(rèn)為每次排精的總數(shù)目比精子密度能更準(zhǔn)確的評(píng)估睪丸功能，但這要求對(duì)精液量的測(cè)定無精子癥的評(píng)估。這盡管表面看起來簡(jiǎn)單，但很多因素會(huì)影響無精子癥的診斷，包括計(jì)數(shù)太少數(shù)目精子導(dǎo)致的明顯誤差，觀察顯微鏡視野的數(shù)目，以及檢驗(yàn)布滿碎片精子沉淀物的困難度。本手冊(cè)推薦改為檢驗(yàn)固定后、未離心的標(biāo)本，以及指出所用計(jì)數(shù)方法的靈敏度。然而，當(dāng)需收集足夠數(shù)目的精子用于治療時(shí)，離心方法仍是必需的。另外，手冊(cè)中也介紹了通過檢驗(yàn)未固定標(biāo)精子活力的評(píng)估。第五版與先前版本的主要不同在于對(duì)精子活力的分級(jí)。目前推薦精子活力被分為前向運(yùn)動(dòng)、非前向運(yùn)動(dòng)的不動(dòng)精子（而不再分為a,b,精子形態(tài)的評(píng)估。一些實(shí)驗(yàn)室僅僅評(píng)估正常精子的比例，然而有些人認(rèn)為形質(zhì)控。此章第五版為重新編寫。精液分析過程的健全對(duì)于精液分析嚴(yán)格質(zhì)控精液樣本。傳統(tǒng)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法為取雙向參考區(qū)間的第2.5百分位作為閾值，低本手冊(cè)所載的方法可作為指南以增進(jìn)精液的綜合分析和可比性。但并非為這些多變的非可控因素解釋了眾所周知的個(gè)體精液成分的變化(Bake1996;Carlsen等,2004;(以上數(shù)據(jù)提供由先靈葆雅和拜耳藥業(yè)提供)精液分析包括以下幾個(gè)步驟(在以后章節(jié)中詳述):【在最初五分鐘】將受精精液樣本容器放置在溫控臺(tái)或水浴箱里(37℃)等待液化。在30到60分鐘期間評(píng)估精液的液化情況和物理性狀。如有需要?jiǎng)t檢測(cè)精液的pH值。準(zhǔn)備濕片觀察顯微鏡下精子的活動(dòng)情況，計(jì)數(shù)時(shí)還需進(jìn)行稀釋。如活動(dòng)精子較少，需評(píng)估精子活動(dòng)率。制作精液涂片評(píng)估精子形態(tài)。對(duì)精液進(jìn)行稀釋后做精子密度評(píng)估。對(duì)精子進(jìn)行計(jì)數(shù)。如有需要可進(jìn)行抗免疫珠混合反應(yīng)檢測(cè)。如發(fā)現(xiàn)圓形細(xì)胞則可檢測(cè)過氧化酶陽性細(xì)胞?！驹诋?dāng)日稍后（如冷凍樣本則可在次日）】些高度黏稠的樣本減輕粘稠的方法同處理精液液化延精液主要是由精囊腺和前列腺的分泌物和占小部分的尿道球腺和附睪分泌注釋1：低精液體積是生殖道梗阻或先天性雙側(cè)輸精管缺如（CBAVD）(delaTaille等,1998;Weiske等,2000;Daudin等,2000;vonEckardstein等,2000)的特精液pH值主要反映出由精囊腺分泌的堿性液體和之間的平衡情況。應(yīng)在精液液化30分鐘后進(jìn)行，無對(duì)于生育男性精液pH值的參考值尚未確定，現(xiàn)保松分類的精子數(shù)目（見框2.7和2.10，表準(zhǔn)化，以保持精子在固定厚度約20μm條件下自由游動(dòng)蓋上22mm×22mm的蓋玻片，形成近20μm厚度框2.4濕片的厚度：2.4.3節(jié))或精子的凝集(見2.4.4節(jié))。在一起，為非特異性聚集(圖2.2),這種情況應(yīng)如實(shí)記錄。應(yīng)其程度(1-4級(jí)))和吸附狀態(tài)(A-E級(jí))也應(yīng)記錄(Rose等，1976)(見圖涉及部分聚集等級(jí)完全分離聚集精子數(shù)<10多數(shù)精子為游離狀態(tài)中等聚集聚集精子數(shù)10~50有游離精子高度聚集聚集精子數(shù)>50部分精子游離所有精子均聚集一團(tuán)，無游離精子1.輕度聚集指每個(gè)凝塊中少于10條精子；A.頭對(duì)頭C.尾端對(duì)尾端D.混合型E.糾結(jié)型注釋1:存在凝集并不能充分證實(shí)為不育的免疫性原因，但是能夠說明有抗精子抗體的存在；還需進(jìn)一步檢查以明確診斷(見2.20節(jié))。注釋2:嚴(yán)重的精子凝集能夠影響對(duì)精子活力和密度的評(píng)估。精液中常含有一定的非精子細(xì)胞成分，部分與臨床關(guān)系密切。通常包括泌尿生殖道上皮細(xì)胞、前列腺細(xì)胞、生精細(xì)胞和白細(xì)胞，后兩種統(tǒng)稱為“圓細(xì)胞”(Johanisson等，2000)。這些細(xì)胞成分在染色后的涂片中(放大1000倍)難以區(qū)別(見2.12節(jié)，表13和14,以及2.19節(jié))?？梢酝ㄟ^過氧化物酶技術(shù)和全白細(xì)胞單克隆抗原技術(shù)來進(jìn)行鑒別。非精子細(xì)胞成分計(jì)數(shù)用與精子相同的方法進(jìn)行，或根據(jù)染片(見節(jié))中生精細(xì)胞或白細(xì)胞與精子的比例來進(jìn)行計(jì)算。(山東中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院生殖中心董乾江蘇無錫婦幼保健院生殖中心王洪華)精子活力評(píng)估應(yīng)在精液樣本液化后盡快（最好在30分鐘之內(nèi)）進(jìn)行，務(wù)必在射精后1個(gè)小時(shí)之內(nèi)進(jìn)行。防止時(shí)間過長(zhǎng)，因脫水、pH值及溫建議采用一個(gè)簡(jiǎn)單的精液運(yùn)動(dòng)分類方法，該方法根據(jù)精子運(yùn)動(dòng)功能的不同分進(jìn)行細(xì)分，如將在37℃下精子運(yùn)動(dòng)速度大于25微米/秒的定義為A等，這種方℃?！ぴ陔x蓋玻片至少5μm的區(qū)域內(nèi)觀察精子的運(yùn)動(dòng)（蓋玻片邊緣的精子運(yùn)動(dòng)M987654321情況下)。011223456789框2.6:關(guān)于百分比的比例值和差值處理百分比要四舍五入成整數(shù)，若尾數(shù)是0.5則將其轉(zhuǎn)換至離兩者均數(shù)，如將32.5%寫成32%,而將3.5%寫成4%。這些四舍五入成的百分比全部加起來可能不等于100%。對(duì)照表2.1,若兩個(gè)標(biāo)本PR、NP、IM比例的差值剛好等于可接受的最大差新計(jì)數(shù)。(千萬不要再做一份相同的標(biāo)本，計(jì)算三個(gè)標(biāo)本的平均值，或者選擇數(shù)例1:某兩份精液標(biāo)本(每個(gè)標(biāo)本的精子數(shù)均大于200)的精子能動(dòng)性分析如下，運(yùn)動(dòng)活躍型精子分別占30%和50%;非運(yùn)動(dòng)活躍型精子分別占5%和15%;完全不動(dòng)型精子分別占65%和35%。占比例最大的為完全不動(dòng)型，它們的均值為50%。對(duì)照表2.1,在均值為50%的情況下，差值大于10%,認(rèn)為僅是偶然發(fā)生事件。觀察值大于10%(65%-35%),因此需重新制作兩份標(biāo)本進(jìn)行評(píng)估。例2:某兩份精液標(biāo)本(每個(gè)標(biāo)本的精子數(shù)均大于200)的精子能動(dòng)性分析如下：運(yùn)動(dòng)活躍型精子分別占37%和28%;非運(yùn)動(dòng)活躍型精子分別占5%和6%;完全不動(dòng)型精子分別占60%和66%，占比例最大的為完全不動(dòng)型，它們的均值信區(qū)間積極運(yùn)動(dòng)精子（PR）比例的參考下限為32%（95%的可信度，31-342.6.1曙紅（伊紅苯胺黑法評(píng)估精子的到顯微鏡下觀察。1.曙紅Y:將0.67克曙紅和0.9克氯化鈉溶入到100毫升純凈水中，并輕微加熱。2.曙紅一苯胺黑：將10克苯胺黑加到配好的100毫升的曙紅Y試劑中。3.將其加熱至沸騰，然后冷卻至室溫。1.將精液樣本拌勻。2.將1/5的精液與5μl伊紅溶液混合，置于顯微鏡載玻片上，用移液管混勻，在載玻片上均勻展開。3.重新攪拌精液樣本，然后重復(fù)步驟2制作另外相同一份。4.將兩份樣本的懸浮液分別涂抹在不同的載波片上(見2.13.2節(jié)),然后置正常參考下限活精子(細(xì)胞膜完整精子)比例的參考下限為58%(置信度為95%,置信2.6.2僅用曙紅(伊紅)染料評(píng)估精子活力試劑的制備2.曙紅Y染劑，0.5%(w/v):將0.5g曙紅Y(比色指數(shù)，45380)染料溶于100ml濃度為0.9%的NaCl溶液中。9.以表2.1或是圖A7.2，附錄7為標(biāo)準(zhǔn)（在僅考慮樣本誤差的前提下，均1.存活精子的頭部染色為白色或淡粉色，死亡精子的頭部染色為紅色或深2.如果染色僅限于頸部區(qū)域，剩余的頭部未染色，則可認(rèn)為是“頸部細(xì)胞活精子（細(xì)胞膜完整精子）比例的參考下限為58%（置信度為95%，置信5.37℃下準(zhǔn)確孵化5分鐘或306.按上述步驟，再次混勻精液樣本，再次吸取標(biāo)本，混入膨脹液，孵化，1.通過細(xì)胞形狀的改變來確認(rèn)膨脹的精子，如顯示為尾部卷縮(圖2.6)。2.精子尾部有膨脹表現(xiàn)則可認(rèn)定為存活精子；將所有尾部膨脹的精子均計(jì)為圖2.6低滲膨脹狀態(tài)下的人類精子的典型形態(tài)變化表現(xiàn)示意圖(a)無變化(b)—(g)不同的尾部變化灰色區(qū)域提示為腫脹的尾部。正常參考下限HOS檢驗(yàn)的參考值接近于曙紅檢驗(yàn)的參考值(Carreras等，1992)?；钚跃?細(xì)胞膜完整精子)比例的參考下限為58%(置信度為95%,置信區(qū)間為55-63)。注釋一次射精的精液中的精子細(xì)胞膜的完整性的總數(shù)目是有生物學(xué)意義的。細(xì)胞膜完整的精子數(shù)目可通過一次射精的總精子數(shù)乘以細(xì)胞膜完整精子的百分率Larsenetal,2000)。此推論已為生殖率與精子總數(shù)之間關(guān)系的諸多資料所證明。射精時(shí)精子的數(shù)量，是由鑒定精液得出的精子密度來統(tǒng)計(jì)。對(duì)于正常射精，當(dāng)男性生殖道是通暢的且禁欲時(shí)間短，每次射精時(shí)的精子總數(shù)均與睪丸容積有關(guān)子總數(shù)是衡量睪丸成生精子的能力(MacLeod&Wang,1979)及男性生殖道通暢的指標(biāo)。與受精和妊娠率相關(guān)的精液中精子濃度受精囊(Eliasson,1975)和前列腺分泌多少的影響，并非是睪丸功能的特異性指標(biāo)。積獲得。）：推薦使用100μm深血球細(xì)胞計(jì)數(shù)器為計(jì)數(shù)池，因Neubauer（牛鮑氏）血球度是有效的(Seaman等,1996;Mahmoud等,1997;BraNeubauer血球細(xì)胞計(jì)數(shù)器得到的結(jié)果將會(huì)不同。通過毛細(xì)管作用填充的淺計(jì)數(shù)池，由于流動(dòng)精子不會(huì)均勻分布(Douglas-Hamilton等,2005a,2005b)。該誤差能夠被校正(Douglas-Hamilton等,2005a)，但校正并非是完全正確的(Bj?rndahl&Barratt，2005)。這種可選擇的計(jì)數(shù)池，其有效性須經(jīng)計(jì)數(shù)池核查量綱來確定(見附錄7,A7.8節(jié))，將Neubauer改良的血細(xì)胞計(jì)數(shù)器法得出的結(jié)果加以比較，獲號(hào),0.44mm)，由0.1mm玻璃柱支撐，覆蓋網(wǎng)格。每個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)分成九個(gè)1mm×圖2.7改良的Neubauer(紐鮑爾氏)血球細(xì)胞計(jì)數(shù)器蝕刻區(qū)略圖如下所示：血球細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)池的所有九個(gè)網(wǎng)格(左邊面板);25個(gè)大方格中的中央網(wǎng)格(5號(hào))(中間面板);顯微鏡下已充填的一個(gè)數(shù)精池的部分(右邊面板),即中央網(wǎng)格的25個(gè)方格之一(中間面板的圓圈所示),其由三重線圍出，包含16個(gè)小方格。2.7.3血球細(xì)胞計(jì)數(shù)器網(wǎng)格的使用·只對(duì)整個(gè)精子(包括頭和尾)進(jìn)行計(jì)數(shù)。邊的不予計(jì)數(shù)(見圖2.8,右邊面板)。2.7.4計(jì)數(shù)器的維護(hù)·使用后，用水清洗血細(xì)胞計(jì)數(shù)器數(shù)精池和蓋玻片，然后用相機(jī)(鏡頭)專三線的中間線確定了方格的邊界(黑線，左邊面板)。除頭部在兩條內(nèi)線之間(白圈)的精子之外，方格中央的所有精子均計(jì)數(shù)，但頭部在兩條外線之間的需計(jì)數(shù)(黑圈)。頭部大部分在中間線上的精子，如果該中線低于方格(白圈，2.7.5稀釋后精液的固定2.如果急需，加0.25g臺(tái)盼藍(lán)(顏色所引23859)或5mL(>4mg/ml)飽和的結(jié)晶紫(顏色所引42555),以加亮精子頭部。2.7.6計(jì)數(shù)足夠數(shù)量精子的重要性為降低樣本誤差，精子的臨界數(shù)量(大約200條重復(fù)計(jì)數(shù)時(shí)，總數(shù)400條以區(qū)間(CI)接近N±1.96×√N(yùn)(或?yàn)镹±2×√N(yùn)左右)。如果計(jì)數(shù)100個(gè)精子，那么標(biāo)準(zhǔn)誤差(SE)即為10(√100),其95%的置信區(qū)間(CI)是80-120(100±20)。如果計(jì)數(shù)200個(gè)精子，則SE為14(√200)其95%CI為172-288(200±28)。如果計(jì)數(shù)400個(gè)精子，則SE為20(√400),其95%CI為360-440(400±40)。條時(shí)為81.4-121條；一次計(jì)數(shù)10條時(shí)為4.80-18.4;一次計(jì)數(shù)1條時(shí)為表2.2參照精子計(jì)數(shù)總數(shù)的圓形樣本誤差(%)5123456789(廣西南寧第二醫(yī)院生殖中心劉峰)氏計(jì)數(shù)池的中央大方格（5號(hào)方格）容積是100nl，則其內(nèi)的精子數(shù)目將是如2.4.2節(jié)中所述制作濕片并檢測(cè)其中之一，估框2.9池深為20μm的濕片中每高倍視野的容積2表2.3精液所需稀釋度、配制方法、使(μl）(μl）注4：如果1+19(1:20)稀釋不合注釋1：如果初始濕片制備中精子數(shù)目太低(每×400高倍視野<4：大約1×注釋2：為準(zhǔn)確評(píng)估低密度精子（每×400將蓋玻片緊壓支持柱以固定于計(jì)數(shù)池上，可通過觀察兩層玻璃之間的虹彩將第一次稀釋的液體置于振蕩器以最高的速度振蕩10秒鐘以充分混勻，立注2：使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板夾保持蓋玻片位置不變將確保一個(gè)固定的池深每次至少重復(fù)計(jì)數(shù)200個(gè)精子以達(dá)到足夠低的抽樣誤差（請(qǐng)參閱框2.7和）；注1：如果在4、5和6號(hào)大方格中計(jì)數(shù)少于200個(gè)精子，不要繼續(xù)在1、2、和6號(hào)大方格(參閱2.7.2節(jié))。這種情況下，可降低框2.10重復(fù)計(jì)數(shù)的比較二次計(jì)數(shù)時(shí)在7行內(nèi)發(fā)現(xiàn)有245個(gè)精子，總計(jì)數(shù)是在1），），例4：1+4(1:5)稀釋下，第一次計(jì)數(shù)時(shí)在4行內(nèi)發(fā)現(xiàn)有），例5：1+4(1:5)稀釋下，第一次計(jì)數(shù)時(shí)在8行內(nèi)發(fā)現(xiàn)有數(shù)時(shí)在8行內(nèi)發(fā)現(xiàn)有213個(gè)精子，總計(jì)數(shù)是16行內(nèi)有437(2241+4(1:5)稀釋下樣本的精子濃度為C=(N/n)×（6.825個(gè)精子/nl或6.8×=27.3/4=6.8×106/ml。），初始濕片制備中如果每高倍視野的精子數(shù)目稀少(即400倍數(shù)下0～4個(gè)精子子密度為2×106/ml（考慮到與稀少精子相關(guān)的高樣本誤差）及注明是否看到活混勻精液樣本（參閱框2.3）。如果樣本粘稠度高，有序的逐個(gè)視野掃視整個(gè)蓋玻片區(qū)域。從一個(gè)角落開側(cè)，然后沿y軸移動(dòng)一個(gè)視野并以整個(gè)視野寬度向回返方向間。確定數(shù)量，請(qǐng)參閱2.11.1節(jié)或2.11.2節(jié)。有序的逐個(gè)視野掃視整個(gè)蓋玻片區(qū)域。從一個(gè)角落開側(cè)，然后沿y軸移動(dòng)一個(gè)視野并以整個(gè)視野寬度向回返方向使用×20的物鏡和孔徑為20mm的×10目鏡時(shí)，本節(jié)描述采用非離心法計(jì)數(shù)稀少精子。以低倍稀釋精液進(jìn)行檢測(cè)，或者加為了減少抽樣誤差，精子計(jì)數(shù)的數(shù)量必須達(dá)到一定的標(biāo)準(zhǔn)（最好重復(fù)計(jì)數(shù)框2.11改良紐鮑爾氏計(jì)數(shù)池全部9個(gè)大方格的計(jì)數(shù)精子達(dá)到200條改良紐鮑爾氏計(jì)數(shù)池全部9個(gè)大方格的容積5、每次重復(fù)計(jì)數(shù)至少200條精子，以獲得足夠低的抽樣誤差（見框2.7及6、對(duì)其中一個(gè)計(jì)數(shù)池逐個(gè)方格進(jìn)行檢測(cè)，直到計(jì)夠200條精子和完整的一7、記錄精子計(jì)數(shù)達(dá)到200條時(shí)的方格數(shù)量。另一計(jì)數(shù)池計(jì)數(shù)精子時(shí)也要檢9、切換至另一計(jì)數(shù)池，重復(fù)計(jì)數(shù)與第一次相同的方格數(shù)（相同體積），即可接受性(兩者均顯示在95%的可信區(qū)間內(nèi)，單純抽樣誤差允許的兩個(gè)數(shù)值的最當(dāng)計(jì)數(shù)池的九個(gè)大方格都進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，每μl精子密度計(jì)算為：精子總數(shù)除當(dāng)計(jì)數(shù)池的九個(gè)大方格都進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，每μl精子密度計(jì)算為：精子總數(shù)除/ml；這是在1:2樣本稀釋下對(duì)改良紐鮑爾氏計(jì)數(shù)池全部九個(gè)大方格計(jì)數(shù)時(shí)，抽例1：1+1（1:2）稀釋下，第一次重超出了偶然概率所允許的差異值（42因此需要例2：1+1（1:2）稀釋下，第一次重復(fù)計(jì)數(shù)時(shí)3個(gè)方格的精子數(shù)量為2第二次重復(fù)計(jì)數(shù)時(shí)3個(gè)方格的精子數(shù)量為200，6個(gè)方格的精子總數(shù)為410），例3：1+1（1:2）稀釋下，第一次重復(fù)計(jì)數(shù)時(shí)全部9個(gè)方格的精子數(shù)量是），當(dāng)計(jì)數(shù)池的九個(gè)大方格（1.8μl)都進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，1+1（1:2）稀釋下樣本的精子例4：1+1（1:2）稀釋下，第一次重復(fù)計(jì)數(shù)時(shí)全部9個(gè)方格的精子數(shù)量是因此精子密度<56000/ml；檢測(cè)報(bào)告為“檢測(cè)精液樣本中可見1使用大容量、池深為100μm的計(jì)數(shù)板可增加精子密使用含有Hoechst33342雙苯甲亞胺熒光素(1毫克/升)的固定劑(參見在初始的濕片制備中，1+1(1:2)稀釋精液每高倍視野的精子數(shù)少于2條對(duì)精框2.12一次性大容量計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)精子達(dá)到200條3、將計(jì)數(shù)板平放置于濕盒內(nèi)（例如放在浸透水的過濾紙上并蓋上皿）以免5、每次重復(fù)計(jì)數(shù)至少200條精子，以獲得足夠低的抽樣誤差（見框2.7及6、對(duì)其中一個(gè)計(jì)數(shù)池有序的逐個(gè)視野進(jìn)行掃視，從一個(gè)角落開始沿x軸以這種z形方式繼續(xù)掃視，當(dāng)改變視野時(shí)要保持對(duì)計(jì)數(shù)板的檢測(cè)，直到計(jì)數(shù)達(dá)7、記錄精子計(jì)數(shù)達(dá)到200條時(shí)的視野數(shù)量。另一計(jì)數(shù)池計(jì)數(shù)精子時(shí)也要檢9、切換至另一計(jì)數(shù)池，重復(fù)計(jì)數(shù)與第一次相同的視野數(shù)（相同體積），即可接受性(兩者均顯示在95%的可信區(qū)間內(nèi)，單純抽樣誤差允許的兩個(gè)數(shù)值的最×250放大倍數(shù)下，單個(gè)視野的容積是80nl（見框×400放大倍數(shù)下，單個(gè)視野的容積是20nl（見框2.13）。1+1(1:2)稀釋的精液，精子密度為C=（N/n）×（1/20）×2/nl，即C=（N/n）×當(dāng)計(jì)數(shù)池的整個(gè)區(qū)域都進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，將精子總數(shù)除以兩個(gè)計(jì)數(shù)池的總體積框2.13池深為100μm的一次性大容量計(jì)數(shù)池每高倍視野的容積21+1（1:2）稀釋下樣本的精子密度為C=（N/n）×（2/v）/nl，如果v=20而第二次重復(fù)計(jì)數(shù)時(shí)整個(gè)計(jì)數(shù)池的精子數(shù)量為70，兩個(gè)計(jì)數(shù)池的計(jì)數(shù)精子總量），下樣本的精子密度為C=(N/50)×2/μl=(120/50)×2=4.8/μl,或4800/ml（就這因此精子密度<2000/ml。檢測(cè)報(bào)告為“兩次重復(fù)計(jì)數(shù)可見38條精子，因精子數(shù)S是該份精液的精子濃度(106/ml)，那么圓細(xì)胞濃度的計(jì)算公式是：C=S×(N/40時(shí)需報(bào)告計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)目的抽樣誤差（見表2.2若計(jì)數(shù)的圓細(xì)胞數(shù)小于25，則例1：第一次重復(fù)計(jì)數(shù)時(shí)每200精子的視野內(nèi)有21個(gè)圓細(xì)胞，而第二次重），例2：第一次重復(fù)計(jì)數(shù)時(shí)每200精子的視野內(nèi)有24個(gè)圓細(xì)胞，而第二次重度是：C=S×(N/400)/ml，即C=70×106×（60/400）=10.5×106/ml（就這兩個(gè)有效數(shù)板，采用2.8.3節(jié)介紹的計(jì)數(shù)精子細(xì)胞的方法計(jì)數(shù)。但是，對(duì)于精另外，這些非精子細(xì)胞的密度可以通過計(jì)數(shù)過氧化物酶陽性細(xì)胞來評(píng)估（見形細(xì)胞密度（106/mlS為精子密度（106/mlN為計(jì)數(shù)400個(gè)精子相同視野25個(gè)，就單報(bào)告觀察的圓形細(xì)胞數(shù)量，并注釋“圓形細(xì)胞數(shù)量太少，無法進(jìn)行精確計(jì)數(shù)”圓形細(xì)胞密度為C=S×（N/400）=70×（60/400）=10.5×106/ml。由于細(xì)胞計(jì)其是從性交后子宮頸管內(nèi)粘液中獲得的精子（Fredricsson&Bjork,197;Menkveldetal.,1990以及從透明帶表面收集到的精子（Menkveldetal.,1991;Liu&得妊娠間期（time-to-pregnancyTTP）以及體內(nèi)、體外妊娠率）之間的關(guān)系為0～30%,很少超過25%(Menkveldetal.,2001)。因此，正常值下限很低。在關(guān)于體外受精(Coetzeeetal,1998)、宮腔內(nèi)人工授精((a,b)在體外從透明帶中回收的精子，用Shorr染色法染色。(c)性交后(a,b)由歐洲人類生殖和胚胎學(xué)協(xié)會(huì)授權(quán)，從Liu等(2003)處復(fù)制。2.13.2精液涂片的制備●盡管保留了大量殘留胞漿，但是滲透壓敏感性胞漿小體消失 3．在玻片的邊緣加5～10μl精液，具體加多少取決于精子的密度。用另外果刮片用的玻片不是那種有白漆標(biāo)記面的，那么每個(gè)邊緣都可以用以刮）：度低時(shí)效果很好，但對(duì)于特別粘稠的精液，這種方法不理想（見圖2.12和當(dāng)精子密度低(<2×10/ml)、粘稠或雜質(zhì)很多、或者需要做計(jì)算機(jī)輔助形當(dāng)精子密度很低(<2×10/ml),需要濃縮精液標(biāo)本：1.以600g離心10分鐘。4.盡可能獲得最高密度的精子，但也不要超過50×10/ml。5.以后按正常精液標(biāo)本處理(見2.13.2高的標(biāo)本可以參照液化不良的標(biāo)本處理后進(jìn)行涂片(見節(jié))或者進(jìn)行洗雜質(zhì)和大量顆粒狀物質(zhì)(例如非常粘稠的標(biāo)本)可以導(dǎo)致精子頭部堆聚，這1.在室溫下，將部分精液(0.2～0.5ml,取決于精子的密度)加入10ml生理鹽水(0.9g氯化鈉(NaCl)加入100ml純水)。2.800g離心10分鐘。）：80%乙醇中只需要10秒，而在空氣中干燥后再浸入50%乙醇就需要更長(zhǎng)時(shí)間漁霸士染色相比，Shorr染色后所得到的精子正常形態(tài)率相似（Meschedeet2．Shorr溶液：購買制成品或者按照以下步驟制備：將4gShorr粉溶解于由于缺乏客觀性、理解上的差異以及外部質(zhì)量控制評(píng)估的可操作性差（見7.13.2節(jié)評(píng)估精子形態(tài)有許多困難。這里推薦一種簡(jiǎn)單的正常/異常分類：用肉眼計(jì)數(shù)異常精子的異常部位。當(dāng)評(píng)估精子正常形態(tài)率時(shí)需要采用下述標(biāo)準(zhǔn)頭部在外形上必須是平滑的、弧度規(guī)則的、大體上為橢圓形。頂體部分必須沒有大的空泡，小的空泡不超過2個(gè)，空泡的面積不能超過精子頭中段必須是纖細(xì)的、規(guī)則的且長(zhǎng)度與頭部相同。中段頭部的主軸相延續(xù)。胞漿殘余體只有在過多時(shí)（也就是說超過精子頭部畸形。注釋3：用計(jì)算機(jī)系統(tǒng)（重復(fù)測(cè)量的變異系數(shù)為2～7%）分析7得出的頭部大小數(shù)據(jù)為：長(zhǎng)4.1μm，95%CI3.7～4.7；寬2.8μm，95%CI2.5~注釋4：用同樣的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)分析74巴氏染色后的精子（在2.14.2節(jié)介紹的方長(zhǎng)4μm，95%CI3.3～5.2；寬0.6μm，95%CI0.5～0.7。在學(xué)習(xí)區(qū)分各種類型精子（正常/臨界精子頭部和尾部，見1～12版以及它個(gè)空泡或者>20%頭部區(qū)域?yàn)槲慈旧目张蓓旙w后區(qū)有空泡，頂體區(qū)主段畸形：短，多尾，斷裂，光滑的發(fā)夾樣彎曲，成角彎折，寬度不規(guī)特征為精子有大量不規(guī)則的、能被染色的細(xì)胞漿成份，為精子頭部大小種現(xiàn)象。注釋2：胞漿小滴是滲透壓敏感性的，在正?？諝飧稍锏倪^程中容易被破壞j）細(xì)D過多的胞漿殘余體((陳國(guó)武)bacillibent雙ifPPOKnotassessedpinheadpolymorphpyriform厚空泡多于兩個(gè)空泡圖解1中精子形態(tài)學(xué)評(píng)估123456789圖解2圖解2中精子形態(tài)學(xué)評(píng)估123456789圖解310微米圖解3中精子形態(tài)學(xué)評(píng)估123456789圖解4圖解4中精子形態(tài)學(xué)評(píng)估123456789圖解5圖解5中精子形態(tài)學(xué)評(píng)估123456789圖解6圖解6中精子形態(tài)學(xué)評(píng)估123456789圖解7圖解7中精子形態(tài)學(xué)評(píng)估頭部外形其他頭部評(píng)估頸部評(píng)估尾部主段評(píng)估整體精子分類評(píng)估10微米123456789圖解8圖解8中精子形態(tài)學(xué)評(píng)估圖解9123456789圖解9中精子形態(tài)學(xué)評(píng)估圖解10123456789圖解10中精子形態(tài)學(xué)評(píng)估圖解1112345678910微米圖解11中精子形態(tài)學(xué)評(píng)估圖解12123456789圖解12中精子形態(tài)學(xué)評(píng)估123456789圖解1310微米123456789圖解14中細(xì)胞評(píng)估123456789為防止觀察區(qū)視野選擇的偏頗，應(yīng)系統(tǒng)選擇涂片觀察區(qū)視野對(duì)可評(píng)估精子8．確定可接受的誤差，參見表2.1、圖A7.2、附錄7（反映兩次計(jì)數(shù)百分需要應(yīng)用多鍵計(jì)數(shù)器，其中一鍵表示正常精子，另一鍵表示缺陷精子，上2．缺陷精子百分比為各種類型缺陷精子數(shù)除例：用6鍵計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)評(píng)估200個(gè)精子，其中42個(gè)精子被精子，158個(gè)鏡子被計(jì)數(shù)為缺陷精子。缺陷精子中，140個(gè)為頭部缺陷，102個(gè)精子被計(jì)數(shù)為正常形態(tài)精子，164個(gè)精子被計(jì)數(shù)為缺陷精子。缺陷精子中，122查表可知兩次計(jì)數(shù)樣本誤差為可接受范疇。第一次評(píng)估正常形態(tài)精子比例尾部缺陷精子比例為（30+22）/400=13%，帶胞漿小滴精子比例為（44+36）有時(shí)部分精子會(huì)有一些特異性結(jié)構(gòu)缺陷。比如：頂體未發(fā)育導(dǎo)致的小圓頭如患者的精子全部表現(xiàn)為一種缺陷，那此患者通常表現(xiàn)為不育。這種情況巴氏染色精液涂片觀察白細(xì)胞和精子細(xì)胞、精母細(xì)胞還是有顯著差異的（見2.14.2節(jié)）。區(qū)分主要是以上幾類細(xì)胞著色、細(xì)胞的大小和形狀存在較大差異還有許多其它技術(shù)可以判定精液中白細(xì)胞群的數(shù)量。如比較流行的過氧化物酶染色鑒定多行核粒細(xì)胞特有的過氧化物酶，較適合初篩（Woff，1995；白細(xì)胞也可以通過費(fèi)時(shí)并昂貴的免疫細(xì)胞化學(xué)方法來檢測(cè)評(píng)估，這種方法一般經(jīng)過氧化物酶染色后的精液才行白細(xì)胞計(jì)數(shù)，染色后可以比較容易的這種方法可以很好的分辨帶分葉核的中性粒細(xì)胞和多核的精子細(xì)胞，多核精子細(xì)胞本身不含過氧化物酶（Johanlsson水和9.08gKH2PO4溶于1000ml純水?；旌蟽梢?，調(diào)pH值至6.0（大約12ml氧化物酶陽性細(xì)胞至少200個(gè)。陽性細(xì)胞(可能此計(jì)數(shù)方格過氧化物酶陽性細(xì)胞數(shù)不足200個(gè))。10.查表得知可接受的樣本誤差率(見表2.5、圖A7.1、附錄7)。取樣重做兩張涂片重新評(píng)估(見框2.10)。13.計(jì)算每次射出精液過氧化物酶陽性細(xì)胞總過氧化物酶陽性粒細(xì)胞(標(biāo)記為P,染為棕色),過氧化物酶陰性圓細(xì)胞(標(biāo)評(píng)估每張計(jì)數(shù)池的9個(gè)計(jì)數(shù)方格后，過氧化物酶陽性細(xì)胞總數(shù)除以兩張計(jì)數(shù)池的總?cè)莘e（1.8μl乘以稀釋比（10）也能得到精液中過氧化物酶陽性細(xì)胞如每張計(jì)數(shù)池中過氧化物酶陽性細(xì)胞數(shù)少于25個(gè)，密度＜277000/ml；應(yīng)用改良紐鮑爾計(jì)數(shù)池，按1:10稀釋后，評(píng)估所有9個(gè)計(jì)數(shù)方格的誤差下限為表2.5查得樣本誤差超出隨機(jī)誤差（24故本次結(jié)果不可取，需重新涂片計(jì)數(shù)例2：1:10稀釋后涂片，涂片1觀察5個(gè)計(jì)數(shù)方格發(fā)現(xiàn)204個(gè)過氧化物酶陽性細(xì)胞，涂片2觀察5個(gè)計(jì)數(shù)方格發(fā)現(xiàn)198個(gè)過氧化物酶陽性細(xì)胞。10個(gè)觀例3：1:10稀釋后涂片，涂片1觀察9個(gè)計(jì)數(shù)方格發(fā)現(xiàn)144個(gè)過氧化物酶陽性細(xì)胞，涂片2觀察9個(gè)計(jì)數(shù)方格發(fā)現(xiàn)162個(gè)過氧化物酶陽性細(xì)胞。18個(gè)觀察計(jì)數(shù)方格過氧化物酶陽性細(xì)胞總數(shù)306個(gè)（144+162樣本誤差為18例4：1:10稀釋后涂片，涂片1觀察9個(gè)計(jì)數(shù)方格未發(fā)現(xiàn)過氧化物酶陽性細(xì)胞，涂片2觀察9個(gè)計(jì)數(shù)方格發(fā)現(xiàn)少于25個(gè)過氧化物酶陽性細(xì)胞，密度＜277000/ml；報(bào)告時(shí)應(yīng)注明“細(xì)胞數(shù)目過少，無法達(dá)到精確評(píng)估濃度細(xì)胞活性等(Tomlinson等,1993;Aitken和Baker,1995;Rossi和Aitken,1997)?？赏ㄟ^巴氏染色將精子和精原母細(xì)胞與白細(xì)胞區(qū)分開來(Johanissonetal.,內(nèi)白細(xì)胞過氧化物酶、無白細(xì)胞特異性抗原(見3.2節(jié))多核精子細(xì)胞與多核白細(xì)胞在形態(tài)上難以區(qū)分。但染色后精子細(xì)胞呈淡紅色而PMN白細(xì)胞呈藍(lán)色(Johanissonetal.,2000)?？梢罁?jù)發(fā)育中頂體的特異性染色(Coutureetal.,1976)、凝集素（見4.4.1節(jié)）和特異的抗體（注釋2：僅有少量抗精子抗體的存在不能作為診斷精子自身免疫疾病（sperm集試驗(yàn)（MAR綜述見Bronsonetal.,1984）免疫球試驗(yàn)（IBBronson洗滌后的精液。兩種檢測(cè)方法不一定能得到相同的結(jié)果（Scarsellietal.,1989而對(duì)于那些沒有活動(dòng)精子的標(biāo)本，體有足夠的相互作用時(shí)間。因?yàn)橹辽傩枰?0分鐘的反應(yīng)時(shí)間才能觀察到混力。此外，將精子與已知含有抗體的精漿共孵育也可得到用做對(duì)照的陽性精子4.將3.5μl含有包被有IgG的膠乳顆粒（小珠）的試劑分別加待測(cè)標(biāo)本及對(duì)照5.將3.5μl含有包被有IgG抗血清試劑分別加待測(cè)標(biāo)本及對(duì)照物中，并用加樣不用10分鐘時(shí)重復(fù)觀察。觀察。注釋：當(dāng)50%或更多的活動(dòng)精子被小珠粘附時(shí)精子宮頸粘液穿透能力和IVF受這項(xiàng)檢測(cè)比MAR費(fèi)時(shí)，但I(xiàn)B中精子經(jīng)過洗滌，除去了精漿中可能對(duì)檢測(cè)在直接免疫珠試驗(yàn)（IB）中，共價(jià)連接有兔抗人免疫球蛋白IgG/IgA的小3.緩沖液II：加入5克CohnFractionVBSA至100ml杜氏（Dulbecco4.使用0.45-μm孔徑的濾膜過濾上述-在每個(gè)檢測(cè)中，必須同時(shí)含有ASAb-陽性的精子和ASAb-陰性的精子作為對(duì)照。上述精液必須來自已被之前的直接免疫珠試驗(yàn)證明含有/未含有抗精抗體8.只計(jì)數(shù)被一?；蚨嗔Ｃ庖咧榻Y(jié)合的活動(dòng)精子。參見節(jié)，忽略尾尖被如果待測(cè)體液是宮頸粘液，需準(zhǔn)備濃度為10IU/ml的菠蘿蛋白酶(EC2.將溶解的宮頸粘液、血清、精漿或睪丸液56性時(shí)，可用作陽性質(zhì)控標(biāo)本的來源。（陽性是指>50%的活動(dòng)精子被粘附，的百分率更有意義；特別是當(dāng)涉及研究人類生精功能損傷情況時(shí)(Jouannetetal.,評(píng)價(jià)一些病理或有毒有害環(huán)境對(duì)生育力影響時(shí)也十分有用(Augereta頭部的1/3時(shí)）幾個(gè)方面來評(píng)價(jià)精子是否存在缺陷。使用細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行計(jì)數(shù)。計(jì)算在內(nèi)。與本手冊(cè)的其它評(píng)價(jià)體系不同(見2.15.1節(jié)和2.15.2節(jié))，該指數(shù)所使用的形態(tài)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)采用由David等（1975）提出，經(jīng)Auger和Eustache43人類生殖與胚胎手冊(cè)（EuropeanSocietyofHumanReproductionandEmbryology，ESHRE）以及北歐男科學(xué)會(huì)（NordicAssociationforAndrology，NAFA)(ESHRE/NAFA,2002)。與本手冊(cè)之前的版尾部缺陷，44條有多余的胞漿小滴殘留。在第2次計(jì)數(shù)時(shí)，36條正常，164條時(shí)，用總的畸形數(shù)(140+102+30+44+122+108+22+36=604畸形)除以異常精子數(shù)MAI15N2.Menkveldetal.,23.Jorgensenetal,2001,使用的是David形態(tài)分類法(Davidetal.,1975,由Auger已經(jīng)釋放了粒細(xì)胞的多形核白細(xì)胞和不含過氧化物酶的其它類型的白細(xì)胞如淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞不被為o-甲苯胺細(xì)胞過氧化試驗(yàn)檢測(cè)出來。2.Tris-緩沖液（TBSpH8.2；見Appen甲基甲酰胺以及0.1ml1.0mol/l的左旋咪唑。使用前加入10mg快紅（fast9.Harris’s蘇木精染液（作于復(fù)染見Appendix4,sec1.分別在兩張清潔的玻片上滴加5μl精子懸液并制成涂片(見Section2.13.2)并1.用×200或×400倍的明場(chǎng)顯微鏡檢查整個(gè)染2.為了將誤差控制在可接受的范圍內(nèi)，每次須至少計(jì)數(shù)200條精子。同時(shí)記紅色是含有CD45的細(xì)胞(白細(xì)胞)如果在樣本中含有的CD45-陽性細(xì)胞比精子少(如<400),則樣本的誤差將超過5%。此時(shí)，需要報(bào)告計(jì)數(shù)的細(xì)胞數(shù)的誤差(見表2.2)。如果計(jì)數(shù)的CD45-陽性細(xì)胞數(shù)少于25,報(bào)告觀察到的CD45-陽性細(xì)胞數(shù)并例1:在一次檢測(cè)中，在200條精子中有20個(gè)CD45-陽性細(xì)胞；在二次檢測(cè)中，在200條精子中有40個(gè)CD45-陽性細(xì)胞。則總數(shù)(20+40)是60,誤差(40-20)是20。從表2.5中可以看到超過了隨機(jī)誤差(15),因此該結(jié)果不被接例2:在第一次檢測(cè)中，每200條精子中有25個(gè)CD45-陽性細(xì)胞；在二次檢測(cè)中，在200條精子中有35個(gè)CD45-陽性細(xì)胞。則總數(shù)(20+40)是60,誤差是10×10/ml(保留兩位有效數(shù)字)。由于計(jì)數(shù)到的細(xì)胞少于400個(gè)，則根據(jù)表躍精子的數(shù)目，評(píng)估精子存活數(shù)目（Sobrero&MacLeod，1962）和精子的活動(dòng)框3.1石蠟油混合物的制備器提取。精子在陰道內(nèi)兩個(gè)小時(shí)就會(huì)失活。觀察陰道中精子涂片的目的(參見2.4.2穿過宮頸粘液的精子數(shù)目的評(píng)估一般采取計(jì)數(shù)高倍鏡視野下所見精子數(shù)目●排除其它明顯的性交后宮頸因素，如果在性交后9-14小時(shí)內(nèi)沒有在宮頸粘液使用體外試驗(yàn)對(duì)精液-子宮頸粘液相互作用予以詳細(xì)的評(píng)估。通常，當(dāng)性交子能夠活動(dòng)和存活的最適pH值范圍為7.0—8.5，這也是月經(jīng)中期宮頸粘液pH3.水平地存放載玻片在30分鐘在37°C在一個(gè)濕潤(rùn)的溫箱(即在一個(gè)有蓋的種物理特性，不含有精子的精液也會(huì)發(fā)生(Perloff和steinberger1963;Moghissi4.精子的移動(dòng)距離可以達(dá)到至少500μm(即大約為10個(gè)精子長(zhǎng)度)，即離開因?yàn)樵谄矫娴牟Ｆ鲜沟镁?宮頸粘液接觸界面的大小和形狀完全標(biāo)準(zhǔn)化是不可能的，故該試驗(yàn)的結(jié)果時(shí)常帶有一些主觀性。因此，精液-宮頸粘液互作毛細(xì)管測(cè)試最初是由Kremer設(shè)計(jì)的(1965),本法是在一毛細(xì)管內(nèi)測(cè)量精子定在離儲(chǔ)液囊5mm的位置。這種構(gòu)造可以防止精液侵入毛細(xì)管和玻璃片之飽含水分的濾紙)防止精液和粘液變干。6.如節(jié)所述，觀察毛細(xì)管應(yīng)在放大×100的顯微鏡下。7.設(shè)備置于37℃孵化器，且在24個(gè)小時(shí)后為了觀察前向運(yùn)動(dòng)的精子的表現(xiàn)，應(yīng)該重復(fù)檢查毛細(xì)管。在2個(gè)小時(shí)以后，評(píng)估遷移距離、穿透密度、遷移所導(dǎo)致的精子減少數(shù)目和前向運(yùn)動(dòng)精子的數(shù)目。1.遷移距離：測(cè)量所浸入精液儲(chǔ)液槽的毛細(xì)管末端到管中最前面的精子之間2.穿透密度：在距浸入精液儲(chǔ)液槽內(nèi)的毛細(xì)管末端1cm和4.5cm的兩個(gè)點(diǎn)處測(cè)定。由每低倍鏡視野(×100LPF)下觀察到的每個(gè)距離點(diǎn)的精子平均數(shù)決定。通過計(jì)數(shù)五個(gè)低倍鏡視野而獲得平均數(shù)。計(jì)數(shù)均值用穿透密度等級(jí)來表示，如表3.3所示。對(duì)于測(cè)試的分類，以1或4.5cm的距離下最高的精子穿入密度等級(jí)作為檢驗(yàn)的結(jié)果。表3.3精子穿透密度排行次序穿透密度的分類排列順序012345673.遷移減少：通過計(jì)算4.5cm處穿透密度較1cm處的減少量來獲得。以不同等級(jí)序號(hào)表示。例1:在1cm處的穿透密度是51-100/LPF,而在4.5cm處是6-10/LPF。則遷移減少值是3(等級(jí)序號(hào)6減去3)(表3.3)例2:在1cm處的滲透密度是21-50/LPF,而在4.5cm處是51-100。則遷移值減少價(jià)值是零，因?yàn)槠浯┩该芏葲]有減少，實(shí)際上是增加了(表3.3)。10--或或或2差和和和好所有不能分級(jí)的試驗(yàn)結(jié)果總結(jié)為現(xiàn)有多種反映附屬性腺功能的生化指標(biāo)，如前列腺分泌的檸檬酸、鋅、γ-●前列腺的分泌功能。精液中的鋅，檸檬酸(M?llering和gruber，1966)或酸性●附睪的分泌功能。L-左旋肉毒堿，甘油磷酸膽堿（GPC）和中性α-葡糖苷酶是臨床常用的附睪標(biāo)志物。在精漿中存在兩種α-葡糖苷酶的異構(gòu)體：其中主要來源于前列腺。在反映附睪功能失調(diào)方面，中性α-葡糖苷酶較左旋肉毒堿和甘這種方法需要使用一個(gè)精確度為4μmol/l的96孔板測(cè)定儀(Cooper等，1991)。當(dāng)分光光度儀使用3ml或1ml的比色杯時(shí)，可以按比例調(diào)整精液和試劑的體積化合物2-（5-溴-2-吡啶偶氮）-5-（N-丙烷-N-磺基丙氨）-苯酚(5-Br-PAPS)3.標(biāo)準(zhǔn)曲線：按照步驟2所述，溶解101.將精液分析后的剩余精液以1000g離心10分鐘，收集無精子的精漿于-20°C儲(chǔ)存待分析。無精子精漿可以合并以其它樣品為以后內(nèi)部質(zhì)量管理分析用4.向96孔讀數(shù)板中加入步驟3中的雙份稀釋的精漿標(biāo)本各3.結(jié)果需乘以稀釋倍數(shù)61（5微升精漿以300微升水稀釋以獲得未稀釋4.兩組之間的差異應(yīng)在10％以內(nèi)，即（估值/估值的平均數(shù)間的差異）×5.乘以一次射精的精液體積，得到每次射出的精液中鋅濃度（毫升進(jìn)而每次射精中的鋅的參考低值為2.4μmol/次（來自于庫珀等，1991；和TG1.脫蛋白質(zhì)的試劑1(63μmol/l的ZnSO4)：在100ml凈化水中溶解1）：哚溶解其中，并加凈化水至100ml。過濾器（0.45微米孔徑）過濾后于4°C下4.果糖標(biāo)準(zhǔn)液（2.24mmol/L）：在1.將精液分析后的剩余精液以1000g離心10分鐘，收集無精子的精漿于-20°C儲(chǔ)存待分析。無精子精漿可以合并以其它樣品為以后內(nèi)部質(zhì)量管理分析用4.脫去蛋白質(zhì)：向稀釋的樣品55μl中加入加12.5μl濃度為63μmol/l的7.加0.5ml的濃(32%v/v)鹽酸(HCl)到每個(gè)樣品中，加蓋自封口磨砂實(shí)驗(yàn)室3.結(jié)果應(yīng)乘以每個(gè)樣品的稀釋倍數(shù)16（5微升精漿加入75微升的水和沉淀4.兩組之間的差異應(yīng)在10％以內(nèi)，即（估值/估值的平均數(shù)間的差異）×5.乘以一次射精的精液體積，得到每次射出的精液中鋅濃度（毫升進(jìn)而精液中含有兩種α-葡萄糖苷酶同工酶，其中一種萄葡糖苷酶可將合成的吡喃葡萄糖苷底物轉(zhuǎn)化為在碳酸鈉條件下呈現(xiàn)黃色精液中附睪分泌的中性α-葡萄糖苷酶的測(cè)量試劑盒是可以通過商業(yè)途徑得到的。只推薦使用包括SDS和澳栗精胺的試劑盒來進(jìn)行該項(xiàng)精液中的酶檢驗(yàn)。6.用于空白對(duì)照的葡萄糖苷酶抑制劑（奧粟精胺，10mmol/L）：在10毫升的凈化水中溶解18.9mg的澳栗精胺，稀釋10倍，即加純凈水稀釋成11.以1000g離心精液分析后的剩余樣品10分鐘，收集無精子的精漿于-20°C儲(chǔ)存待分析。無精子精漿可以合并以其它樣品為以后內(nèi)部質(zhì)量管理分析用4.向其中兩份含質(zhì)控樣本中加入8μl濃度為1mm3.乘以修正系數(shù)（0.6194，見注）以獲得未稀的精漿樣本中的中性葡萄糖苷4.從每個(gè)待測(cè)樣本中減去經(jīng)奧粟精胺處理的精漿空白對(duì)照組（IU/l）的活性5.兩組之間的差異應(yīng)在10％以內(nèi)，即（估值/估值的平均數(shù)間的差異）×6.乘以一次射精的精液體積（ml得到每次射出的精液中葡萄糖苷酶的總特別是使用DNA熒光染色和尾部檢測(cè)計(jì)數(shù)法，已可進(jìn)行精子密度的測(cè)定精率和受精時(shí)間有很好的相關(guān)性(Liue用CASA分析精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)時(shí)，每個(gè)標(biāo)本中至少性和密度。檢測(cè)精子活動(dòng)力，標(biāo)本密度應(yīng)控制在2×106/具有高密度(如高于50×106/ml)精子的2、用無精子的精漿稀釋原精液樣本至其密度低于50×1數(shù)池均應(yīng)被充滿并檢測(cè)。必須檢測(cè)幾個(gè)有代表性的視野野（共12個(gè)視野）以得到可靠的結(jié)果。每個(gè)計(jì)數(shù)池至少應(yīng)2、VSL=直線速度(μm/s)。根據(jù)精子3、VAP=平均路徑速度(注：不同的CASA儀器用不同的數(shù)學(xué)運(yùn)算方法計(jì)算多項(xiàng)運(yùn)動(dòng)參數(shù)。目前所有應(yīng)用熒光DNA染色CASA可準(zhǔn)確檢測(cè)活動(dòng)精子的密度以及活動(dòng)力的百分比，但需謹(jǐn)慎應(yīng)用該技術(shù)(Garrettetal,2003)。例如，如果使用一次性計(jì)數(shù)池，因?yàn)榫映錆M計(jì)數(shù)池時(shí)分布會(huì)不均勻，故評(píng)估不同位置的精子標(biāo)本是重要的(Douglas-Hamiltonetal.,2005b)。應(yīng)用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板驗(yàn)證是必要的。密度在50×106/ml以上的需要稀釋(見35.2.2小節(jié))。方法知道精子是否完整(如頭尾相粘)。3.5.4計(jì)算機(jī)輔助精子形態(tài)學(xué)評(píng)估圖像分析在評(píng)價(jià)精子形態(tài)方面，可能帶來量化、客觀性和可重復(fù)性的重大進(jìn)展。商業(yè)系統(tǒng)可用來量化精子頭部和中段的形態(tài)，主段精子也有可能。然而，精子尾部缺陷對(duì)運(yùn)動(dòng)的影響可以更直接地通過應(yīng)用CASA檢測(cè)活動(dòng)力和運(yùn)動(dòng)狀態(tài)。CASA系統(tǒng)通常可以將精子頭和中段分為正?；虍惓?，并且給出精子頭和中段、頭部橢圓和規(guī)則性以及依賴染色檢測(cè)的頂體區(qū)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差或中位數(shù)。術(shù)人員的手動(dòng)評(píng)估。計(jì)算機(jī)輔助精子形態(tài)學(xué)評(píng)估（CASMA）結(jié)果的重現(xiàn)性和準(zhǔn)的影響。如果精子密度低（<2×106/ml需要離心濃縮標(biāo)本，如2.13.2分比及直線速度（VSL與大樣本的低生育力夫婦的自然妊DNA致密性和完整性在確定人類精子功能活性方面的重要性。新出現(xiàn)的證據(jù)建議將精子DNA完整性及染色質(zhì)組織與生育力聯(lián)合起來考慮。Aitken&Krausz,2001;Virroe程的能力，如精子-卵子透明帶結(jié)合試驗(yàn)，頂體反應(yīng)試驗(yàn)以及與卵母細(xì)胞卵黃膜細(xì)胞質(zhì)內(nèi)存在高活性的細(xì)胞質(zhì)酶，如肌酸磷酸激酶。(Raoetal.,1989;Gomezet 在人類射出的精液中，活性氧類物質(zhì)是由精子(Aitken&Clarkson,1987;的。精漿中有抗氧化物清除劑和酶，某些男性的這些物質(zhì)可能不足(Jonesetal.,能使精子更易受到氧化損害。生成高濃度的ROS可能引起過氧化損害和精子功此程序需要使用一個(gè)靈敏的照度計(jì)來檢測(cè)存在化學(xué)發(fā)光探針，如魯米諾或合物，從而能夠敏感地檢測(cè)到過氧化氫的產(chǎn)物。然而，也可以用其它探針（如lucigenin）來檢測(cè)洗滌后的人精子產(chǎn)生的活性氧類物質(zhì)（ROSAitkenetal.,formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine(FMLP)產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光信號(hào)對(duì)白細(xì)胞群是注釋1：這些探針測(cè)定精子活力的精確性還是一個(gè)有爭(zhēng)議的問題(Aitkenetal.,）：4．辣根過氧化物酶（HRP）(VI型，310IU/mg蛋白)：5mg(1550IU)溶于13．吸取400μl洗滌的精子懸液加入無酚紅的KRM混懸，后加入一個(gè)一次性照通過添加FMLP、酵母多糖或PMA刺激精液白細(xì)胞產(chǎn)生的ROS，而PMA加入20μl調(diào)理的酵母多糖至上述標(biāo)本，以刺激存在于精子懸液內(nèi)每個(gè)白細(xì)胞產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(hào)。產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(hào)的大小直接與混入白細(xì)胞的水平成比例(見圖4.1)。PMA誘導(dǎo)白細(xì)胞和精子產(chǎn)生ROS試驗(yàn)1.用DMSO以1:100的比例將PMA原液稀釋成10μmol/l工作液。2.等待至FMLP或調(diào)理的酵母多糖的信號(hào)消退。3.加4μl的10μmol/lPMA于等量的精子懸液中(終濃度為100nmol/1),刺激精子產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(hào)(見圖4.2)。圖4.2細(xì)胞懸液產(chǎn)生活性氧能力與白細(xì)胞和精子亞群的關(guān)系(a)在存在白細(xì)胞污染的情況下，加如白細(xì)胞特異探針FMLP后，產(chǎn)生一個(gè)ROS峰。繼之加入PMA,精子和白細(xì)胞群產(chǎn)生一個(gè)持久的強(qiáng)化學(xué)發(fā)光信(b)如果沒有白細(xì)胞污染，F(xiàn)MLP反應(yīng)則消失，而PMA引發(fā)一個(gè)顯著的由精子產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光信號(hào)(也見于Krauszetal.,1992)。一種稱作半卵透明帶測(cè)定法的透明帶結(jié)合試驗(yàn)(Burkmanetal.,1檢測(cè)精子用一種標(biāo)記物染色(如熒光素),而對(duì)照精子用另一種標(biāo)記物染色(如應(yīng)能通過從透明帶表面去除的精子或人透明帶分解的蛋白來評(píng)價(jià)(Liu&Baker,如鈣離子載體可誘發(fā)頂體反應(yīng)，但是結(jié)果不如由透明帶誘發(fā)的頂體反應(yīng)(Liu&Baker,1996)。頂體反應(yīng)后的頂體狀態(tài)可通過顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測(cè)(Fenichel2．頂體反應(yīng)(AR)：精子在赤道段僅有一個(gè)熒光帶，或者在頂體區(qū)無熒光著色。2.每張載玻片檢測(cè)200條精子，可獲得較低的采樣誤差。頂體反應(yīng)(AR)是精子與透明帶結(jié)合之后，發(fā)生在細(xì)胞外的過程，它一定1.含3.5%(35g/l)人血清白蛋白(HAS)的Ham·sF-10培養(yǎng)液(見附錄4,A4.44．應(yīng)用Ham,sF-10-HAS2．為確保每次新配制的染料配制適當(dāng)，必須用舊人精子與倉鼠卵母細(xì)胞融合的過程在功能上同與人卵母細(xì)胞融合的過程是繼精子-透明帶之間的相互作用后，引起頂體反應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)是鈣內(nèi)流和胞漿堿化，兩者均可由二價(jià)陽離子載體A23187人工誘發(fā)。另一種方法是使用次性吸頭吸取已經(jīng)預(yù)溫并在CO2孵箱中平衡好的礦物油覆蓋液滴，小心操作不5．計(jì)數(shù)精子密度（見2.7和2.8節(jié)）,用新鮮配制的BWW液將活動(dòng)精子密框4.1倉鼠誘導(dǎo)排卵確保注射活體動(dòng)物的流程都符合法律程序。準(zhǔn)備好合適劑量的孕馬血清射30單位PMSG給未成熟倉鼠或動(dòng)情期第一天的成熟倉鼠。48-72小時(shí)后，經(jīng)7．持住子宮最遠(yuǎn)端的位置，緊貼鑷子下方從子宮末端切斷5．室溫下，用1%胰酶（10000IU框4.2玻璃吸管的制備胺藍(lán))或核酸(吖啶橙，色霉素)結(jié)合的染料，之后用組織行評(píng)估。新方法包括一些可以評(píng)估DNA斷裂程度的試驗(yàn)，如TdT介導(dǎo)的dUTPDNA末端標(biāo)記法(TUNEL(原位末端標(biāo)記，ISEL),彗星實(shí)驗(yàn)以及精子染色質(zhì)時(shí)也與精子形態(tài)、活力和活率相關(guān)。這些試驗(yàn)可為預(yù)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)IVF的授精率提供本圖片經(jīng)SpringerScience+BusinessMedia授權(quán)，摘自Aitken等(1983)。顯得非常重要。直接用培養(yǎng)基稀釋精液后離心仍是IUI富集精子常用方法(Boomsmaetal.,2004)，但對(duì)于一些有一個(gè)或幾個(gè)參數(shù)異常精液，密度梯度離心液標(biāo)本，玻璃絨柱法可以取得與密度梯度離心法相同的效果(Rhemrevetal.,精液的參數(shù)決定應(yīng)該選擇何種精子制備方法(seeCanaleetal.,1994)。直接回收率低小于20%，而密度梯度離心回收率高大于20%。這兩種方法獲得的精分鐘。根據(jù)精子的游動(dòng)能力即能游出精漿游進(jìn)培養(yǎng)基來少，但在需要活動(dòng)精子量較少的IVF或ICSI技術(shù)中，這種所以在配制成精子處理培養(yǎng)基時(shí)必須需要調(diào)配到與女合應(yīng)用上游法和密度梯度法進(jìn)行精子制備能夠保該進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，只有未被感染的切開活檢（用或不用顯微操作）和經(jīng)皮穿刺活檢都力下離心8分鐘。離心后的逆行射精樣本和正對(duì)于不能射精或者射精障礙的病人，可以通過對(duì)陰精子冷凍保存是男科實(shí)驗(yàn)室工作中的一個(gè)重要組子免受冷凍損傷，可以將人類精子冷藏在–79℃的干冰上(Polgeetal.,1949;Bunge&herman,1953;Bungeetal.,1954)。隨著液氮廣泛應(yīng)用，人類精子冷凍貯凍存時(shí)間的延長(zhǎng)而下降。冷凍保存超過28年的精子），供精生育力保護(hù)不孕癥治療材料程序。在棉花和羊毛之間有若干聚乙烯乙醇粉末塞子的試2．最常用的程序是按照每分鐘1.5℃的速率從20℃降到–6部的液氮蒸氣和空氣的混合氣體內(nèi)籃子放置10-1加大精子的檢測(cè)數(shù)量當(dāng)然可以降低計(jì)量誤差（見表2.2、方框2.5和2.7框7.1質(zhì)量保證和質(zhì)量控制術(shù)語真正的價(jià)值估計(jì)，往往源于數(shù)個(gè)實(shí)驗(yàn)室的平均結(jié)果（目標(biāo)一個(gè)對(duì)指定值測(cè)試結(jié)果的偏差。這是在同一方向（系統(tǒng)誤observationsagainsttheirm一個(gè)自然變異，影響這一進(jìn)程的所有個(gè)人價(jià)值的來源正在一個(gè)時(shí)間序列圖顯示的一系列個(gè)人測(cè)量，包括中間線和控國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織一個(gè)設(shè)定國(guó)際化標(biāo)準(zhǔn)的機(jī)構(gòu)，包括實(shí)驗(yàn)這與計(jì)算數(shù)字的平方根成反比。抽樣誤差SE）是在一定時(shí)間內(nèi)測(cè)量值的控制圖，它用于監(jiān)控錯(cuò)誤的可能性也越小。對(duì)IQC或者IQC材料進(jìn)行監(jiān)控的一種實(shí)用方法是使用質(zhì)量控制圖。這樣就可以根據(jù)當(dāng)?shù)貥?biāo)準(zhǔn)把IQC也成為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)質(zhì)控的一部分。），A7.7提供了如何評(píng)估質(zhì)量控制涂片的形態(tài)方法。如果涂片準(zhǔn)備和儲(chǔ)存得當(dāng)，可錄影標(biāo)本的磁帶，CD或DVD，無論是從實(shí)驗(yàn)室還是EQ固定厚度，這是30分鐘的穩(wěn)定，也可使用（sofixed-depthchambers,whichareXBAR的圖表的主要目的在于發(fā)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果的誤差，或者不同的變異全面增新樣本材料應(yīng)該和前期的10份樣本一起建立新的Xbar質(zhì)控范圍員值23456789下表顯示了4名技術(shù)人員對(duì)來前10個(gè)QC樣品的精子密度測(cè)定值，以及每個(gè)樣樣品:12345678938平均差(Sbar)是:(3.27+3.70+...+3.74)/10=3.40。從見表7.1中可以得出，樣本距離均值2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)誤）為:Xbar±A2,n×Sbar=39.7±(1.085×3.40)者36.0和43.3×106/ml。同樣可以得出外控制線:Xbar±A3,n×Sbar=39.7±圖中（7.1）就可對(duì)將來的QC樣本值進(jìn)行圖表中(

)為連續(xù)測(cè)量的平均值，圖表顯示檢測(cè)值、警戒限和處置限。別突破5%和0.2%,成為為未來樣本的一個(gè)隨機(jī)單獨(dú)變量。這些限制由x2分布從表7.2來看，Sbar平均樣本標(biāo)準(zhǔn)偏離是3.40×106/ml,從表7.1來看對(duì)于n為4的最低處置值是sa,n。失控(見7.8節(jié))。某個(gè)百分比例p的標(biāo)準(zhǔn)差的估計(jì)值為p(100-p)/N(如果百分比在20%-80%之間變化),(朱曉斌)1.單點(diǎn)在3倍標(biāo)準(zhǔn)差范圍外，這是個(gè)被普遍認(rèn)可簡(jiǎn)單的規(guī)則，表明在過程中6.連續(xù)8個(gè)點(diǎn)都在中心線的同一側(cè)，這條規(guī)則很具吸引力，因?yàn)槠浜?jiǎn)單適用在操作中，從第一條到最后一條都是被普遍認(rèn)可的，如果某QC樣本值被判定為“不合格”,其敏感度警示能給出誤差的不同類型(隨機(jī)性或系統(tǒng)性),從而框7.50C圖的基本控制原則框7.50C圖的基本控制原則1.樣本混勻不足(常見粘稠或凝集);2.技術(shù)員緊張(計(jì)數(shù)不穩(wěn)定或記錄錯(cuò)誤);這些識(shí)別問題的過程，設(shè)計(jì)和測(cè)試1個(gè)假使用新鮮標(biāo)本進(jìn)行測(cè)定的QC程序類似于采用儲(chǔ)存的樣本，并允許技術(shù)員之圖7.3人工和計(jì)算機(jī)輔助精液分析精液分析)/2結(jié)果均值的差異點(diǎn)圖。均值(%)數(shù)據(jù)由HWGBaker提供2.計(jì)算均值和標(biāo)準(zhǔn)差的差異，由于同份標(biāo)本被2位技術(shù)員分析，之間均值差異應(yīng)為零，由零的任何顯著性差異，需配對(duì)進(jìn)行t-檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)這2位技術(shù)員間的偏差(系統(tǒng)差異)。3.針對(duì)兩份標(biāo)本每次檢測(cè)結(jié)果繪圖(Youden繪),比較幾位技術(shù)員對(duì)濃度的測(cè)定，每次檢測(cè)2個(gè)單獨(dú)的標(biāo)本，類似如圖7.4。每個(gè)技術(shù)員(稱為IQC)或每個(gè)實(shí)驗(yàn)室(稱為EQC),每次兩個(gè)標(biāo)本測(cè)量值均繪制。橫向虛線和垂直虛線是有經(jīng)驗(yàn)技術(shù)員(IQC)或?qū)嶒?yàn)室(EQC)測(cè)定結(jié)果95%可信限。有效值均落在這些虛線交匯的范圍內(nèi)。標(biāo)1顯示隨機(jī)誤差即1份標(biāo)本測(cè)定值在有效范圍內(nèi)而另1份不在，當(dāng)系統(tǒng)誤差即2份標(biāo)本測(cè)定值都太高(右上角標(biāo)2)或都太低(左下角標(biāo)2)。1份標(biāo)本測(cè)定值太高或另份測(cè)定值太高的隨機(jī)誤差(標(biāo)3)。圖7.4Youden繪精子密度評(píng)估圖由多位技術(shù)員分析2份精子標(biāo)本，對(duì)每次檢測(cè)結(jié)果標(biāo)繪，每個(gè)技術(shù)員(或?qū)嶒?yàn)室，EQC)的結(jié)果用不同符號(hào)和顏