3.2基因工程的基本操作程序課件高二下學(xué)期生物人教版（2019）選擇性必修3

DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定一、實(shí)驗(yàn)原理PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）：DNA的半保留復(fù)制PCR利用了DNA的熱變性的原理，通過(guò)調(diào)節(jié)溫度來(lái)控制DNA雙鏈的解聚與結(jié)合。一、實(shí)驗(yàn)原理瓊脂糖凝膠電泳：瓊脂糖凝膠電泳是常用的分離、鑒定DNA的方法，這種電泳方法以瓊脂糖凝膠作為支持物，利用DNA分子在泳動(dòng)時(shí)的電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，達(dá)到分離混合物的目的。瓊脂糖是一種天然聚合長(zhǎng)鏈狀分子，沸水中溶解，45℃開(kāi)始形成多孔性剛性濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。分子篩效應(yīng)：分子的大小和形狀不同，通過(guò)一定分子孔徑分離時(shí)因受阻的程度不同而表現(xiàn)出不同的遷移速率DNA分子可發(fā)生兩性解離。當(dāng)電泳緩沖液的pH大于其等電點(diǎn)時(shí)，DNA分子帶負(fù)電；當(dāng)電泳緩沖液的pH小于其等電點(diǎn)時(shí)，DNA分子帶正電。

一般使用的電泳緩沖液的pH為8，

DNA分子帶負(fù)電，向正極泳動(dòng)DNA分子在堿性環(huán)境中帶負(fù)電荷，在外加電場(chǎng)作用下向正極泳動(dòng)。一、實(shí)驗(yàn)原理瓊脂糖凝膠電泳：瓊脂糖凝膠電泳是常用的分離、鑒定DNA的方法，這種電泳方法以瓊脂糖凝膠作為支持物，利用DNA分子在泳動(dòng)時(shí)的電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，達(dá)到分離混合物的目的。在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速率取決于分子篩效應(yīng)，即分子本身的大小和構(gòu)象。1、配置反應(yīng)體系課程導(dǎo)入課程導(dǎo)入10倍濃縮的擴(kuò)增緩沖液5uL20mmol/L的4種脫氧核苷酸的等量混合液1uL20umol/L的引物I2.5uL20umol/L的引物Ⅱ2.5uLH2O28~33ul1-5U/uL的TaqDNA聚合酶1~2U模板DNA(用量為1pg-1ug)5~10uL總體積50uLU:酶活性單位(在最適溫度下，每分鐘內(nèi)催化1umol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量定位一個(gè)活力單位)（含Mg2+)(dNTP)二、實(shí)驗(yàn)步驟微量移液器課程導(dǎo)入————調(diào)節(jié)輪————推動(dòng)按鈕——-卸尖按鈕————-容量視窗————卸尖器————-活塞桿————-移液尖（吸頭）6個(gè)步驟1、容量設(shè)定2、吸液槍頭安裝3、預(yù)洗吸液槍頭4、吸液5、放液6、卸去吸液槍頭2、離心課程導(dǎo)入課程導(dǎo)入離心：所有組分加入完畢后，蓋嚴(yán)離心管蓋，并將其放入離心機(jī)中，離心約10s中，使反應(yīng)液混勻并集中在離心管底部。（提高反應(yīng)速率）離心？3、設(shè)置PCR儀的循環(huán)程序3、設(shè)置PCR儀的循環(huán)程序課程導(dǎo)入預(yù)變性？循環(huán)程序變性復(fù)性延伸預(yù)變性94℃，5min——30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次94℃，1min55℃，30s72℃，1min使DNA充分變性以利于引物更好的與模板結(jié)合課程導(dǎo)入PCR的循環(huán)程序第一次循環(huán)第二次循環(huán)第三次循環(huán)4、配置瓊脂糖溶液根據(jù)待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質(zhì)量體積比0.8%-1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內(nèi)加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的核酸染料（溴化乙錠EB）混勻。溴化乙錠在紫外光照射下能發(fā)射熒光，當(dāng)DNA樣品在瓊脂糖凝膠中從負(fù)極向正極泳動(dòng)時(shí)，溴化乙錠從正極向負(fù)極移動(dòng)，這樣溴化乙錠分子就會(huì)嵌入DNA分子中形成絡(luò)合物，使DNA在紫外光下發(fā)射很強(qiáng)的熒光。在溴化乙錠足夠的情況下，熒光的強(qiáng)度正比于DNA的含量，這樣就可以檢測(cè)DNA的濃度。4、配置瓊脂糖溶液：jiangwe5、制備凝膠：jiangwe制備凝膠：5、將溫?zé)岬沫傊侨芤貉杆俚谷肽＞?，并插入合適大小的梳子，形成加樣孔。6、待凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳7、將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒(méi)過(guò)凝膠1mm為宜（檢查有無(wú)氣泡）電泳指示劑：溴酚蘭在堿性液體中呈紫蘭色，凝膠載樣緩沖液作用：①增加樣品比重，以確保DNA均勻沉入加樣孔內(nèi)。②形成肉眼可見(jiàn)的指示帶，預(yù)測(cè)核酸電泳的速度和位置。③使樣品呈色，使加樣操作更方便。8、加樣：一般與蔗糖、甘油或聚蔗糖400組成上樣緩沖液。jiangwe8、加樣：將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖液(內(nèi)含指示劑)混合，留一個(gè)加樣孔加入指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物。再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內(nèi)。jiangwe8、加樣：將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖液(內(nèi)含指示劑)混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內(nèi)。留一個(gè)加樣孔加入指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物。jiangwe9、電泳：接通電源，根據(jù)電泳槽陽(yáng)極至陰極之間的距離來(lái)設(shè)定電壓一般為1~5V/cm。待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時(shí)，停止電泳。(一般向正極移動(dòng))jiangwe三、觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果：取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相課程導(dǎo)入瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果在本實(shí)驗(yàn)中，主要考慮DNA分子的遷移速率與其大小成反比。課程導(dǎo)入未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶可能原因：四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析1、模板DNA含有雜蛋白或TaqDNA聚合酶的抑制劑（如蛋白酶K、苯酚、EDTA)?；2、TaqDNA聚合酶失活；3、引物出現(xiàn)質(zhì)量問(wèn)題，濃度不合適;4、Mg離子濃度過(guò)低;5、變性溫度低，變性時(shí)間短；等等。課程導(dǎo)入出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增條帶可能的原因：四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析1、模板DNA出現(xiàn)污染;2、TaqDNA聚合酶出現(xiàn)質(zhì)量問(wèn)題;3、Mg離子濃度過(guò)高；4、退火溫度（復(fù)性時(shí)的溫度）過(guò)低；5、PCR循環(huán)次數(shù)過(guò)多；等等。課程導(dǎo)入注意事項(xiàng)1.為避免外源DNA等因素的污染，PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌處理。

2.該實(shí)驗(yàn)所需材料可以直接從公司購(gòu)買(mǎi)，緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在-20

℃儲(chǔ)存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。

3.在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時(shí)，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。

4.

在進(jìn)行操作時(shí)，一定要藏好一次性手套。

避免反復(fù)凍融核酸檢測(cè)課程導(dǎo)入新型冠狀病毒核酸檢測(cè)：在進(jìn)行新型冠狀病毒核酸檢測(cè)時(shí)，主要是使用一次性棉簽經(jīng)口腔或鼻腔來(lái)采取深處的細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。醫(yī)護(hù)人員會(huì)將患者的采集標(biāo)本進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)，如果檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，則代表感染了新型冠狀病毒。如果檢測(cè)結(jié)果為陰性，則代表沒(méi)有感染新型冠狀病毒。

RT-PCR：先得到RNA，反轉(zhuǎn)錄成DNA，再PCR。

應(yīng)用刑事案件中的運(yùn)用：應(yīng)用PCR技術(shù)對(duì)多態(tài)DNA位點(diǎn)分型，使犯罪現(xiàn)場(chǎng)生物物證