2第二章-生物制藥工藝基礎(chǔ)

第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)

Basisofbiopharmaceuticaltechnology

生化制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)微生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)生物技術(shù)制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)生物制藥中試放大工藝設(shè)計(jì)生物藥物的研究與新藥申報(bào)本章學(xué)習(xí)目標(biāo)掌握：生化活性物質(zhì)的提取、分離和純化；

微生物菌種選育和培養(yǎng)。熟悉：生物材料的來源和預(yù)處理，濃縮和干燥。了解：生物技術(shù)制藥工藝的技術(shù)基礎(chǔ)，

中試放大工藝的概念。天然生化藥物：第一節(jié)生化制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)原料：人體組織、動(dòng)物、植物、微生物、海洋生物手段：生物化學(xué)原理、方法生物分離工程技術(shù)第一節(jié)生化制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)一、生物材料：1.動(dòng)物臟器2.血液、分泌物和其他代謝物，如尿液、膽汁、蛇毒等3.海洋生物4.植物5.微生物，細(xì)菌、真菌、放線菌、酵母菌1.動(dòng)物臟器（1）胰臟（激素、酶、多肽、核酸、多糖、氨基酸等）（2）腦（腦磷脂、肌醇磷脂、神經(jīng)磷脂、神經(jīng)肽等）（3）胃粘膜（胃蛋白酶、膠原蛋白酶、胃泌素、胃膜素）（4）肝臟（酶系、維生素、磷脂類、膽固醇）（5）脾臟（免疫器官，淋巴細(xì)胞）（6）小腸（糖蛋白、核苷酸酶、溶菌酶、胃腸道激素）（7）腦垂體（各種激素）（8)心臟（細(xì)胞色素C、輔酶Q10）2.血液、分泌物和其它代謝物（1）血液制品：人血制劑、抗凝血酶Ⅲ，凝血因子Ⅷ，纖維蛋白原，免疫球蛋白、人血漿、干擾素、白介素等（2）尿液、膽汁（3）蛇毒、蜂毒也是重要的生物材料蜂毒蜂毒是一種成分復(fù)雜的混合物，它除了含有大量水分外，還含有苦干種蛋白質(zhì)多肽類、酶類、組織胺、酸類、氨基酸及微量元素等蜂毒的臨床應(yīng)用

1.結(jié)締組織疾?。L(fēng)溫病和類風(fēng)溫性關(guān)節(jié)炎）

2.神經(jīng)炎和神經(jīng)痛（坐骨神經(jīng)痛、三叉神經(jīng)痛、枕神經(jīng)痛、背神經(jīng)根炎）

3.心血管疾病（高血壓動(dòng)脈粥樣硬化癥、靜脈血栓形成、血栓閉塞性脈管炎和動(dòng)脈內(nèi)膜炎）

4.變應(yīng)性疾?。褐夤芟?.海洋生物（1）海藻（2）腔腸動(dòng)物?？舅兀?）節(jié)肢動(dòng)物甲殼素（4)軟體動(dòng)物多糖、多肽、毒素（5）棘皮動(dòng)物海星、海膽、海參海參素抗癌（6）魚類魚油、多種激素、毒素，硫酸軟骨素（7）爬行動(dòng)物龜滋陰養(yǎng)腎抗腫瘤（8）海洋哺乳動(dòng)物鯨魚魚肝油4.植物生物堿、強(qiáng)心甙、黃酮、皂甙、揮發(fā)油、樹脂、鞣質(zhì)等。青蒿素（Qinghaosu,arteannuin）我國科學(xué)家從黃花蒿Artemisiaannua

L.葉中得到的新型抗瘧疾倍半萜過氧化物1977年3月首次發(fā)表了其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)2002年4月復(fù)方蒿甲醚被列入WHO第12版基本藥物名錄的核心目錄中國發(fā)現(xiàn)者屠呦呦因此獲2015諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。5.微生物----微生物菌體細(xì)胞內(nèi)提取物細(xì)菌（1）氨基酸（2）有機(jī)酸檸檬酸、蘋果酸、乳酸（3）糖類葡聚糖、聚果糖、聚甘露糖、脂多糖。（4）核苷酸類5‘－AMP，5’－肌苷酸（5）維生素VB1,VB2，VB6,Vc（6）酶淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、彈性蛋白酶放線菌在自然界分布廣泛，主要以孢子或菌絲狀態(tài)存在于土壤、空氣和水中，尤其是含水低、有機(jī)物豐富、中性或微堿性的土壤中土壤特有的泥腥味，主要是放線菌的代謝產(chǎn)物所致。（1）抗生素

最重要的抗生素產(chǎn)生菌，已有1000多種抗生素約70%產(chǎn)自放線菌。鏈霉菌（2）氨基酸（3）核苷酸（4）維生素VB12等（5）

酶蛋白酶、淀粉酶、和纖維素酶等真菌（1）

酶（2）有機(jī)酸（3）氨基酸（4）核酸及有關(guān)物質(zhì)（5）維生素（6)促生素（7）多糖酵母菌（1）維生素（2）蛋白質(zhì)與多肽（3）核酸青霉素1928年，亞歷山大·弗萊明的幸運(yùn)發(fā)現(xiàn)弗萊明研究葡萄球菌，有一天他的一個(gè)培養(yǎng)皿中長了一個(gè)霉菌斑，使弗萊明感到驚訝的是，在青霉菌的近旁，葡萄球菌忽然不見了。霉菌滲出了什么強(qiáng)有力的物質(zhì)？弗萊明稱為青霉素他設(shè)法培養(yǎng)這種霉菌進(jìn)行多次抑菌試驗(yàn)1929年，弗萊明發(fā)表了他的研究成果，遺憾的是未受到科學(xué)界的重視。1938年，德國化學(xué)家恩斯特錢恩青霉素提純實(shí)驗(yàn)。1940年，弗洛里和錢恩用青霉素進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

二、生物材料的選擇：

1．原則：有效成分含量高，原料新鮮、無污染，來源豐富、易得、低廉，雜質(zhì)含量少、便于分離純化。2．生物材料的采集、質(zhì)控與預(yù)處理

（1）品種鑒定，并注意該生物自然分布區(qū)域；（2）防止污染與感染；（3）采集后快速及時(shí)速凍處理；（4）冷凍保存。

三、生物活性物質(zhì)的提取

（一）幾種常用提取方法

1．酸、堿、鹽水溶液提取方法→水溶性、鹽溶性活性物質(zhì)

2．表面活性劑提取方法→提取膜結(jié)合酶

3．有機(jī)溶劑提取→水不溶性活性物質(zhì)常用有機(jī)溶劑：甲醇、乙醇、丙酮、丁醇以及乙醚、氯仿

4.雙水相萃取法

5．超臨界流體萃取法

生物活性物質(zhì)存在部位：胞內(nèi)、胞外、胞漿、質(zhì)膜、器膜等。（二）提取方法與優(yōu)化

1.溶劑選擇

2.選擇添加劑①緩沖系統(tǒng)②保護(hù)劑；③酶抑制劑。

3.提取條件①溫度；②pH；③鹽；④表面活性劑。生物材料及其生化活性物質(zhì)特性：溶解性質(zhì)、分子量、等電點(diǎn)、存在方式、穩(wěn)定性、相對密度、粒度、粘度，目的物含量、主要雜質(zhì)種類及溶解性質(zhì)、有關(guān)酶類特征等四、生化活性物質(zhì)濃縮與干燥

1.濃縮方法：①鹽析，中性鹽硫酸銨沉淀蛋白（酶）；②有機(jī)溶劑沉淀，生物大分子溶液中加入乙醇、丙酮等，沉淀生物大分子；③高分子脫水，常用高分子材料葡聚糖凝膠、聚乙二醇；④超濾，利用不同孔徑的超濾膜；⑤真空減壓濃縮或薄膜濃縮優(yōu)點(diǎn)是生產(chǎn)規(guī)模大、蒸發(fā)溫度低、速度快，目的是除去揮發(fā)性溶劑，保持物料生物活性，加速蒸發(fā)原理是使液體形成薄膜，增加氣化表面積。生化活性物質(zhì)的熱不穩(wěn)定性世界上最大的具有80m2蒸發(fā)面積的薄膜蒸發(fā)器。薄膜蒸發(fā)器

實(shí)驗(yàn)室常用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。2.干燥

使物質(zhì)從固體或半固體狀經(jīng)除去存在的水分或它種溶劑，從而獲得干燥物品的過程。

干燥的目的：

a.提高穩(wěn)定性，便于貯存、運(yùn)輸；

b.有一定的規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)；

c.便于進(jìn)一步處理。干燥物料中三種水：表面水、毛細(xì)管中水、細(xì)胞內(nèi)水。干燥應(yīng)緩慢進(jìn)行，使各種存在水逐步去除。干燥速度在溫度和壓力不變時(shí)取決于液體到達(dá)表面的速度。物質(zhì)在空氣中的干燥度，即物質(zhì)平衡濕度，在一定條件下是不變值。干燥方法

①低溫真空干燥，在密閉容器中減壓干燥，產(chǎn)品疏松、易粉碎；

②噴霧干燥，物質(zhì)先濃縮成一定濃度

液體，經(jīng)噴霧后形成霧滴（極大的表面），

產(chǎn)品為粉狀；

③冷凍干燥，在低溫、低壓下，利用

升華性能，包括預(yù)冷凍、升華和再干燥。

實(shí)驗(yàn)室真空冷凍干燥機(jī)

五、生化活性物質(zhì)的分離與純化1.生化制藥工藝中分離純化特點(diǎn):

(1)生物材料組成復(fù)雜

(2)目的物含量低

(3)生物活性成分易變性、失活

(4)涉及各種參數(shù)，分離方法有很大經(jīng)驗(yàn)成分

(5)溫和的“多階式”方法，逐級分離（目的是保護(hù)目的物活性和結(jié)構(gòu)完整性）

(6)產(chǎn)品驗(yàn)證與化學(xué)上純度概念不完全相同（生物分子環(huán)境反應(yīng)敏感，結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系復(fù)雜）2.分離純化原理

(1)根據(jù)分子形狀與分子大小，如差速離心、膜分離、凝膠過濾

(2)根據(jù)電荷差異，如離子交換、電泳等

(3)根據(jù)分子極性與溶解度大小，如溶劑提取、分配層析、鹽析、有機(jī)溶劑沉淀等

(4)根據(jù)吸附特性，如選擇性吸附、吸附層析法

(5)根據(jù)生物配基特性，如親和層析3.分離純化基本程序與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

生物體內(nèi)某組分，特別是未知結(jié)構(gòu)組分的分離制備設(shè)計(jì)：

(1)確定制備物的研究目的，并建立相應(yīng)的分析鑒定方法

(2)制備物的理化性質(zhì)和穩(wěn)定性預(yù)備試驗(yàn)

(3)材料處理及抽提方法的選擇

(4)分離純化方法的摸索（優(yōu)劣指標(biāo)：產(chǎn)品重量與活性平衡，如酶比活力與溶液中蛋白濃度比例）

(5)產(chǎn)物均一性測定（均一性：所獲得的制備物只具有一種完全相同的成分）4.分離純化方法選擇原則（1）粗品分離：大處理量,相對低分辨率。鹽析，分級沉淀，萃取，超濾。（2）精制：高分辨率。多種色譜層析法,親和層析，HPLC，F(xiàn)PLC（快速蛋白液相色譜），電泳或等電聚焦。

第二節(jié)微生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)

一、菌種的分離與篩選1．含菌樣品收集2.富集培養(yǎng)：“投其所好”，“取其所抗”3.菌種純化：（1）平板劃線法（2）稀釋平板法4.性能測定（菌種復(fù)篩）

（1）平板劃線法是將微生物樣品在固體培養(yǎng)基表面多次作“由點(diǎn)到線”稀釋而達(dá)到分離的目的。固體培養(yǎng)基四區(qū)劃法接種法步驟：

步驟一：接種針先以火焰滅菌法滅菌。

步驟二：輕觸營養(yǎng)平板上無菌的瓊脂處冷卻。

步驟三：以接種針輕觸菌落，使接種針上沾有細(xì)菌。

步驟四：更換一個(gè)新的無菌營養(yǎng)平板。

步驟五：將接種針上的細(xì)菌劃于一個(gè)新的營養(yǎng)平板上。此為第一菌區(qū)。

（2）稀釋平板法是將樣品進(jìn)行適當(dāng)稀釋，然后將稀釋液涂布于培養(yǎng)基平板上進(jìn)行培養(yǎng)，待長出獨(dú)立的單個(gè)菌落，進(jìn)行挑選分離。二、菌種的選育與保藏1．自然選育

依據(jù)自發(fā)突變原理，通過不斷分離、篩選，除去衰變菌落，從中選擇維持原有生產(chǎn)水平的菌株或高產(chǎn)突變株，達(dá)到純化、復(fù)壯、穩(wěn)定生產(chǎn)目的。單孢子菌懸液的制備→分離→單菌落培養(yǎng)→篩選

2．誘變育種指有意識地將生物體暴露于物理的、化學(xué)的或生物的一種或多種誘變因子，促使生物體發(fā)生突變，進(jìn)而從突變體中篩選具有優(yōu)良性狀的突變株的過程。（1）出發(fā)菌株的選擇①純種菌株②具備優(yōu)良性狀的菌株③對誘變劑敏感④菌種生理狀態(tài)及生長發(fā)育時(shí)間（2）誘變處理:

①化學(xué)誘變②物理誘變③生物誘變（噬菌體）（3）篩選：①隨機(jī)篩選；②理性化篩選①隨機(jī)篩選：菌種經(jīng)誘變處理后，進(jìn)行平板分離，經(jīng)培養(yǎng)后隨機(jī)挑選單菌落，從中篩選出具有優(yōu)良性狀的菌株。搖瓶篩選法篩選自動(dòng)化和篩選工具微型化②理性化篩選：是應(yīng)用遺傳學(xué)和生物化學(xué)的原理，根據(jù)已知或可能的目的產(chǎn)物生物合成途徑的調(diào)控機(jī)制和產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)篩選方法，定向選出有效的性狀突變株。

根據(jù)微生物代謝產(chǎn)物的不同，其理化篩選的方法也不同。初級代謝產(chǎn)物高產(chǎn)菌株的篩選方法次級代謝產(chǎn)物（主要是抗生素）高產(chǎn)菌株的篩選方法3、現(xiàn)代菌種選育技術(shù)①雜交育種②原生質(zhì)體融合③基因工程技術(shù)

雜交育種將兩個(gè)基因型不同的菌株經(jīng)接合使遺傳物質(zhì)重新組合，從中分離和篩選出具有新性狀菌株的過程。獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)：1、遺傳物質(zhì)進(jìn)行交換和重新組合，改變親株的遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)、擴(kuò)大變異范圍，獲得新品種。2、獲得新遺傳特性的重組體，可克服因長期誘變造成的生活力下降、代謝緩慢等缺陷，還可提高對誘變劑的敏感性。原生質(zhì)體融合育種

原生質(zhì)體融合基因工程育種將某一生物體的遺傳信息在體外經(jīng)人工與載體相連（重組），構(gòu)成重組DNA分子，然后轉(zhuǎn)入另一微生物（受體）細(xì)胞中，使外源DNA片段在后者內(nèi)部得以表達(dá)和遺傳，篩選獲得具有新性狀菌株的過程。1、主要用于表達(dá)多肽、蛋白類產(chǎn)品。2、不適用一些受多基因控制、代謝途徑未完全確證的產(chǎn)品。4.菌種保藏（1）保存目的：防止退化（2）菌種退化檢查方法（3）菌種退化防止方法①防止基因突變：如低溫保藏②采用雙重缺陷型③制作平行的菌種斜面，少傳代④分離單菌落，自然篩選⑤選擇培養(yǎng)條件（4）菌種保藏方法：①斜面保藏法②液體石蠟保藏法③沙土管保藏法④麩皮保藏法⑤冷凍干燥保藏法⑥液氮超低溫保藏法

⑦甘油保藏法⑧孢子濾紙保藏法三、微生物的培養(yǎng)1．微生物生長6大營養(yǎng)要素（1）碳源：提供微生物生長所需碳元素的營養(yǎng)源（2）氮源：提供微生物生長所需氮元素的營養(yǎng)源（3）能源：為微生物生命活動(dòng)提供最初能量來源的營養(yǎng)物或輻射能（4）生長因子：微生物生長代謝必需且不能自行合成的有機(jī)物（5）無機(jī)鹽：磷、硫、鉀、鎂等（6）水2．微生物培養(yǎng)基–

具備6大營養(yǎng)要素合成:成分明確,穩(wěn)定,營養(yǎng)單一,價(jià)格高,用于實(shí)驗(yàn)研究組成物質(zhì)天然:成分復(fù)雜,營養(yǎng)豐富,價(jià)格低,來源豐富,工業(yè)使用按狀態(tài)固體:適用于菌種分離和保存半固體:在液體培養(yǎng)基中加入瓊脂，用于鑒定菌種液體:發(fā)酵工業(yè)大規(guī)模使用按用途孢子:供菌種繁殖孢子使用的固體培養(yǎng)基種子:一、二級種子罐的培養(yǎng)基和搖瓶培養(yǎng)基發(fā)酵:可供菌種生長、繁殖和合成產(chǎn)物培養(yǎng)基：人工配制的適合于不同微生物生長繁殖或產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的營養(yǎng)基質(zhì)。培養(yǎng)基的種類3．滅菌與除菌（1）加熱滅菌，高壓蒸汽滅菌，121℃、20min或115℃、30min（2）輻射滅菌，紫外線滅菌（3）過濾除菌：為不耐熱成分，濾膜過濾等（4）化學(xué)滅菌：乙醇、環(huán)氧乙烷等、甲醛、新潔爾滅（5）無機(jī)鹽：磷、硫、鉀、鎂等（6）水四、發(fā)酵過程控制1．主要控制參數(shù)（1）物理參數(shù)：溫度、壓力、轉(zhuǎn)速、空氣流量、粘度、濁度、料液流量等（2）化學(xué)參數(shù)：pH、基質(zhì)濃度、溶氧濃度、氧化還原電位、產(chǎn)物濃度、廢氣中氧濃度和CO2濃度、關(guān)鍵酶活性等（3）生物參數(shù)：菌絲形態(tài)、菌體濃度2．發(fā)酵方式（1）分批發(fā)酵：在一封閉培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)含有初始限制量的基質(zhì)的培養(yǎng)方法。延遲期、對數(shù)生長期、穩(wěn)定期和衰亡期。（2）補(bǔ)料分批發(fā)酵：分批培養(yǎng)過程中，連續(xù)地或間歇地補(bǔ)加培養(yǎng)基（或某營養(yǎng)），而不從發(fā)酵罐中，間斷地放出培養(yǎng)液。（3）連續(xù)發(fā)酵：培養(yǎng)基料液連續(xù)輸入發(fā)酵罐，并同時(shí)放出含有產(chǎn)品的發(fā)酵液的過程。3．發(fā)酵過程的重要影響參數(shù)與控制（1）溫度控制：最適生長溫度，最適發(fā)酵溫度。

加熱、冷卻。（2）pH控制：pH影響微生物生長和酶活性。

緩沖體系、直接補(bǔ)加酸或堿。（3）溶氧控制：

溶氧影響菌體生長和產(chǎn)物合成。

臨界氧濃度和最適氧濃度。通氣、攪拌。（4）泡沫控制：

培養(yǎng)基中蛋白類表活劑存在，通氣攪拌易形成泡沫，影響菌體呼吸、生長代謝，泡沫逃逸還會增加染菌機(jī)會。

機(jī)械消泡，添加消泡劑（豆油、聚醚消泡劑等）。1、基因工程制藥技術(shù)基礎(chǔ)

基因工程藥物制造過程的主要程序是：

獲得目的基因→構(gòu)建DNA重組體→將重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞→鑒定篩選陽性克隆→構(gòu)建基因工程細(xì)胞→培養(yǎng)工程細(xì)胞→分離純化表達(dá)產(chǎn)物→除菌過濾→半成品檢定制劑→成品檢定→包裝

第三節(jié)生物技術(shù)藥物制造技術(shù)基礎(chǔ)

一、重組DNA技術(shù)原理2．基因工程操作過程：

（1）獲得目的基因；（2）構(gòu)建DNA重組體；（3）將重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞；（4）篩選陽性克隆與鑒定；（5）基因工程菌中，目的基因擴(kuò)增與蛋白表達(dá)。

二、基因工程主要操作技術(shù)1．目的基因的獲得基因組文庫中獲得cDNA文庫中獲得PCR擴(kuò)增法化學(xué)合成方法中獲得（1）cDNA文庫

純化目的mRNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA①mRNA的分離②cDNA第一鏈的合成③cDNA第二鏈的合成④cDNA與載體連接⑤轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化⑥篩選目的克隆目的基因的獲得：cDNA文庫（2）PCR法或逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）

典型PCR反應(yīng)包括:①模板變性94℃以上（1～2′）②退火50～55℃（10~30s）③延伸72℃（1kb/min）在高溫聚合酶作用下，以DNA單鏈為模板，由引物起始從5′→3′

延伸。No.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon30次循環(huán)后靶序列擴(kuò)增的數(shù)量（3）化學(xué)合成法

在已知DNA序列或多肽的一般結(jié)構(gòu)時(shí)，如鏈長在60bp～100bp可用化學(xué)合成法直接合成DNA。2．DNA重組體的構(gòu)建根據(jù)宿主菌不同，選擇基因載體（Vector）（1）E.coli：質(zhì)粒非表達(dá)型pBR322，表達(dá)型pUC，實(shí)用型pBV220，PET系統(tǒng)，λ噬菌體DNA作為載體，非表達(dá)型λgt10，表達(dá)型λgt11。（2）芽孢桿菌：pUB110pE194和pC194（3）鏈霉菌：pIJ101pSG5

目的基因與載體連接方法①黏端連接法②平端連接法③TA克隆

頭部

尾尾部纖維

蛋白衣殼λ噬菌體3.將重組DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞采用特定的方法將重組DNA分子轉(zhuǎn)移至適當(dāng)受體細(xì)胞并與之同步增殖（1）DNA重組體導(dǎo)入微生物細(xì)胞的方法轉(zhuǎn)化作用：微生物細(xì)胞直接吸收外源DNA的過程轉(zhuǎn)導(dǎo)作用：通過溫和噬菌體顆粒的釋放和感染將重組DNA

轉(zhuǎn)移至宿主內(nèi)（2）DNA重組體導(dǎo)入動(dòng)植物細(xì)胞的方法物理方法：顯微注射、基因槍、電穿孔化學(xué)方法：磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體法生物學(xué)方法：反轉(zhuǎn)錄病毒法、原生體融合法4.鑒定帶有目的基因的克隆從大量細(xì)胞繁殖群體中篩選出克隆有重組DNA分子的寄主細(xì)胞根據(jù)遺傳表型差異進(jìn)行篩選根據(jù)重組子的結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行篩選

抗性篩選菌落形態(tài)……

5．重組體的表達(dá)系統(tǒng)將目的基因克隆至適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體使其在新的遺傳背景下獲得活性表達(dá)得到特定目的物質(zhì)（1）原核表達(dá)系統(tǒng)

①E.coli；②芽孢桿菌Bacillus；③鏈霉菌Streptomyces

優(yōu)點(diǎn)：易大量生產(chǎn)，成本低，周期短

缺點(diǎn)：多為胞內(nèi)表達(dá)、提取困難，易生成包含體、含起始密碼Met（AUG），有內(nèi)毒素毒性。大腸桿菌枯草芽孢鏈霉菌（2）真核表達(dá)系統(tǒng)

①酵母表達(dá)畢赤酵母（Pichiapsatoris）受甲醇誘導(dǎo)。優(yōu)點(diǎn)：易培養(yǎng)無毒性，易高密度發(fā)酵（100g/L），高表達(dá)，成本低，產(chǎn)物可糖基化，有分泌表達(dá)。

②動(dòng)物細(xì)胞哺乳動(dòng)物細(xì)胞——CHO（倉鼠細(xì)胞）昆蟲細(xì)胞——家蠶細(xì)胞酵母細(xì)胞6．表達(dá)產(chǎn)物的純化包含體inclusionbodies:大部分是表達(dá)產(chǎn)物，（還有細(xì)胞蛋白和膜蛋白）一級結(jié)構(gòu)正確、無活性，不溶于水，可用變?nèi)軇㏒DS尿素，鹽酸胍溶解，再稀釋透析除去變性劑，使其復(fù)性。三、動(dòng)物細(xì)胞工程制藥技術(shù)基礎(chǔ)1、供生產(chǎn)生物技術(shù)藥物的動(dòng)物細(xì)胞（1）非基因工程動(dòng)物細(xì)胞原代細(xì)胞：直接取自動(dòng)物組織器官，經(jīng)分散、消化制得的細(xì)胞懸液。二倍體細(xì)胞系：原代細(xì)胞經(jīng)傳代、篩選、克隆得到特性強(qiáng)化細(xì)胞株。染色體仍是2n模型。轉(zhuǎn)化細(xì)胞系：經(jīng)某個(gè)轉(zhuǎn)化過程形成，染色體變成異倍體，具有無限繁殖能力。（2）基因工程細(xì)胞雜種細(xì)胞：動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)構(gòu)建成的，自然或人工將兩個(gè)或幾個(gè)不同動(dòng)物細(xì)胞合并成的一個(gè)雙核或多核細(xì)胞。雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)單克隆抗體重組細(xì)胞：表達(dá)載體構(gòu)建、表達(dá)載體導(dǎo)入、表達(dá)細(xì)胞株篩選2、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)營養(yǎng)（培養(yǎng)液）、氣體（CO2培養(yǎng)箱）、pH、溫度、水質(zhì)、滲透壓、無菌（1）懸浮培養(yǎng)：細(xì)胞自由懸浮在培養(yǎng)基中生長增殖。細(xì)胞密度較低（2）貼壁培養(yǎng)：細(xì)胞附在某種介質(zhì)上生長繁殖的培養(yǎng)方法。傳質(zhì)、傳氧差（3）微載體培養(yǎng)：細(xì)胞附在微小顆粒載體上生長繁殖的培養(yǎng)方法。載體比表面積大、比重小，輕度攪拌可自由懸浮。貼壁-懸浮培養(yǎng)法3、動(dòng)物細(xì)胞種質(zhì)保存種質(zhì)形式：（1）組織塊（2）細(xì)胞懸浮物（3）細(xì)胞單層培養(yǎng)物保存方式：（1）常溫法：20~30℃，單層細(xì)胞可保存2周~1個(gè)月（2）低溫法：4℃，可保持1個(gè)月（3）超低溫冰凍法：-70℃以下冰箱或液氮中，甘油、二甲基亞砜（DMSO）保護(hù)劑四、植物細(xì)胞工程制藥技術(shù)基礎(chǔ)1、植物組織與細(xì)胞培養(yǎng)

在無菌或人工控制的營養(yǎng)及環(huán)境條件（光照、溫度等）下，研究植物的細(xì)胞、組織和器官以及控制其生長發(fā)育的技術(shù)。（1）懸浮培養(yǎng)（2）細(xì)胞培養(yǎng)（3）分生組織培養(yǎng)，生長錐培養(yǎng)（4）外植體、愈傷組織和毛狀根培養(yǎng)（5）器官形成培養(yǎng)2、植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)基應(yīng)用最廣的培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基，LS培養(yǎng)基無機(jī)鹽、碳源、有機(jī)氮源、植物生長激素、維生素等成分2、植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因技術(shù)原理植物細(xì)胞具有全能性，如將外源基因整合到植物細(xì)胞中，在通過細(xì)胞和組織培養(yǎng)，就能獲得再生的轉(zhuǎn)基因植株。植物細(xì)胞基因轉(zhuǎn)化技術(shù)：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù)，利用農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒，T-DNA介導(dǎo)。直接轉(zhuǎn)化技術(shù)，基因槍法、電擊法、顯微注射法、PEG法、脂質(zhì)體介導(dǎo)法、花粉管通道法等，將外源基因直接導(dǎo)入植物細(xì)胞。五、酶工程制藥技術(shù)基礎(chǔ)1、酶工程(enzymeengineering)：酶學(xué)與工程學(xué)互相滲透結(jié)合，發(fā)展形成的生物技術(shù)，它是從應(yīng)用目的出發(fā)，研究酶和應(yīng)用酶的特異催化功能，并通過工程化過程將相應(yīng)原料轉(zhuǎn)化成所需產(chǎn)物的技術(shù)。

研究內(nèi)容（1）酶的發(fā)現(xiàn)、分離純化與生產(chǎn)應(yīng)用。（2）酶與細(xì)胞的固定化技術(shù)與酶反應(yīng)器。（3）生物酶工程：以基因工程技術(shù)和蛋白質(zhì)工程技術(shù)研究酶工程。（4）抗體酶、模擬酶、合成酶及酶的人工設(shè)計(jì)。酶反應(yīng)示例2、固定化酶(immobilizedenzyme)指借助于物理和化學(xué)的方法把酶束縛在一定空間內(nèi)并具有催化活性的酶制劑，是近代酶工程技術(shù)的主要研究領(lǐng)域。廣義的固定化酶又包括固定化酶和固定化細(xì)胞兩類。優(yōu)點(diǎn)：（1）固定化穩(wěn)定性提高（2）可重復(fù)使用、提高使用效率、降低成本（3）提高強(qiáng)度，便于連續(xù)、自動(dòng)、規(guī)模化生產(chǎn)（4）便于產(chǎn)物的分離、純化固定化酶反應(yīng)器共價(jià)鍵結(jié)合酶固定化可溶交聯(lián)包埋吸附酶的固定化技術(shù)和固定化酶3、制備方法：（1）吸附法：分為物理吸附法和離子交換吸附法。（2）包埋法：將酶或細(xì)胞定位于凝膠高聚物網(wǎng)絡(luò)中，如卡拉膠，海藻膠，聚丙烯酰胺（3）共價(jià)鍵結(jié)合法：酶分子與載體分子，通過化學(xué)偶聯(lián)使酶與載體共價(jià)結(jié)合。（4）交聯(lián)法：用雙或多功能試劑將酶與載體交聯(lián)固定化

圖:酶固定化方法示意1.離子結(jié)合2.共價(jià)結(jié)合3.交聯(lián)4.聚合物包埋5.疏水作用6.脂質(zhì)體包埋7.微膠囊第四節(jié)生物制藥工藝中試放大設(shè)計(jì)

一、中試放大目的與規(guī)模1．基本要求：（1）建立穩(wěn)定的制造規(guī)程為正式生產(chǎn)提供多種必需的工藝條件與參數(shù)；（2）為臨床前研究與臨床實(shí)驗(yàn)的評價(jià)提供足量的合格產(chǎn)品；（2）