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備案號(hào)：42283-2014DB22DB22/T2083—2014食用菌菌種真實(shí)性鑒定RAMP法Verificationofgenuinenessforediblemushroomspawn—RAMP2014-05-04發(fā)布2014-06-01實(shí)施吉林省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I1采用RAMP標(biāo)記擴(kuò)增基因組中微衛(wèi)星序列與隨機(jī)引物互補(bǔ)序列之間的DNA片段，通過(guò)比較試樣與對(duì)照2殘?jiān)?，在馬鈴薯汁液中加入葡萄糖20.0g，硫酸鎂0.5g，磷酸二氫鉀0.46g，磷酸氫二鉀1.0g，瓊將供檢菌株與對(duì)照菌株在相同條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)量可供做3個(gè)平行鑒定試驗(yàn)。將待供檢菌株與對(duì)照菌株在無(wú)菌條件下，切?。?～5）mm×（3～5）mm大小一塊母種，迅速轉(zhuǎn)移至試管斜面培養(yǎng)基中央位注：長(zhǎng)期保存應(yīng)采用-20℃;多次測(cè)定需分裝保存，每次使用后不再重新凍存。3）；取3μLDNA提取液，用無(wú)菌水稀釋至一定倍數(shù)，混勻后，加入石英比色皿中，加入量為比色皿體積的3/4，并以無(wú)菌水或TE緩沖液為空白對(duì)照，用紫待測(cè)樣品含量(μg/mL）=OD260值×稀釋倍數(shù)×50由4條SSR引物和10條RAPD引物組成40對(duì)核心引物。使用時(shí)首先選用5對(duì)參見(jiàn)附錄C（按菌種分類(lèi)引25μL的反應(yīng)體積，含ddH2O為3.25μL，10×PCR緩沖液為2參見(jiàn)7.3.1方法。配制2%瓊脂糖凝膠，在點(diǎn)樣孔中加入5μL的菌株P(guān)CR產(chǎn)物與2μL的6×Loadingbuffer的混合液體，取DL2000供檢菌株與對(duì)照菌株之間的譜帶未檢測(cè)出差異，再選定5個(gè)引物做進(jìn)一步驗(yàn)證試驗(yàn)。必要時(shí)可增加4A.1.5高壓滅菌裝置（可以達(dá)到溫度121.3℃,壓力0.15MPaA.1.12水浴鍋或金屬?。嚎販鼐獳.2.4乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na2?）；56試劑的配制B.40.5mol/L乙二胺四乙酸（pH8.CTAB，1gPVP-40，65℃水浴溶解量取1mol/LTris-HCl（pH8.0）溶液10mL和0.5mol/L乙二胺四乙酸（pH8.0）溶液2mL，加稱(chēng)取Tris242.2g，量取冰醋酸57.2mL，加

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