第九章-病毒感染與細胞凋亡

病毒學第九章病毒感染與細胞凋亡第九章病毒感染與細胞凋亡第一節(jié)

細胞凋亡第二節(jié)病毒感染與細胞凋亡的相互關系第三節(jié)桿狀病毒與細胞凋亡第四節(jié)流感病毒誘導的細胞凋亡第五節(jié)病毒性肝炎與細胞凋亡第一節(jié)

細胞凋亡（Apoptosis）細胞凋亡的含義細胞凋亡的重要性凋亡的分子生物學機制凋亡對病毒復制策略的影響

1972年Kerr等已發(fā)現(xiàn)從細胞形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)和生化變化等方面來分析，認為細胞有二種死亡形式：細胞壞死(Necrosis)程序性細胞死亡（Programmedcelldeath,PCD）現(xiàn)在普遍稱之為細胞凋亡（Apoptosis）。細胞凋亡：一個主動的由基因決定的自動結(jié)束生命的過程。一、細胞凋亡的含義細胞凋亡的生理意義：

確保正常發(fā)育、生長

維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定

發(fā)揮積極的防御功能二、細胞凋亡的重要性三、凋亡的分子生物學機制在分子水平上，凋亡過程可分為兩個階段：信號傳遞階段死亡信號的探測、信號向下游死亡機制的傳遞。胞外信號：配體與受體的特異結(jié)合；胞內(nèi)信號：毒素、射線引起的損傷或病毒感染。效應階段（共同的）—Caspase（半胱氨酸蛋白酶）三條信號通路：膜死亡信號通路（配體-受體相互作用）線粒體信號通路（主要與Bcl-2家族蛋白有關）內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體的信號通路（Bcl-2家族蛋白起重要作用）兩大蛋白：

Caspase（半胱氨酸蛋白酶）Bcl-2膜死亡信號通路（以Fas-FasL為例）

FASL+FAS→+FADD↓

凋亡誘導復合物（DISC）↓胞質(zhì)中游離的caspase8聚集到這個復合物上↓細胞有足夠活化的caspase8↓死亡受體活化，切割Bid，tBid到線粒體

Ctyc釋放到胞質(zhì)↓

→→→→細胞凋亡線粒體參與細胞凋亡或壞死的途徑釋放caspase活化因子：Apaf-1：凋亡蛋白酶活化因子細胞色素C：細胞色素C+Apaf-1+caspase9—凋亡體AIF（凋亡誘導因子-激活核酸內(nèi)切酶）Smac/DiabloHtrA2阻斷IAP參與凋亡凋控Procaspase3線粒體信號通路凋亡啟動因子細胞凋亡的兩條通路：膜受體通路、線粒體通路凋亡過程可大致分成4個階段凋亡信號轉(zhuǎn)導凋亡基因激活凋亡的執(zhí)行凋亡細胞的清除凋亡信號的轉(zhuǎn)導的特點①多樣性：不同種類細胞有不同的信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)②偶聯(lián)性：死亡信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)與細胞增殖、分化過程中的信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)在一些環(huán)節(jié)上交叉、偶聯(lián)③同一性：不同凋亡誘導因素可通過同一信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)引起細胞凋亡④多途性：同一凋亡誘導因素可經(jīng)過多條信號途徑觸發(fā)細胞凋亡有些胞內(nèi)寄生病毒在進化過程中，獲得了抑制其感染細胞凋亡的能力。其抑制機理主要有兩個方面感染時誘導機體產(chǎn)生熱休克蛋白，從而干擾細胞凋亡途徑,HSP是機體受到應激原的刺激后產(chǎn)生的具有高度保守性的蛋白家族，對維持細胞生存和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定起重要作用；激活抗凋亡分子；病毒既能促進，也能抑制宿主細胞的凋亡。四、凋亡對病毒復制策略的影響病毒誘導凋亡機制：細胞周期失調(diào)、單個基因過量表達；病毒抑制凋亡機制：

腺病毒：E1A、E1B（19K/55K）、E3；

SV40：T抗原；

乳頭瘤病毒：E6；

痘病毒：crmA

EB病毒：BHRF1（Bcl-2同源基因）

人皰疹病毒8型：KS（Bcl-2同源基因）一、病毒的復制周期二、病毒感染與細胞凋亡的關系三、細胞凋亡與臨床病毒的密切關系第二節(jié)病毒感染與細胞凋亡的相互關系吸附、脫殼→將本身的遺傳物質(zhì)進入活的宿主細胞→利用宿主細胞提供的低分子物質(zhì)及酶系首先合成一些抑制蛋白和病毒復制必須的復制酶→大量合成病毒核酸和結(jié)構(gòu)蛋白→組裝成熟的病毒→釋放在整個復制周期中，病毒先表達一些蛋白來維持宿主細胞的存活，為其復制提供合成原料；當其成熟之后，又誘導宿主細胞凋亡并釋放出來，再感染新的活性細胞，開始另一個復制周期。一、病毒的復制周期宿主免疫細胞利用細胞凋亡來清除病毒感染細胞；病毒可介導細胞凋亡在遭到病毒攻擊時，細胞通過自殺，可以阻止或限制病毒的復制。而作為打破宿主防御體系的一種策略，不少病毒自身基因組編碼有抗細胞凋亡的基因，使之能獲得最大的生長優(yōu)勢,以利于生存與繁衍。目前已經(jīng)在腺病毒科、皰疹病毒科和桿狀病毒科中發(fā)現(xiàn)能夠調(diào)節(jié)細胞凋亡的基因。病毒對宿主凋亡行為的控制能力影響病毒對特定宿主的致病力（宿主范圍、組織特異性、持續(xù)性和潛伏性）。二、病毒感染與細胞凋亡的關系病毒感染是調(diào)節(jié)細胞凋亡的重要因素,病毒感染后不僅可通過自身基因的表達激活或抑制細胞凋亡的發(fā)生,也可與細胞凋亡調(diào)節(jié)基因一起共同參與凋亡的調(diào)控。病毒感染促進細胞凋亡在感染晚期病毒誘導和促進細胞凋亡，這是病毒擴散并感染鄰近細胞的重要步驟。病毒感染抑制細胞凋亡機體受到病毒感染后，為維持正常的生理活動，盡可能減少病毒的損害，會誘發(fā)機體自身控制的凋亡基因的啟動表達，從而導致細胞死亡。如：①丙型肝炎病毒（HCV）的核心蛋白在細胞內(nèi)表達時，細胞傾向于Fas介導的細胞凋亡。（一）病毒感染促進細胞凋亡②HIV感染的細胞中，HIVgp120蛋白是誘導細胞凋亡的主要原因，gp120產(chǎn)生異常信號并傳遞給免疫感受態(tài)細胞以增加凋亡，其在細胞內(nèi)表達后，CD4+T細胞被誘導增快凋亡。在HIV感染的個體中Fas受體的表達增加，伴隨淋巴細胞對抗Fas抗體敏感性提高。

③呼腸孤病毒（reovirus）不同型誘導細胞凋亡的能力不同。誘導凋亡的不同能力是由病毒的S1和M2基因所決定的。④其他病毒：痘苗病毒、SV40、HSV等感染也可促進細胞發(fā)生凋亡。（二）病毒感染抑制細胞凋亡

ICE家族在控制脊椎動物細胞凋亡中起著重要作用：

SV40的T抗原與ICE家族作用可抑制凋亡;T抗原可結(jié)合到p53基因的DNA結(jié)合區(qū)，阻斷其特異性的啟動元件，抑制P53依賴的細胞凋亡；

桿狀病毒的P35蛋白、牛痘病毒的CrmA為ICE/Ced-3家族成員的活性抑制劑。

原癌基因Bcl-2等的表達直接影響細胞凋亡：

EB病毒的基因產(chǎn)物BHRF1是Bcl-2的類似物，是細胞因子誘導的凋亡的抑制劑，卡波氏肉瘤病毒和人皰疹病毒8型也編碼Bcl-2類似物。三、細胞凋亡與臨床病毒的密切關系在健康的機體中，細胞的生生死死總是處于一個良性的動態(tài)平衡中，如果這種平衡被破壞，人就會患病。如果該死亡的細胞沒有死亡，就可以導致細胞惡性增長，形成癌癥。如果不該死亡的細胞過多地死亡，如：受艾滋病病毒的攻擊，不該死亡的淋巴細胞大批死亡，就會破壞人體的免疫能力，導致艾滋病發(fā)作。細胞凋亡與疾病的關系——

該“死”的細胞不死，不該“死”的細胞卻死了，也就是說無論凋亡過度或凋亡不足都可以導致疾病的發(fā)生。細胞凋亡不足：腫瘤、病毒感染細胞凋亡過度：心肌缺血、心力衰竭、神經(jīng)元退行性疾病、病毒感染不足與過度并存：動脈粥樣硬化病毒感染宿主細胞后有兩種結(jié)局：

誘導細胞凋亡從而限制病毒生長（肝炎病毒）；由病毒基因表達的蛋白抑制宿主細胞凋亡，造成持續(xù)性感染或增加某些病毒的致癌可能性。AIDS:由HIV感染引起，其關鍵是CD4+T淋巴細胞被破壞，導致CD4+淋巴細胞顯著減少，相關免疫功能缺陷。HIV病毒感染造成CD4+T細胞減少是通過細胞凋亡機制

HIV感染引起愛滋病，主要發(fā)病機制是HIV感染后特異性地破壞CD4+細胞，使CD4+以及與其相關的免疫功能缺陷，易招致機會性感染及腫瘤。CD4+T淋巴細胞絕對數(shù)顯著減少的原因，主要是通過細胞凋亡機制造成的。合胞體形成：受HIV感染的CD4+細胞表面有gp120表達，它可以和未受感染的CD4+細胞形成融合的多核細胞(合胞體)，因而改變了細胞膜的通透性，導致細胞溶解和破壞。

Fas基因表達上調(diào)HIV基因產(chǎn)物GP120能直接啟動CD4+淋巴細胞的死亡程序T細胞激活正常的T細胞功能對于維持免疫系統(tǒng)內(nèi)外的穩(wěn)態(tài)是必需的，激活誘導細胞死亡。細胞因子受感染的Mφ釋放TNF增多HIV感染導致CD4+T淋巴細胞凋亡的相關因素第三節(jié)桿狀病毒與細胞凋亡桿狀病毒感染后引起細胞凋亡：桿狀病毒是最早發(fā)現(xiàn)具有調(diào)控宿主行為能力的病毒之一桿狀病毒在進化過程中為適應自身的生活環(huán)境及繁殖的需要，獲得了一些進化上的生長優(yōu)勢，通過作用于宿主細胞凋亡途徑中保守部位，在細胞水平上對宿主細胞的壽命進行調(diào)控。桿狀病毒感染后引起細胞凋亡：桿狀病毒的抗細胞凋亡基因

目前已知桿狀病毒編碼兩種阻遏宿主細胞因病毒感染而誘發(fā)細胞凋亡的抗細胞凋亡基因（inhibitorofapotosis），分別為iap基因和p35基因。iap（inhibitorofapoptosis）基因是p35基因缺陷型的AcMNPV病毒與蘋果小卷蛾顆粒體病毒（Cydiapomonellagranulosisvirus,CpGV）及黃杉毒蛾（Orgyiapseudotsugata）NPV基因文庫在Sf細胞中進行功能互補試驗時發(fā)現(xiàn)的。Cp-IAP和Op-IAP的氨基酸序列與AcMNPV的P35的氨基酸序列無明顯的同源性。IAP家族蛋白的結(jié)構(gòu)特征IAP蛋白的抗細胞凋亡功能及其作用機理P35蛋白的抗細胞凋亡功能及其作用機理桿狀病毒IAP重復：Ｎ末端由70aa.組成的重復序列（baculoviralIAPrepeat，簡稱BIR），已知含IAP家族蛋白的病毒和動物的IAP蛋白最多可含有三個BIR結(jié)構(gòu)，不同來源的IAP蛋白，組氨酸和半胱氨酸殘基在BIR結(jié)構(gòu)域中具有相似的位置；環(huán)鋅指結(jié)構(gòu)：IAP蛋白還具有一個保守的鋅結(jié)合區(qū)域，（ringzinc-finger,RZF），位于IAP蛋白的C末端。

IAP蛋白的鋅指結(jié)構(gòu)及BIR序列是抑制細胞凋亡的必需元件。IAP家族蛋白的結(jié)構(gòu)特征IAP蛋白C末端有RZF，因此IAP蛋白是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。桿狀病毒的IAPs也能在其他類型的細胞中抑制細胞凋亡：Op-IAP可部分阻遏Caspase-1或FADD過量表達誘導的HeLa細胞凋亡；Cp-IAP能部分阻遏Reaper在果蠅正在發(fā)育的眼中的過量表達引起的細胞凋亡；桿狀病毒的感染能激活Sf-Caspase-1的形成，IAPs則能夠有效阻止Caspase-1前體的激活。IAP蛋白的抗細胞凋亡功能及其作用機理與桿狀病毒的IAPs相似，哺乳動物的IAPs也能阻止不同刺激誘發(fā)的細胞凋亡。抑制細胞凋亡至少需要一個BIR結(jié)構(gòu)域存在，有的研究發(fā)現(xiàn)桿狀病毒IAP蛋白需要N末端的BIR結(jié)構(gòu)和C末端的環(huán)鋅指結(jié)構(gòu)同時存在，才能抑制細胞凋亡。也有研究表明Op-IAP只需BIR2的存在就足以抑制由果蠅促細胞凋亡蛋白HID誘導的細胞凋亡。細胞凋亡作為宿主抵御病毒侵染的一個重要防御機制，它不僅可以有效地削弱桿狀病毒的復制，還可以降低病毒的感染力。與此相對，病毒自身基因則編碼抗細胞凋亡因子，以獲得最大的生長優(yōu)勢。有研究發(fā)現(xiàn)，在Sf-9和Tn-5B1-4等幾種昆蟲細胞的基因組中，都發(fā)現(xiàn)有與抗細胞凋亡的基因P35同源性很高的片段。這說明在宿主細胞中可能存在抗細胞凋亡的基因。P35蛋白的抗細胞凋亡功能及其作用機理P35蛋白的抗細胞凋亡功能及其作用機理

p35基因首先發(fā)現(xiàn)于AcMNPV，隨后又在BmNPV中發(fā)現(xiàn)。桿狀病毒p35基因的表達產(chǎn)物能抑制病毒感染而引起的細胞凋亡。如AcMNPV能有效地阻止caspase過量表達誘導的細胞凋亡。桿狀病毒p35基因還能抑制線蟲和果蠅的發(fā)育細胞死亡，以及由于血清或NGF喪失而誘導的哺乳動物的神經(jīng)元細胞死亡。桿狀病毒的P35蛋白通過直接抑制Caspase來阻止病毒感染的昆蟲細胞發(fā)生凋亡，P35對Caspase家族成員高度專一。

P35最關鍵的結(jié)構(gòu)決定簇是環(huán)狀區(qū)域，即Caspase剪切位點周圍的殘基。環(huán)的變化可能通過改變環(huán)與Caspase活性位點的相互作用提供或取消抑制功能，或是改變特異性。P35能阻遏激活形式的Caspase誘導的細胞凋亡。IAPs抗細胞凋亡的途徑與P35不同，它是阻止了執(zhí)行型Caspase的活化，而P35幾乎是所有Caspase的拮抗物。從這點意義上來說，在抑制細胞死亡的途徑中，P35是在與IAP等位置處或是抑制上游Caspase。第四節(jié)流感病毒誘導的細胞凋亡TakizawaT(1993)發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)Hela細胞在感染人甲型流感病毒之后，細胞出現(xiàn)染色質(zhì)濃縮、凝聚、凋亡小體形成、提取DNA進行電泳呈典型“階梯狀”條帶等一系列凋亡特有的變化，故首次提出：流感病毒可以誘導體外培養(yǎng)的細胞發(fā)生凋亡。目前，關于流感病毒誘導細胞凋亡的機制有以下幾種看法，認為與其相關的物質(zhì)有：Fas(屬于腫瘤壞死因子/神經(jīng)生長因子受體超家族)NA（神經(jīng)氨酸酶）TGF-β（轉(zhuǎn)化生長因子β）PKR(double-strandedRNA-activatedproteinKinase）:干擾素誘生的雙鏈RNA活化的蛋白激酶NS(nonstructural）:只在感染細胞中出現(xiàn)PB1-F2:

第11種病毒蛋白PB1-F是在H1N1亞型中發(fā)現(xiàn)的(位于宿主細胞的線粒體上)一、流感病毒誘導Fas基因和Fas分子N端的死亡信號激發(fā)域表達1993年TakizawaT等在用流感病毒感染體外培養(yǎng)的Hela細胞時發(fā)現(xiàn)，在感染的早期階段可誘導Fas表達于細胞表面，誘導細胞發(fā)生凋亡。1997年Matsumura等提出流感病毒感染Hela細胞后，在凋亡發(fā)生以前細胞表面Fas以及FasL的數(shù)量增加，而且加入抗FasL的抗體后凋亡可被抑制。二、流感病毒通過其表面的NA激活TGF-β誘導細胞發(fā)生凋亡TGF-β可誘導非腫瘤細胞轉(zhuǎn)化為腫瘤細胞；誘導細胞凋亡在馬流感病毒感染MDCK細胞過程中，TGF-β增加，從而激發(fā)JNK／SAPK信號途徑；用流感病毒感染小鼠，1天后具有活性的TGF-β水平增高。進一步研究顯示，NA糖蛋白可激活潛在的TGF-β，從而引起細胞發(fā)生凋亡(不是唯一途徑)。三、PKR(雙鏈RNA活化的蛋白激酶)與細胞凋亡PKR是由干擾素誘生的雙鏈RNA活化的絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，與病毒的發(fā)病機制、細胞生長及凋亡有密切關系在流感病毒誘導細胞凋亡的過程中，PKR能調(diào)控幾條重要的細胞信號途徑因而具有重要的效應，其中較為重要的一個就是能夠增加干擾素的數(shù)量及活性；PKR活化可以誘導TNFR家族成員包括Fas和前凋亡因子Bax的表達，且在PKR活化過程中，F(xiàn)asmRNA表達上調(diào)。四、NS與細胞凋亡流感病毒NS(nonstructura1)基因是其內(nèi)部基因組中最小的基因節(jié)段，它轉(zhuǎn)錄成的共線性mRNA共編碼兩種蛋白即NS1和NS2蛋白。這兩種蛋白僅在被流感病毒感染的細胞中發(fā)現(xiàn)，而在病毒體中未能