DB32T 3209-2017 脫毒甘薯種薯(苗)SPCSV、SPVG、SPLCV檢測技術規(guī)程　　

DB32江蘇省質量技術監(jiān)督局發(fā)布I本標準主要起草人：謝逸萍、孫厚俊、張梅1脫毒甘薯種薯(苗)病毒檢測技術規(guī)程本標準適用于脫毒甘薯種薯(苗)SPCSV、SPVG、SNY/T402-2000脫毒甘薯種薯（苗）病毒檢測技術規(guī)程脫毒組培苗virus-freetissueculture脫毒種薯(苗)virus-frees用脫毒試管苗在60目防蟲網室、溫室條件下生產的符合質量標準的種2病毒病株允許率Maximumvirus-infectedplantpercentag4檢測病毒種類甘薯褪綠矮化病毒（Sweetpotatochlor甘薯G病毒（SweetpotatovirusG甘薯卷葉病毒（Sweetpotatoleafcur5.1組培苗抽樣5.1.2擴繁苗500株；超出1hm2面積，劃出另一檢驗區(qū)，按本規(guī)程規(guī)定的面積取樣。每株取上、中、下部葉片和葉柄定植后30d、收獲前兩周，采用隨機取樣法，0.1hm2以下檢驗5點，每點40株；0.11hm2～1hm2檢驗5點，每點100株；1.1hm2～5hm2檢驗10點，每點100株；超出5hm2面積，劃出另一檢驗區(qū)，按本規(guī)程規(guī)定的面積取樣。取樣方法及樣品保存同5.3所用化學試劑為分析純級規(guī)格，用水為滅菌6.1.1三羥甲基氨基甲烷溶液(TBS)(pH=7.三羥甲基氨基甲烷（Tris）4.84g，氯化鈉（NaCl）58.44g，溶于1990ml蒸餾水中，2％脫脂奶粉6.0g，先將脫脂奶粉溶解于少量TBS中，再用TBS定容至300ml，混勻。加6ml曲拉通蒸餾水中，用濃鹽酸調pH值至9.5，定氯化硝基四氮唑藍（NBT）0.04g溶于1.2ml70%N，N-二甲基甲酰胺（DMF）中，-20℃避光保存?zhèn)?.02g5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽(BCIP)溶于1.2mlN，N-二甲基甲酰胺（DMF）中，-20℃避光將75μlNBT儲備液溶于25ml底物緩沖液中，再逐滴加入75μlBCIP儲備液，邊加邊振葉柄的結合部，需隔在塑料袋外取，只留葉片和葉柄的結合部，其余除去；加1ml磨。4℃靜置30min～40min，或室溫放置20min～30將一張干燥的濾紙放在實驗臺上，將硝酸纖維素膜放在上面，避免氣泡產生；b、用移液槍吸取塑料袋中提取液上清部分15μl～20μl，點在膜上方格正中，槍頭不可觸碰到膜，一個樣品用一個槍頭，將干燥后的膜浸泡在封閉緩沖液中，室溫下搖床振蕩(50rpm/min)用洗滌緩沖液洗膜3次，每次搖床振蕩(100rpm/m將膜置于NBT/BCIP底物溶液中，室溫下搖床振蕩(50rpm/min)孵育30_______________________