分子生物學(xué)實驗講義(2020版-)

PAGEPAGE8《分子生物學(xué)》實驗講義實驗一分子生物學(xué)實驗基礎(chǔ)知識及常用儀器介紹實驗二質(zhì)粒DNA分離純化實驗三瓊脂糖凝膠電泳實驗四聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測質(zhì)粒DNA實驗五限制酶切鑒定質(zhì)粒DNA實驗一分子生物學(xué)實驗基礎(chǔ)知識及常用儀器介紹一、實驗?zāi)康牧私夥肿由飳W(xué)實驗特點，了解分子生物學(xué)實驗室常用設(shè)備及基本實驗操作。二、實驗內(nèi)容分子生物學(xué)實驗知識⑴嚴格操作規(guī)程分子生物學(xué)實驗一般比較復(fù)雜，如所用試劑多、操作步驟多、實驗時間長等，因此為保證實驗效果，在實驗室中一定要有整體觀念，嚴格按照操作規(guī)程進行。⑵耐心細致操作實驗中不能急于求成，特別是對于初入門者，應(yīng)反復(fù)操作，積累經(jīng)驗。⑶習(xí)慣微量操作在分子生物學(xué)實驗中，試劑的用量往往很少，常常細到1ul液體、ug或ng固體，這是平常肉眼很難看到的，所以剛剛接觸實驗的人往往感到不習(xí)慣，總是擔(dān)心要取的東西能否看到、準不準確，操作的樣品會不會丟失，總是想加大反應(yīng)體積，以為越多越好。這些觀念都是錯誤的。只有定時定量加入液體，才能保證實驗成功，所以平時應(yīng)加以練習(xí)，逐漸建立微量操作的觀念才能解決好問題。⑷防止實驗污染分子生物學(xué)實驗的對象主要是核酸，不同生物材料的DNA和DNA之間，不同的樣品之間，核酸酶等蛋白酶與核酸之間，產(chǎn)物與反應(yīng)物之間都有可能造成污染，最終導(dǎo)致實驗的失敗。故要從所用試劑、儀器設(shè)備、耗材及操作人員等方面進行防止污染的操作。⑸正確處理試劑分子生物學(xué)實驗中對試劑的要求十分嚴格，包括試劑的等級、配制、除菌儲備等各方面均有嚴格要求。⑹注意實驗安全分子生物學(xué)實驗中，操作者常會接觸一些對人體有害的試劑，必須實驗安全要求進行實驗操作，否則會給實驗室甚至整個人類帶來巨大的危害。分子生物學(xué)實驗常用儀器介紹⑴微量取液器⑵水純化裝置（離子交換器、超純水裝置）⑶離心機（低速、高速、超速）⑷電泳裝置（電泳儀、電泳槽）⑸滅菌設(shè)備（高壓蒸汽滅菌鍋、過濾除菌器）⑹超凈工作臺⑺PCR儀⑻凝膠成像系統(tǒng)（紫外分析儀、核酸凝膠電泳圖譜的記錄）⑼溫度控制設(shè)備（冷凍設(shè)備、培養(yǎng)箱、水浴箱、烤箱）⑽其它設(shè)備（紫外可見分光光度計、微波爐、凝膠干燥器、真空干燥儀）分子生物學(xué)基本實驗操作⑴基因組DNA的分離與純化（核酸濃度和純度測定）⑵真核細胞mRNA的分離與純化⑶質(zhì)粒DNA的提取⑷PCR基因擴增實驗⑸限制性內(nèi)切酶酶切實驗⑹DNA重組技術(shù)⑺DNA轉(zhuǎn)移技術(shù)⑻DNA測序：化學(xué)法、雙脫氧鏈終止法⑼核酸探針的制備技術(shù)：末端標(biāo)記、PCR法制探針、非放射性探針⑽分子雜交技術(shù)：Southern印跡、Northern印跡和Western印跡微量移液器的使用可調(diào)節(jié)微量移液器標(biāo)準操作程序（適用的液體：水、緩沖液、稀釋的鹽溶液和酸堿溶液）：⑴調(diào)節(jié)數(shù)字至所需體積；⑵裝上吸嘴（不同規(guī)格的移液器用不同的吸頭），注意氣密性）；⑶按到第一檔，垂直進入液面幾毫米；⑷緩慢松開控制按鈕（否則液體進入吸頭過速會導(dǎo)致液體倒吸入移液器內(nèi)部吸入體積減少）；⑸停頓1s后將吸嘴提離開液面；⑹平穩(wěn)按壓打出液體。注意吸嘴一般要貼壁并有一定角度，先按到第一檔，稍微停頓1s后，待剩余液體聚集后，再按到第二檔將剩余液體全部壓出。⑺按吸嘴彈射按鈕除去吸嘴；⑻將量程調(diào)至最大量程處。常見的錯誤操作：⑴吸液時，移液器本身傾斜，導(dǎo)致移液不準確(應(yīng)該垂直吸液，慢吸慢放)。

⑵裝配吸頭時，用力過猛，導(dǎo)致吸頭難以脫卸(無需用力過猛，選擇與移液器匹配的吸頭)。

⑶平放帶有殘余液體吸頭的移液器(應(yīng)將移液器掛在移液器架上)。

⑷用大量程的移液器移取小體積樣品(應(yīng)該選擇合適量程范圍的移液器)。

⑸直接按到第二檔吸液(應(yīng)該按照上述標(biāo)準方法操作)。

⑹使用丙酮或強腐蝕性的液體清洗移液器(應(yīng)該參照正確清洗方法操作)。三、作業(yè)1.談一談微量移液器的使用方法及注意事項。實驗二堿裂解法制備質(zhì)粒DNA一、實驗?zāi)康恼莆諌A裂解法提取質(zhì)粒DNA的原理與方法。了解堿裂解法中各種試劑的作用。二、實驗原理基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA之間變性與復(fù)性的差異而達到分離質(zhì)粒DNA的目的，因為①染色體DNA分子量比質(zhì)粒DNA大得多；②從細胞中提取到的染色體DNA大多斷裂成線狀分子,而質(zhì)粒DNA卻是共價閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)。在pH高達12.6的條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開變性，同時由于受到機械剪切力或核酸酶等的作用,染色體DNA易被切成大小不同的片段；而閉環(huán)質(zhì)粒DNA鏈氫鍵雖也斷裂，但因其超螺旋共價閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，兩條互補鏈不會完全分離。當(dāng)以pH4.8的醋酸鉀高鹽緩沖液調(diào)節(jié)pH至中性時，質(zhì)粒DNA又恢復(fù)其天然構(gòu)象，以可溶狀態(tài)存在于液相中，而染色體DNA不能復(fù)性而形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，與不穩(wěn)定的大分子RNA、變性的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物以及細菌碎片等一起形成絮狀沉淀而被除去。然后用無水乙醇沉淀質(zhì)粒DNA，即可得到純化的質(zhì)粒DNA。三、實驗材料生物材料大腸桿菌JM109菌株；pCAGGS重組質(zhì)粒，本實驗所用重組質(zhì)粒是在pCAGGS質(zhì)粒的多克隆位點上選擇KpnI和NheI酶雙切后插入了一個300bp的外源DNA片段。下圖(圖1)是質(zhì)粒pCAGGS圖譜。圖1.質(zhì)粒pCAGGS圖譜主要試劑用于細菌培養(yǎng)：LB固體培養(yǎng)基，LB液體培養(yǎng)基，氨芐青霉素（100mg/mL）。用于質(zhì)粒DNA提?。喝芤篜1(BufferP1)：使用前按照TIANRed:溶液P1=1:200進行混合，徹底顛倒混勻，混勻后的溶液為澄清的紅色。溶液P2(BufferP2)：無色；溶液P5(BufferP5)：無色；漂洗液PWT(BufferPWT)：使用前與無水乙醇混合；洗脫緩沖液TB(BufferTB)：可用雙蒸水代替；RNaseA(10mg/ml)、TIANRed：溶液P1在使用前先加入RNaseA和TIANRed，置于2-8℃保存。主要儀器微量移液器，超凈工作臺，制冰機，高速離心機，冰箱等。四、實驗方法培養(yǎng)細菌：將含有pCAGGS重組質(zhì)粒的JM109菌株大腸桿菌涂布于加有氨芐青霉素（終濃度為100μg/mL）的LB平板，37℃下靜置培養(yǎng)12-16h；挑取單菌落于10mL含氨芐青霉素（終濃度為100μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基（50ml-三角瓶）中，37℃，220rpm培養(yǎng)過夜。取1.5mL菌液于1.5mL離心管中，12000g離心1min，用微量移液器棄盡上清?！咀⒁狻竣俦緦嶒炛兴褂玫碾x心管和移液槍頭必須經(jīng)過滅菌處理。②如果菌量過少，可再取1.5mL菌液于1.5mL離心管中，重復(fù)操作一次。【現(xiàn)象】離心管底部有少量白色沉淀，上部為澄清液體。向留有菌體沉淀的離心管中加入150μl溶液P1，使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細菌沉淀?！咀⒁狻坎僮飨鄬×遥詮氐状騽虺恋砘蛩閴K?！粳F(xiàn)象】溶液為均勻渾濁的紅色向離心管中加入150μl溶液P2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次使菌體充分裂解。【注意】溫和地混合，不要劇烈震蕩，以免污染基因組DNA【現(xiàn)象】澄清的紫色。若混雜有渾濁的紅色，則說明裂解不充分，繼續(xù)混勻直至溶液顏色完全變?yōu)槌吻宓淖仙?。向離心管中加入350μl溶液P5,立即快速地上下顛倒混勻12-20次，充分混勻，此時將出現(xiàn)絮狀沉淀。【注意】加入溶液P5后應(yīng)立即混合，應(yīng)快速上下顛倒混勻，避免產(chǎn)生局部沉淀?！粳F(xiàn)象】溶液為澄清的黃色，如果在黃色中混有紫色，則說明復(fù)性不充分，繼續(xù)混勻至溶液顏色完全變?yōu)槌吻宓狞S色。12000rpm(~13,400xg)離心2min，將上清液用移液器轉(zhuǎn)移到吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)，注意盡量不要吸出沉淀。12000rpm離心30sec,倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3重新放入收集管中?！咀⒁狻勘M量不要吸到白色雜質(zhì)，否則會影響質(zhì)粒的純度。向吸附柱CP3中加入300μl漂洗液PWT(已加入無水乙醇)，12000rpm離心30sec,倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3放入收集管中。12000rpm離心1min,倒掉收集管中的廢液，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除。將吸附柱CP3置于一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位滴加50-100μl洗脫緩沖液或滅菌雙蒸水，12000rpm離心30sec，將質(zhì)粒溶液收集到離心管中。五、結(jié)果與討論作為載體，質(zhì)粒DNA上有哪些元件？本實驗中，溶液P1、溶液P2、溶液P5的作用分別是什么？請分析出現(xiàn)下列現(xiàn)象的原因及解決辦法：①加入溶液P2后溶液并不澄清；②加入溶液P5后溶液中仍然呈現(xiàn)紫色；③加入溶液P5并離心后，上清中存在大量微小白色沉淀。實驗三瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA一、實驗?zāi)康恼莆窄傊悄z電泳的原理和基本操作技術(shù)。二、實驗原理DNA分子在高于其等電點（pI）pH值的溶液中帶負電荷，在直流電場中向正極泳動。不同的DNA分子因所帶電荷、構(gòu)象和分子量大小不同，在同一電泳系統(tǒng)中的遷移速度存在差異，因而可以使核酸片段彼此分離，并檢測其分子大小。凝膠中混入適量熒光染料（如溴化乙錠EB，或者GelRed），染料(EB)分子可嵌入DNA分子堿基之間，在紫外線照射下發(fā)出熒光，可觀察到核酸片段在凝膠中的位置和亮度，從而對DNA進行定性或定量測定。瓊脂糖凝膠的濃度可根據(jù)DNA分子的大小來確定，一般基因組DNA可用0.8%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，質(zhì)粒DNA選擇1.2％瓊脂糖凝膠，而對只有幾百個堿基對的寡核苷酸可制備濃度更高一些的瓊脂糖凝膠。三、實驗材料材料：實驗二所提取的質(zhì)粒DNA；試劑：0.5×TBE(或1×TAE)，6×上樣緩沖液，溴化乙錠(簡稱EB，配制成10mg/ml,用鋁箔或黑紙包裹容器,室溫儲存，有毒！不可徒手接觸）或GelRed核酸染料，瓊脂糖粉；主要儀器：微量移液器，電泳槽，制膠板，電泳儀，凝膠成像系統(tǒng)。四、實驗方法取制膠槽，洗凈、晾干、安裝好。【注意】膠槽水平放置，向下壓實，防止漏膠。器具會接觸到EB，不可徒手操作！灌膠：將100ml熔化的瓊脂糖凝膠（1.2%）冷卻至約65℃時，加10ulEB（或GelRed核酸染料，此類熒光染料的使用說明書上常要求按1:10000比例添加）混勻，小心地將凝膠倒入膠槽上，控制灌膠速度，使膠均勻展開，直到整個制膠槽表面形成均勻的凝膠層，凝膠厚度一般為3~5mm。將梳子插入到膠槽的定位槽中?！咀⒁狻勘M量避免凝膠中產(chǎn)生氣泡；器具會接觸到溴化乙錠，不可徒手操作?。?！室溫下待凝膠凝固完全后，取出梳子，將膠放在電泳槽中，加入0.5×TBE(或1×TAE)電泳緩沖液，液面高于凝膠面約1mm?！咀⒁狻奎c樣孔一端靠近負極；器具會接觸到溴化乙錠，不可徒手操作?。。〖訕訉嶒炈玫馁|(zhì)粒DNA作為電泳樣品。將樣品與上樣緩沖液6：1混勻，用微量加樣器將樣品分別加入膠板的樣品小槽內(nèi)，同時留一孔點入Marker?！咀⒁狻考訕訒r應(yīng)防止加樣器頭碰壞或插穿凝膠孔。加樣完畢后，蓋好電泳槽，接通電源，開始電泳。為防止樣品擴散，在樣品進膠前可用略高電壓。當(dāng)樣品進膠后，應(yīng)控制電壓不高于5V/cm。當(dāng)染料條帶移動到距離凝膠前沿1cm時，停止電泳?！咀⒁狻客姾笃虣z查通電情況。觀察小心取出凝膠，將凝膠放在凝膠成像系統(tǒng)中進行觀察。【注意】器具會接觸到溴化乙錠，不可徒手操作?。?！結(jié)果分析：凝膠中DNA存在的位置呈現(xiàn)橘紅色熒光，可觀察到清晰的條帶。五、結(jié)果與討論電泳檢測實驗中提取的質(zhì)粒，繪出電泳圖并作說明。實驗四聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)體外擴增DNA一、實驗?zāi)康氖煜CR反應(yīng)的基本原理；掌握PCR反應(yīng)的操作方法。二、實驗原理聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction，PCR）是體外酶促合成位于兩段已知序列（，引物）之間的DNA片段的一種技術(shù)。利用PCR技術(shù)可在短時間之內(nèi)大量擴增目的基因或DNA片段，以用于基因工程操作。PCR的基本條件：⑴DNA模板（在RT-PCR中模板是RNA）；⑵引物；⑶dNTP（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）⑷TaqDNA聚合酶PCR循環(huán)由三個步驟組成：⑴變性使模板DNA解離成單鏈；⑵退火使引物與模板DNA所需擴增序列兩端結(jié)合；⑶延伸DNA聚合酶利用dNTP合成與模板堿基序列互補的DNA鏈。每一個循環(huán)的產(chǎn)物可作為下一個循環(huán)的模板，通過30個左右循環(huán)后，目的片段的擴增可達106倍。本實驗中模板為pCAGGS重組質(zhì)粒，以其插入的外源DNA片段（300bp）兩端設(shè)計特異性引物進行PCR擴增，產(chǎn)物長度為300bp，以此鑒定重組質(zhì)粒。三、實驗材料材料pCAGGS重組質(zhì)粒，作為PCR擴增的模板。試劑PCRmix試劑（含Taq酶、10×反應(yīng)緩沖液、25mmol/LMgCl2、dNT。

引物P1、P2（P1為上游引物F-PC01，P2為下游引物R-PC02）。GelRed核酸染料：此類熒光染料的使用說明書上常要求按1:10000比例添加；或溴化乙啶染色液(EB)：10mg/ml（EB具致癌作用，使用時務(wù)必小心）。上樣緩沖液Loadingbuffer（10×）：0.25%溴酚藍，40%甘油。主要儀器PCR擴增儀、電泳儀、臺式離心機、

恒溫水浴、凝膠成像系統(tǒng)等。四、實驗方法PCR擴增20ul反應(yīng)體系，按下表(表1)加入試劑，并小心混勻。另加入石蠟油20ul(根據(jù)實驗需要和個人操作習(xí)慣決定是否加入石蠟油)?！咀⒁狻縿?wù)必使DNA模板加入下層水相混勻，點離?。?！表1.PCR反應(yīng)體系配制表(20uL)試劑體積ddH2O8.4ul2×PCRmix10ulP1（10μM）0.3ulP2（10μM）0.3ulDNA模板1ul⑵設(shè)置PCR程序：94℃，3min；94℃（30s）→55℃（30s）→72℃（30s），30循環(huán)；72℃，5min；⑶運行PCR程序PCR產(chǎn)物鑒定反應(yīng)結(jié)束后，取5ulPCR產(chǎn)物進行1.2%瓊脂糖電泳分析?！咀⒁狻繌南聦铀嗳?。五、結(jié)果與討論繪制PCR產(chǎn)物電泳示意圖，標(biāo)明各條帶的分子量并對所測樣品進行結(jié)果判定。實驗五DNA的限制性酶切反應(yīng)實驗?zāi)康?．掌握限制性核酸內(nèi)切酶的特點。2．掌握重組質(zhì)粒的酶切鑒定原理，及酶切結(jié)果的分析方法。實驗原理限制性核酸內(nèi)切酶是一類能識別雙鏈DNA中特定堿基序列并在該序列內(nèi)部或附近切割DNA的一類核酸水解酶。根據(jù)酶的識別切割特性、催化條件及是否具有修飾酶活性，可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大類。通常所指的DNA限制性核酸內(nèi)切酶就是Ⅱ型酶。限制性內(nèi)切酶在分子生物學(xué)研究中得到了廣泛應(yīng)用，是重組DNA的基礎(chǔ)，DNA經(jīng)限制酶切后產(chǎn)生的酶切圖譜是常用的鑒定DNA序列的方法。本實驗根據(jù)重組質(zhì)粒的克隆位點，選用KpnI和NheI雙酶切鑒定提取的質(zhì)粒DNA，電泳后應(yīng)該獲得4.7kb和0.3kb兩個條帶。限制性內(nèi)切酶消化中常見的問題和原因。1．DNA完全沒有被限制性內(nèi)切酶切割：①限制性內(nèi)切酶失活；②DNA不純，含有SDS、有機溶劑、EDTA等；③非限制性內(nèi)切酶最佳反應(yīng)條件；④酶切位點被修飾；⑤DNA上不存在該酶的識別順序。2．DNA切割不完全：①限制性內(nèi)切酶活性下降或稀釋不正確；②DNA不純或反應(yīng)條件不佳；③酶切位點被修飾；④部分DNA溶液粘在管