考馬斯亮藍(lán)法測蛋白質(zhì)含量

(完整word版)考馬斯亮藍(lán)法測蛋白質(zhì)含量(完整word版)考馬斯亮藍(lán)法測蛋白質(zhì)含量(完整word版)考馬斯亮藍(lán)法測蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線制作—考馬斯亮藍(lán)法測蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線一般用分光光度法測物質(zhì)的含量,先要制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查出所測物質(zhì)的含量。因此，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線是生物檢測分析的一項(xiàng)基本技術(shù)。蛋白質(zhì)含量測定方法凱氏定氮法雙縮脲法Folin—酚試劑法紫外吸收法考馬斯亮藍(lán)法考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)含量-標(biāo)準(zhǔn)曲線制作（一）、試劑：考馬斯亮藍(lán)試劑：考馬斯亮藍(lán)G—250100mg溶于50ml95%乙醇，加入100ml85％H3PO4,用蒸餾水稀釋至1000ml，濾紙過濾。最終試劑中含0。01％(W/V）考馬斯亮藍(lán)G—250,4.7%(W/V）乙醇，8.5％（W/V）H3PO4。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液:純的牛血清血蛋白，預(yù)先經(jīng)微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量，根據(jù)其純度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液.（二）、器材:1、722S型分光光度計(jì)使用及原理(）。2、移液管使用（）.(三）、標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：試管編號0123456100ug/ml標(biāo)準(zhǔn)蛋白（ml）0。00。10.20。30.40.50.60.15mol/LNaCl（ml）10.90。80.70.60。50.4考馬斯亮藍(lán)試劑（ml)5555555搖勻，1h內(nèi)以1號管為空白對照,在595nm處比色A595nm1、2、以A595nm為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量為橫坐標(biāo)（六個(gè)點(diǎn)為10ug、20ug、30ug、40ug、50ug、60ug)，在坐標(biāo)軸上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。1)、利用標(biāo)準(zhǔn)曲線查出回歸方程。2）、用公式計(jì)算回歸方程。3)、或用origin作圖,測出回歸線性方程。即A595nm=a×X（)+6一般相關(guān)系數(shù)應(yīng)過0。999以上,至少2個(gè)9以上。4）、繪圖時(shí)近兩使點(diǎn)在一條直線上，在直線上的點(diǎn)應(yīng)該在直線兩側(cè).（四）、蛋白質(zhì)含量的測定：樣品即所測蛋白質(zhì)含量樣品(含量應(yīng)處理在所測范圍內(nèi)），依照操作步驟1操作，測出樣品的A595nm，然后利用標(biāo)準(zhǔn)曲線或回歸方程求出樣品蛋白質(zhì)含量。一般被測樣品的A595nm值在0。1—0.05之間，所以上述樣品如果A595nm值太大，可以稀釋后再測A595nm值，然后再計(jì)算。（五）、注意事項(xiàng)：玻璃儀器要洗滌干凈。取量要準(zhǔn)確。玻璃儀器要干燥,避免溫度變化.對照:用被測物質(zhì)以外的物質(zhì)作空白對照。藥品的配制（磷酸緩沖液的配制)一、藥品的配制步驟(一)、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：準(zhǔn)備所需的藥品和玻璃儀器。洗滌。（怎樣洗滌算干凈？)（二）、計(jì)算：1、百分比濃度計(jì)算：1)、G/V比例如配1%NaCl,稱1gNaCl溶于100ml水。2)、V/V比：例如配75%乙醇100ml,75%×100％=100％×X，X=75ml。取75ml無水乙醇，加25ml蒸餾水。乙醇:乙醚：丙酮=2：1：2配500ml，各取200ml，100ml，200ml混合.3）G/V比：用的較少，如計(jì)算灰分中某種元素如Fe的含量。2、摩爾濃度計(jì)算：注:藥品的分子量一般在標(biāo)簽中注明。1）、0.1M或0.1mol/LNaCl配100ml。M=質(zhì)量/體積（L）稱取NaCl0。1×0.1×40=0.4g摩爾數(shù)=G（g）/摩爾質(zhì)量2)、0.1mMNaCl配100mlmM=毫摩爾數(shù)/體積（L)稱取NaCl0.1×0.1×40=0.4g毫摩爾數(shù)=G(mg）/摩爾質(zhì)量3)、0.1uNaCl配100mlmM=微摩爾數(shù)/體積（L）稱取NaCl0.1×0.1×40=0.4mg微摩爾數(shù)=G(ug）/摩爾質(zhì)量稱取NaCl0.1×0.1×40=0.4ug混合溶液配制的計(jì)算:如配3uMEDTA，2。25mMNBT以及60uM溶液100ml，用50mM磷酸緩沖液配制。注意：1、分別標(biāo)定體積計(jì)算2、分別配制再混合，但總體積不能為100ml（三）、標(biāo)量：根據(jù)需要選擇不同量程的天平根據(jù)要求去不同精度的測量器,如量筒或移液管。電子分析天平的使用。(四）、溶解：根據(jù)藥品配置要求選擇溶劑.蒸餾水，雙蒸水，無離子水等。只能用燒杯溶解。注意加入溶劑只能加入總體積的2/3左右，剩余溶劑洗滌燒杯三次左右，直到洗滌干凈。小常識：藥品標(biāo)簽中一般標(biāo)識有藥品的溶解性能和分子式，可根據(jù)分子式和所學(xué)的常識判斷藥品的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)特點(diǎn)（包括溶解性質(zhì)）。如酸堿兩性物質(zhì)的配制（AA、蛋白質(zhì)、核苷酸等)如果溶解性能不好可以用稀酸或稀堿促進(jìn)溶解，但pH應(yīng)在被要求的范圍內(nèi)。加熱促進(jìn)溶解，但注意應(yīng)在配制的范圍內(nèi)有的藥品還需水溶加熱較好。如:配0。1％的淀粉,水裕加熱(溫度在80—90。C)，過量會糊化。（五）、定容：用容量瓶定容；用玻璃棒引流或用小漏斗；用溶劑加入到接近刻度，然后用滴管加入到刻度。要求刻度與液體凹面相切為止（眼睛可視);上下窯洞容量瓶幾次,混合均勻即可.(注意不再定容了，防止溶液漏掉。）（六）、裝入試劑瓶,貼上標(biāo)簽。標(biāo)簽應(yīng)注明以下內(nèi)容：藥品濃度、名稱、配制人、配制日期等。（七）、清理實(shí)驗(yàn)場所.二、磷酸緩沖液的配制。(一）、配制0。2mol/L即0。2MpH=6.8的磷酸緩沖液。用磷酸氫二鈉—磷酸二氫鈉做緩沖液。選用藥品：Na2HPO4·12H2O(堿）和NaH2PO4·12H2O（酸)配緩沖液100ml.書中說明。(二)、計(jì)算:注：書中有注明配置的量.計(jì)算:Na2HPO4·12H2O稱取71.64×0.1=7.164gNaH2PO4·12H2O稱取31.21×0.1=3.121g含有不同結(jié)晶水的換算.書中配1/15mol/L的緩沖液配1L，書中用Na2HPO4·2H2O需要11。87g/L但用Na2HPO4·12H2O需多少g？11。87=（178/358）×X，X=23。87g。（三）、分別配制緩沖液各100ml（根據(jù)需要確定配制的量）.即：0.2MNa2HPO4·2H2O和NaH2PO4·2H2O100ml。（四)、按書中的量配制取量再混合。如：pH=6。8，分別去緩沖對49ml和51ml。(五）、用pH試紙ceni