8-第八章-位點(diǎn)特異性重組與DNA的轉(zhuǎn)座課件

-1第八章位點(diǎn)特異性重組與DNA的轉(zhuǎn)座

1.保守性位點(diǎn)特異性重組2.位點(diǎn)特異性重組的生物學(xué)作用3.轉(zhuǎn)座4.轉(zhuǎn)座子及其調(diào)控本章內(nèi)容-2重組的兩種形式-3一、保守性位點(diǎn)特異性重組（CSSR）1.位點(diǎn)特異性重組發(fā)生在目標(biāo)DNA上的特異序列中。λ噬菌體基因組嵌入宿主染色體中。3種CSSR重組方式。-4參與保守性位點(diǎn)特異性重組的結(jié)構(gòu)。-5

位點(diǎn)特異性重組的分子機(jī)制:attP和attB交錯(cuò)切割發(fā)生重組。λ噬菌體的attP為P.O.P',細(xì)菌的attB為B.O.B'O為attP和attB相同的核心序列,長(zhǎng)15bp,重組發(fā)生在此序列中。attP235bpattB23bpP----O----P’B---O---B’-1520+82-110+11▼——GCTTTTTTATACTAA————CGAAAAAATATGATT———▲

-62.位點(diǎn)特異性重組酶利用共價(jià)蛋白-DNA中間體切割分離與連接DNA。--位點(diǎn)特異性重組酶有兩個(gè)家族:絲氨酸重組酶與酪氨酸重組酶。絲氨酸重組酶與酪氨酸重組酶使用的共價(jià)蛋白-DNA中間體。-7重組酶的家族與功能-8絲氨酸重組酶催化的重組。-9二、位點(diǎn)特異性重組的生物學(xué)作用

細(xì)胞與病毒用位點(diǎn)特異性重組可實(shí)現(xiàn)各種各樣的生物學(xué)功能。

--噬菌體利用重組機(jī)制在感染時(shí)將本身DNA嵌入到宿主染色體中。

--位點(diǎn)特異性重組可用于改變基因表達(dá)。

--位點(diǎn)特異性重組還廣泛用于DNA復(fù)制、同源重組和細(xì)胞分裂周期中保持環(huán)狀DNA分子的結(jié)構(gòu)完整。-101.λ嵌合酶可促進(jìn)病毒基因組與宿主細(xì)胞染色體的嵌合和分離。2.噬菌體λ的分離需要一種新的DNA彎曲蛋白。重組位點(diǎn)。IHF彎曲DNA進(jìn)入DNA結(jié)合位點(diǎn)模型。-113.Hin重組酶反轉(zhuǎn)DNA片段使其他基因表達(dá)。沙門(mén)氏菌感染人類細(xì)胞的電鏡圖沙門(mén)氏菌重組催化DNA反轉(zhuǎn)4.Hin重組需要一個(gè)DNA增強(qiáng)子。5.重組酶將環(huán)狀多聚DNA分子轉(zhuǎn)化為單體。6.其他機(jī)制。-12轉(zhuǎn)座因子的發(fā)現(xiàn)B.McClintock的玉米遺傳研究1951年,B.McClintock根據(jù)長(zhǎng)期對(duì)玉米的遺傳研究,提出了轉(zhuǎn)座（transposition）的概念,提出基因可以移動(dòng)的新觀點(diǎn)。Shapiro的E.coli半乳糖操縱子研究◆半乳糖操縱子——galK基因編碼半乳糖激酶；galT基因編碼半乳糖尿苷酰轉(zhuǎn)移酶；galE基因編碼半乳糖異構(gòu)酶。

三、轉(zhuǎn)座半乳糖操縱子-131.一些遺傳元件通過(guò)轉(zhuǎn)座（transposition）轉(zhuǎn)到新的染色體位置上。2.有3種類型的轉(zhuǎn)座因子。--DNA轉(zhuǎn)座子--類病毒反轉(zhuǎn)座子--poly-A反轉(zhuǎn)座子-14基因組中的轉(zhuǎn)座子:出現(xiàn)位置與分布-15原核生物轉(zhuǎn)座因子類型（1）插入序列（insertionsequence,IS）◆E.coliK12中有IS1,IS2,IS3,IS4,IS5。E.coli的F因子中有IS2,IS3(4個(gè)),γ,δ。◆末端的序列相同或相近,但方向相反,稱為反向重復(fù)序列（IR）,與其相連的宿主DNA末端會(huì)產(chǎn)生正向重復(fù)序列（DR）。◆僅編碼與轉(zhuǎn)座有關(guān)的轉(zhuǎn)座酶,轉(zhuǎn)座酶交錯(cuò)切割宿主DNA,然后IS插入,IS兩端形成DR。

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IS的結(jié)構(gòu)與功能-17

部分IS的結(jié)構(gòu)

IS種類長(zhǎng)度（bp）IR（bp）ID（bp）靶的選擇拷貝數(shù)IS1768239隨機(jī)5-8IS21327415熱點(diǎn)5IS414281811/12AAAN20TTT1-2IS51195164熱點(diǎn)不詳IS10R1329229NGCTNAGCN不詳IS9031057189隨機(jī)不詳-18靶重復(fù)的形成-19（2）復(fù)合轉(zhuǎn)座子（compositetransposon）◆兩端由IS元件組成,元件相同或不相同,方向相同或不相同；兩端元件都有功能或僅一側(cè)元件有功能?！糁行膮^(qū)域編碼抗性標(biāo)記,不同復(fù)合轉(zhuǎn)座子的抗性標(biāo)記不同,例如Kanr、Camr、Strr、Bler等?！魞蓚€(gè)IS元件能夠使它們之間的DNA序列轉(zhuǎn)座。

復(fù)合轉(zhuǎn)座子的結(jié)構(gòu)-20真核生物轉(zhuǎn)座因子玉米的轉(zhuǎn)座因子（1）McClintock的發(fā)現(xiàn)玉米的紅色花青素合成受多基因控制,使胚乳呈紫色。其中任一基因突變都使色素合成受阻,胚乳變白。如果發(fā)生回復(fù)突變,會(huì)導(dǎo)致斑點(diǎn)產(chǎn)生。McClintock發(fā)現(xiàn),色素基因C突變是由“可移動(dòng)的控制因子”引起的,稱為解離因子（dissociator,Ds）,它可插入C基因中。另一可移動(dòng)的控制因子是激活因子（activator,Ac）,Ac能激活Ds轉(zhuǎn)入C基因,也能使Ds從C中轉(zhuǎn)出,這就是Ac-Ds系統(tǒng)。-21玉米色斑的形成-22（2）玉米的控制因子家族McClintock還發(fā)現(xiàn)了Spm-Dspm系統(tǒng)。每個(gè)家族都有自主性因子和非自主性因子。

◆自主性因子有切離和轉(zhuǎn)座能力?？刹迦肴魏挝稽c(diǎn)產(chǎn)生不穩(wěn)定的或可“突變”（mutable）等位基因。自主性因子的丟失,可使可變的等位基因變成穩(wěn)定的等位基因?！舴亲灾餍砸蜃邮欠€(wěn)定的,自身不能轉(zhuǎn)座,來(lái)源于失去反式作用功能的自主因子,而這種功能是轉(zhuǎn)座所必須的?！艨刂埔蜃蛹易迨峭ㄟ^(guò)這兩種因子相互作用來(lái)劃定的。一個(gè)家族由單個(gè)類型的自主因子組成,這些因子由很多種非自主因子相伴隨。-23◆玉米Ac-Ds系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)☉Ac序列由含5個(gè)內(nèi)含子的單個(gè)基因編碼,其產(chǎn)物為轉(zhuǎn)座酶,末端有11bp的IR和8bp的DR。☉Ds是由Ac缺失產(chǎn)生的,Ds9缺失194bp；Ds6只保留2Kb。轉(zhuǎn)座酶失活但保留完整的轉(zhuǎn)座酶作用位點(diǎn)（包括末端）。☉Ac-Ds屬于非復(fù)制型轉(zhuǎn)座,發(fā)生轉(zhuǎn)座后,它們從供體位置上消失。-24果蠅的P因子（1）果蠅的“雜種不育”品系某些果蠅品系雜種后代現(xiàn)一系列缺陷,在P-M系統(tǒng)的雜交中,子一代具有正常的體細(xì)胞組織,但性腺不能發(fā)育。P(♂)×P(♀)—F1正常能育M(♂)×M(♀)—F1正常能育M(♂)×P(♀)—F1正常能育P(♂)×M(♀)—F1不育-25（2）P因子◆研究發(fā)現(xiàn),雜種不育是由于在W位點(diǎn)插入P因子（Pelement）所致,P品系有P因子,M品系無(wú)P因子。◆P因子長(zhǎng)2.9Kb,有4個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF),末端有31bp反向重復(fù)序列,靶DNA產(chǎn)生8bp的正向重復(fù)序列?！粢粋€(gè)P品系果蠅帶有30-50拷貝的P因子,其中1/3具完整結(jié)構(gòu),不完整的P因子是由于缺失而產(chǎn)生的,喪失轉(zhuǎn)座能力?！鬚因子的激活有組織特異性,它僅發(fā)生在生殖細(xì)胞中。但P因子在體細(xì)胞和生殖細(xì)胞中都轉(zhuǎn)錄。組織特異性表現(xiàn)在不同的細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的方式不同（剪接方式不同）。-26（3）P因子的組織特異性表達(dá)◆P因子有3個(gè)內(nèi)含子，4個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORF0-ORF3）◆初始轉(zhuǎn)錄本有2.5Kb和3.0Kb兩種長(zhǎng)度的RNA◆不同組織中產(chǎn)生不同的蛋白質(zhì):在體細(xì)胞中，剪切內(nèi)含子1和內(nèi)含子2，保留內(nèi)含子3；產(chǎn)生ORF0-ORF1-ORF2編碼區(qū)，翻譯成66KDa蛋白，是一種轉(zhuǎn)座的阻遏物。在生殖細(xì)胞中，剪去3個(gè)內(nèi)含子，產(chǎn)生4個(gè)閱讀框的編碼區(qū)，翻譯成87Kda蛋白，是一種轉(zhuǎn)座酶。P基因的結(jié)構(gòu)及其表達(dá)產(chǎn)物-27（4）P(♂)×M(♀)雜種不育的解釋◆雜種不育主要原因是內(nèi)含子3的組織特異性剪接?！鬚(♂)×P(♀)66KDa蛋白阻止P元件轉(zhuǎn)座M(♂)×P(♀)66KDa蛋白阻止P元件轉(zhuǎn)座P(♂)×M(♀)父本P產(chǎn)生87Kda蛋白（轉(zhuǎn)座酶）,導(dǎo)致后代不育。

果蠅不同雜交組合P產(chǎn)物對(duì)育性的影響-283.轉(zhuǎn)座的類型◆復(fù)制型轉(zhuǎn)座:轉(zhuǎn)座元件被復(fù)制，轉(zhuǎn)座的序列是原元件的拷貝。轉(zhuǎn)座子復(fù)制后一個(gè)拷貝保留在原位，一個(gè)拷貝轉(zhuǎn)移到另一位置?！舴菑?fù)制型轉(zhuǎn)座:轉(zhuǎn)座元件從一個(gè)位置轉(zhuǎn)移到另一位置?！舯Ｊ匦娃D(zhuǎn)座:另一類非復(fù)制型轉(zhuǎn)座。轉(zhuǎn)座因子從供體位點(diǎn)上切離，插入靶位點(diǎn)上，供體上轉(zhuǎn)座子兩側(cè)的DNA雙鏈被保留。-29復(fù)制型轉(zhuǎn)座的基本過(guò)程復(fù)制型轉(zhuǎn)座要產(chǎn)生一個(gè)共合體，其原理是:游離的3’端以已連接的轉(zhuǎn)座子為模板進(jìn)行復(fù)制、連接，使轉(zhuǎn)座子產(chǎn)生重復(fù)，形成共合體。共合體的形成Mu噬菌體轉(zhuǎn)座產(chǎn)生共合體-30非復(fù)制型轉(zhuǎn)座的基本原理轉(zhuǎn)座子插入靶DNA,兩側(cè)為靶DNA正向重復(fù)序列,供體部位留下缺口。模式1轉(zhuǎn)座因子和受體分子形成形成交叉結(jié)構(gòu),受體分子的單鏈切口與轉(zhuǎn)座因子單鏈游離末端連接,并在插入位點(diǎn)上產(chǎn)生正向重付序列,通過(guò)交換使轉(zhuǎn)座因子轉(zhuǎn)座到受體分子。模式2供體分子上轉(zhuǎn)座因子兩端產(chǎn)生雙鏈斷裂,使轉(zhuǎn)座因子釋放出來(lái),然后在受體分子產(chǎn)生的交錯(cuò)接口處插曲。

非復(fù)制型轉(zhuǎn)座模式1非復(fù)制型轉(zhuǎn)座模式2-314.反轉(zhuǎn)錄病毒和反轉(zhuǎn)座子

轉(zhuǎn)座子是基因組中獨(dú)立的可移動(dòng)的DNA序列。從DNA到DNA的轉(zhuǎn)移稱為轉(zhuǎn)座。從DNA到RNA再到DNA的轉(zhuǎn)移稱為反轉(zhuǎn)座。反轉(zhuǎn)座是由RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座過(guò)程。以RNA為中間體的轉(zhuǎn)座為真核生物所特有。反轉(zhuǎn)錄病毒能將其RNA基因組的DNA拷貝以原病毒的形式整合到宿主基因組中。一些真核生物轉(zhuǎn)座子的結(jié)構(gòu)與原病毒的結(jié)構(gòu)有關(guān),并且通過(guò)RNA中間體進(jìn)行轉(zhuǎn)座,這一結(jié)構(gòu)單位稱為反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子(retrotransposons)或反轉(zhuǎn)錄子(retroposons)。-32（1）反轉(zhuǎn)錄病毒及其生活周期◆反轉(zhuǎn)錄病毒具有單鏈RNA基因組每個(gè)病毒顆粒包裝有兩個(gè)RNA基因組，因此，單一病毒顆粒實(shí)際上是二倍體?！舴崔D(zhuǎn)錄病毒生活周期反轉(zhuǎn)錄病毒（正鏈病毒）感染細(xì)菌——病毒RNA反轉(zhuǎn)錄DNA（負(fù)鏈DNA）——催化合成第二條DNA鏈（正鏈DNA）——整合到宿主DNA中成為原病毒——轉(zhuǎn)錄生成病毒基因組RNA(轉(zhuǎn)錄出病毒mRNA.翻譯成病毒蛋白質(zhì)或者作為子代病毒基因組）

-33反轉(zhuǎn)錄病毒生活周期-34（2）反轉(zhuǎn)錄病毒基因組結(jié)構(gòu)與功能◆含有3-4個(gè)基因,實(shí)為編碼區(qū),每各編碼區(qū)通過(guò)加工產(chǎn)生多種蛋白（多聚蛋白）,經(jīng)酶切成為單一的蛋白質(zhì)形式?！舴崔D(zhuǎn)錄病毒mRNA通常結(jié)構(gòu),5’端加帽,3’端與polyA相連。◆全長(zhǎng)的mRNA被翻譯時(shí),產(chǎn)物為gag和pol蛋白。翻譯從第一個(gè)起始密碼子開(kāi)始而終止于第一個(gè)終止密碼子,產(chǎn)物為gag蛋白。表達(dá)pol蛋白必需越過(guò)終止密碼子,效率為5%,因此,gag蛋白是gag-pol蛋白的20倍。◆經(jīng)剪切產(chǎn)生一個(gè)短的亞基因組(subgenomic)的mRNA,其表達(dá)產(chǎn)物為env。-35反轉(zhuǎn)錄病毒“基因”的表達(dá)-36（3）反轉(zhuǎn)錄病毒的結(jié)構(gòu)形式◆病毒基因組RNA結(jié)構(gòu)兩個(gè)末端有正向重復(fù)序列R(10-80bp),5’端R之后是U5(80-100bp)；3’端R內(nèi)側(cè)是U3(170-1260bp)?！舨《揪€形雙鏈DNA結(jié)構(gòu)5’端加U3,3’端加U5。U5—R—U3稱為長(zhǎng)末端重復(fù)（LTR）?！粼《綬NA結(jié)構(gòu)（類似轉(zhuǎn)座子）U3和U5末端丟失2bp,靶DNA兩側(cè)產(chǎn)生4-6bp重復(fù)序列-37

LTR的結(jié)構(gòu)-38（4）病毒線性DNA整合到宿主基因組◆整合過(guò)程由整合酶催化,在3’端切除CA兩個(gè)堿基,成為粘性末端。◆靶位點(diǎn)隨機(jī)選擇,交錯(cuò)切割5’端4-6個(gè)堿基。◆整合酶將LTR3’端與靶DNA5’端連接?！粢粋€(gè)連續(xù)感染的細(xì)胞可獲得1-10個(gè)原病毒?！裘總€(gè)LTR的U3有一個(gè)啟動(dòng)子,左側(cè)LTR中的啟動(dòng)子發(fā)起與整合位點(diǎn)相連接的宿主序列的轉(zhuǎn)錄。這個(gè)LTR帶有一個(gè)增強(qiáng)子,可以作用于細(xì)胞和病毒的序列。一個(gè)反轉(zhuǎn)錄病毒的整合可能使某些基因激活,使宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤細(xì)胞。-39（5）病毒類反轉(zhuǎn)座子反轉(zhuǎn)錄病毒是反轉(zhuǎn)座子的范例，其轉(zhuǎn)座能力是由于能編碼反轉(zhuǎn)錄酶和整合酶。反轉(zhuǎn)座子和反轉(zhuǎn)錄病毒的區(qū)別在于其不經(jīng)特異的感染形式，但轉(zhuǎn)座機(jī)制相似。反轉(zhuǎn)座子分為兩類:病毒類反轉(zhuǎn)座子和非病毒類反轉(zhuǎn)座子。-40（6）非病毒類反轉(zhuǎn)座子◆非病毒類反轉(zhuǎn)座子的內(nèi)部和外部結(jié)構(gòu)它們來(lái)源于RNA序列，是細(xì)胞內(nèi)發(fā)生了突變基因的產(chǎn)物?？梢约俣ㄋ鼈兪秦?fù)責(zé)轉(zhuǎn)座的酶系統(tǒng)的底物，但它們不編碼有轉(zhuǎn)座功能的蛋白質(zhì)?！舨溉閯?dòng)物基因組中，有一類核苷酸序列高度相似的重復(fù)序列，主要是基因以外的DNA序列?？煞譃榇?lián)重復(fù)序列和散在重復(fù)序列。它們多來(lái)源于RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座過(guò)程，來(lái)源于反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。散在重復(fù)序列是中度重復(fù)序列，根據(jù)重復(fù)序列的長(zhǎng)度分為兩類:短散在重復(fù)序列(SINEs)和長(zhǎng)散在重復(fù)序列(LINEs)。

-41◆短散在重復(fù)序列(SINEs)長(zhǎng)度在500bp以下,人基因組中有10萬(wàn)以上拷貝。

長(zhǎng)散在重復(fù)序列(LINEs)長(zhǎng)度在1000bp以上,人基因組中有上萬(wàn)拷貝。

◆Alu是SINE家族的典型代表,人基因組中有50萬(wàn)-100萬(wàn)個(gè)拷貝,平均每隔4Kb就有一個(gè)Alu序列。

典型的Alu序列長(zhǎng)282bp有內(nèi)切酶Alu的識(shí)別序列A