化妝品原料祛斑美白功效評(píng)價(jià)試驗(yàn)方法（征求意見稿）編制說明

1T/LNPCXXX-2024化妝品原料祛斑美白功效評(píng)價(jià)試驗(yàn)方法本文件規(guī)定了基于體外人皮膚模型的化妝品原料的祛斑美白功效試驗(yàn)方法。本文件適用于具有生物學(xué)祛斑美白作用的化妝品原料祛斑美白功效試驗(yàn)。本文件可作為化妝品原料祛斑美白功效試驗(yàn)方法之一，對(duì)化妝品原料祛斑美白功效進(jìn)行評(píng)價(jià)。2規(guī)范性引用文件本文件沒有規(guī)范性引用文件。3術(shù)語(yǔ)和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。4原理黑素細(xì)胞位于表皮的基底層，細(xì)胞內(nèi)的黑素小體能合成黑色素，并轉(zhuǎn)移到周圍的角質(zhì)形成細(xì)胞，賦予皮膚顏色。皮膚中黑色素的數(shù)量決定了皮膚的顏色。黑素細(xì)胞刺激激素(α-MSH）可刺激黑素細(xì)胞合成和分泌黑色素，通過酶標(biāo)儀測(cè)定OD值可檢測(cè)黑色素的分泌量。本文件檢測(cè)加入受試樣品后黑素細(xì)胞中黑素分泌量的變化，進(jìn)而反映化妝品原料是否對(duì)皮膚有祛斑美白功效。5儀器及設(shè)備5.1生物安全柜。5.2倒置顯微鏡。5.3CO2培養(yǎng)箱：37℃,95%相對(duì)濕度、5%CO2/空氣。5.4低溫高速離心機(jī)。5.5酶標(biāo)儀：450nm、630nm。5.6分析天平：精度0.1mg。5.7微量移液器：5000μL、1000μL、200μL、20μL。6試劑和耗材6.1黑素細(xì)胞（B16細(xì)胞）。6.2DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基。6.30.25%胰蛋白酶（無菌）。6.4PBS磷酸鹽緩沖液（無菌）。6.5α-MSH7試驗(yàn)步驟7.1體外模型的準(zhǔn)備2T/LNPCXXX-20247.1.1細(xì)胞培養(yǎng)將黑素細(xì)胞用胰蛋白酶作用5min-10min后，用專用培養(yǎng)基終止消化，巴氏吸管吹打細(xì)胞使其成為單細(xì)胞懸液。加入適量培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞懸液使其密度約為1×104個(gè)/mL。用微量移液器吸取細(xì)胞懸液以200μL/孔接種到96孔板中，然后置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h。7.1.2α-MSH刺激待細(xì)胞生長(zhǎng)到融合度為85%-90%左右時(shí)，用微量移液器吸干96孔板內(nèi)的培養(yǎng)基，加入10nMα-MSH刺激3h，空白對(duì)照組不作α-MSH刺激處理。7.2給予化妝品原料試驗(yàn)設(shè)置空白對(duì)照組、α-MSH-對(duì)照組和化妝品原料組。稱取一定量的化妝品原料，將其用DMEM培養(yǎng)基稀釋到試驗(yàn)濃度。用微量移液器吸干96孔板內(nèi)的培養(yǎng)基?？瞻讓?duì)照組、刺激對(duì)照組每孔僅加入200μL培養(yǎng)基，化妝品原料組每孔加入200μL含有化妝品原料的培養(yǎng)基。隨后將96孔板置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72h。7.3樣品收集轉(zhuǎn)移培養(yǎng)液至新的96孔板中，用酶標(biāo)儀檢測(cè)黑色素的分泌量。7.4測(cè)定條件在405nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度，計(jì)算黑色素相對(duì)分泌量。8結(jié)果計(jì)算A試MRS=A試A對(duì)式中：MRS：黑色素相對(duì)分泌量，%；A試：化妝品原料組吸光度；A對(duì)：刺激對(duì)照組吸光度。9結(jié)果判定全部符合以下條件說明化妝品原料具有祛斑美白功效:1、與空白對(duì)照組相比，α-MSH對(duì)照組黑色素相對(duì)含量大于100%，且具有顯著性差異（p＜0.05）。2、與α-MSH對(duì)照組相比，化妝品原料組黑色素含量減少，且具有顯著性差異（p＜0.05）。3T/LNPCXXX-2024參考文獻(xiàn)[1]國(guó)家藥品監(jiān)督管