天然藥化黃酮類化合物

本章內(nèi)容

第一節(jié)概述第二節(jié)理化性質(zhì)第三節(jié)

提取分離第四節(jié)

檢識與結(jié)構(gòu)測定

結(jié)構(gòu)類型波譜特征酸性、顯色反應(yīng)當(dāng)前1頁，共109頁，星期二。此類化合物多為黃色，且具有酮式羰基，故稱黃酮類化合物。廣泛存在于植物中，不少的常用中藥中主要含有此類成分。以黃酮醇類最為常見，其次為黃酮類。大多與糖結(jié)合成苷，稱為黃酮苷類；有的以游離形式存在，即未與糖結(jié)合，稱為游離黃酮或黃酮苷元。當(dāng)前2頁，共109頁，星期二。一、基本結(jié)構(gòu)和分類（一）基本結(jié)構(gòu)1952年以前，黃酮類化合物主要是指基本母核為2-苯基色原酮的一系列化合物。色原酮2-苯基色原酮（黃酮）當(dāng)前3頁，共109頁，星期二。75(2H,d,J=8.脂肪族ROCOCH3（糖上）,其質(zhì)子δ1.取樣品10mg溶于甲醇，加NaBH410mg，再滴加1%濃鹽酸或濃硫酸，呈紅-紫色。是使花、葉、果、莖等呈現(xiàn)藍(lán)、紫、紅等顏色的色素。NaOAc(未熔融)C環(huán)對H-2’,6’的負(fù)屏蔽作用大于對H-3’,5’；Rf值：苷元>苷苷元<苷（TLC色譜鑒別）木犀草素（luteolin）當(dāng)前89頁，共109頁，星期二。當(dāng)前52頁，共109頁，星期二。NaOAc/

H3BO3鄰位碳原子(β-碳)及對位碳則向高場位移酸化時酸性也不易過強(qiáng)，以免生成佯鹽使析出黃酮又溶解了帶Ⅱ的峰位主要受A-環(huán)氧取代程度的影響，但B-環(huán)的取代基可影響它的形狀。當(dāng)前2頁，共109頁，星期二。

現(xiàn)在的黃酮類化合物則泛指兩個苯環(huán)（A與B環(huán)）通過中央三碳鏈相互連接而成的一類化合物。

C6-C3-C6BAC母核上取代基常有酚羥基、甲氧基、甲基、異戊烯基等當(dāng)前4頁，共109頁，星期二。

根據(jù)B環(huán)連接位置（2位或3位）C環(huán)氧化程度（包括2，3位是否存在雙鍵；4位有無－C＝O）C環(huán)是否成環(huán)（1，2位是否開環(huán)）將黃酮類化合物分為以下七大類。1黃酮和黃酮醇2二氫黃酮和二氫黃酮醇3異黃酮和二氫異黃酮醇4查耳酮和二氫查耳酮

5橙酮類

6花色素和黃烷醇類

7其他（二）結(jié)構(gòu)類型BCA當(dāng)前5頁，共109頁，星期二。１．黃酮類（flavones）約占黃酮類化合物總數(shù)的1/4

結(jié)構(gòu)特點2-苯基色原酮為基本母核且3位上無含氧基團(tuán)取代

當(dāng)前6頁，共109頁，星期二。

木犀草素（luteolin）存在于忍冬藤、菊花、金銀花、浮萍中，具有抗菌作用當(dāng)前7頁，共109頁，星期二。２．黃酮醇類（flavonols）

約占黃酮類化合物總數(shù)的1/3結(jié)構(gòu)特點2-苯基色原酮為基本母核3位上連有羥基或其他含氧基團(tuán)當(dāng)前8頁，共109頁，星期二。槲皮素(quercetin)具有抗炎、止咳祛痰等作用。蘆丁(rutin)是槲皮素的３－O蕓香苷。當(dāng)前9頁，共109頁，星期二。３．二氫黃酮類(flavanones)結(jié)構(gòu)特點2-苯基色原酮母核的2、3位雙鍵被氫化而成當(dāng)前10頁，共109頁，星期二。

當(dāng)前11頁，共109頁，星期二。4．二氫黃酮醇類(flavanonols)

結(jié)構(gòu)特點具有黃酮醇類的２、３位被氫化的基本母核常與相應(yīng)的黃酮醇共存于同一植物體中當(dāng)前12頁，共109頁，星期二。

水飛薊素是二氫黃酮醇與苯丙素衍生物縮合成的黃酮木脂素類成分。具有保肝作用，用于治療急、慢性肝炎及肝硬化，代謝中毒性肝損傷。當(dāng)前13頁，共109頁，星期二。5．查耳酮類與二氫查耳酮

結(jié)構(gòu)特點黃酮C環(huán)的1、2位鍵斷裂生成的開環(huán)衍生物，即三碳鏈不構(gòu)成環(huán)。查耳酮α，β位雙鍵氫化二氫查耳酮當(dāng)前14頁，共109頁，星期二。查爾酮其鄰羥基衍生物可視為二氫黃酮的異構(gòu)體，二者可相互轉(zhuǎn)化。二氫黃酮的吡酮環(huán)芳香性低，在堿的作用下易開環(huán)生成6’-羥基查耳酮，由無色轉(zhuǎn)為深黃色，后者經(jīng)酸化又能轉(zhuǎn)化為原來的二氫黃酮。當(dāng)前15頁，共109頁，星期二。紅花苷梨根苷當(dāng)前16頁，共109頁，星期二。6.異黃酮類與二氫異黃酮類結(jié)構(gòu)特點母核為3-苯基色原酮的結(jié)構(gòu)，即B環(huán)連接在C環(huán)的3位上異黃酮的2、3位被氫化

當(dāng)前17頁，共109頁，星期二。當(dāng)前18頁，共109頁，星期二。當(dāng)前6頁，共109頁，星期二。（3）6-及8-C-CH3質(zhì)子當(dāng)前57頁，共109頁，星期二。有無－C＝O）類似正相色譜類似反相色譜NaOAc(未）275,322,367③苷類可水解后（或先甲基化再水解），再用上法測苷元的UV譜以了解糖的連接位置。3(1H,d,J=2.H-3bJ=17Hz（偕偶），11Hz（反偶）9．黃烷-3-醇及黃烷-3，4-二醇類黃酮醇C15H9O3當(dāng)前96頁，共109頁，星期二。當(dāng)前52頁，共109頁，星期二。5,dd,J=9.具有黃酮醇類的２、３位被氫化的基本母核7．雙黃酮類

結(jié)構(gòu)特點二分子黃酮衍生物聚合生成的二聚物，多為兩分子芹菜素通過3’-8”／8’-8”／醚鍵連接構(gòu)成，多分布于裸子植物中。銀杏中含有多種雙黃酮，如銀杏素。

當(dāng)前19頁，共109頁，星期二。8．花色素類一類以離子形式存在的色原烯的衍生物，C環(huán)無羰基。是使花、葉、果、莖等呈現(xiàn)藍(lán)、紫、紅等顏色的色素。以苷的形式存在于細(xì)胞液中。飛燕草苷元當(dāng)前20頁，共109頁，星期二。9．黃烷-3-醇及黃烷-3，4-二醇類

生源上是由二氫黃酮醇類還原而來，可看成是脫去C4位羰基氧原子后的二氫黃酮醇類化合物當(dāng)前21頁，共109頁，星期二。10．橙酮類可看作是黃酮的C環(huán)分出一個碳原子變成五元環(huán)，其余部位不變，但C原子定位有所不同。是黃酮的同分異構(gòu)體，屬于苯駢呋喃的衍生物硫磺菊素當(dāng)前22頁，共109頁，星期二。11．雙苯吡酮類基本母核由苯環(huán)與色原酮的２，3位駢合而成石韋中的異芒果素具有止咳祛痰的功效。

當(dāng)前23頁，共109頁，星期二。12、高異黃酮類

13、其他

黃酮類復(fù)雜衍生物：

包括黃酮木脂體類；生物堿型黃酮等

當(dāng)前24頁，共109頁，星期二。二、黃酮類化合物的生物合成途徑

查耳酮合成酶當(dāng)前25頁，共109頁，星期二。

當(dāng)前26頁，共109頁，星期二。三、黃酮類化合物的生物活性

1.對心血管系統(tǒng)的作用Vp樣作用：蘆丁、橙皮苷，能降低血管脆性及異常通透性，可用作防治高血壓的輔助治療劑。擴(kuò)冠作用：蘆丁、槲皮素、葛根素臨床用于心絞痛和高血壓。降血脂及膽固醇：木樨草素、山楂總黃酮抑制血小板聚集2.抗肝臟毒作用水飛薊素具有保肝作用當(dāng)前27頁，共109頁，星期二。3.抗炎

蘆丁、羥乙基蘆丁、二氫槲皮素等4.抗菌及抗病毒作用

黃芩苷：抗菌山奈酚：抗病毒5.解痙作用

異甘草素、大豆素：解除平滑肌痙攣；6.雌性激素樣作用

大豆素等異黃酮具有雌性激素樣作用可能與它們與己烯雌酚結(jié)構(gòu)類似有關(guān)7.清除人體自由基作用8.抗腫瘤作用

當(dāng)前28頁，共109頁，星期二。第二節(jié)

黃酮類化合物的理化性質(zhì)及顏色反應(yīng)

一、物理性質(zhì)1、性狀多為結(jié)晶性固體，少為（如黃酮苷類）無定形粉末2、旋光性：游離苷元中，除二氫黃酮(醇)、黃烷(醇)及二氫異黃酮類有旋光外，其余無旋光性。苷類由于結(jié)構(gòu)中引入糖的分子，均有旋光性，且多為左旋。當(dāng)前29頁，共109頁，星期二。

3.顏色：①分子中是否存在交叉共軛體系②助色團(tuán)的數(shù)目與位置

色原酮部分原本無色，但在2位引入苯環(huán)后，即形成交叉共軛體系，且通過電子的轉(zhuǎn)移，重排，使共軛鏈延長，而表現(xiàn)出顏色。當(dāng)前30頁，共109頁，星期二。黃酮、黃酮醇及苷類灰黃-黃色查耳酮黃-橙黃色二氫黃酮、二氫黃酮醇無色異黃酮微黃色

其中，黃酮、黃酮醇及苷類、查耳酮等因分子中存在交叉共軛體系，在7,4’位引入-OH,OCH3等供電子基團(tuán)，使化合物顏色加深。

花色素及其苷的顏色隨pH的不同而改變：呈現(xiàn)紅（pH<7），紫（pH8.5）、蘭（pH>8.5）當(dāng)前31頁，共109頁，星期二。二.溶解性符合苷的溶解性規(guī)律。但水溶性與結(jié)構(gòu)的平面性、取代基團(tuán)的種類和數(shù)目等有一定關(guān)系。平面型分子非平面型分子黃酮二氫類（C-環(huán)半椅式結(jié)構(gòu)）黃酮醇異黃酮（羰基與B-環(huán)立體障礙）

查耳酮

R=OH二氫黃酮醇R=H二氫黃酮分子堆砌緊密，分子間引力較大，水溶度小分子間排列不緊密，水分子易于進(jìn)入，水溶度大

（1）分子的立體結(jié)構(gòu)

當(dāng)前32頁，共109頁，星期二。（2）取代基團(tuán)的性質(zhì)、數(shù)目、連接位置引入羥基數(shù)目多，水溶度較大。羥基甲基化（-OCH3）,水溶度降低。（1）三糖苷>雙糖苷>單糖苷>苷元（2）3-O-糖苷>7-O-糖苷（平面性分子）（3）花色素(離子型)>非平面性分子>平面性分子（3）黃酮苷(親水性)易溶于H2O,MeOH,EtOH等，難溶或不溶于苯，氯仿等黃酮類化合物溶解性（極性）規(guī)律:花色素類雖系平面型分子，但因以離子形式存在，具有鹽的通性，故親水性較強(qiáng)，水溶度較大。當(dāng)前33頁，共109頁，星期二。三、酸堿性

（1）酸性

多具有酚羥基而呈酸性可溶于堿性水液：吡啶，甲酰胺及二甲基甲酰胺。酸性規(guī)律a、7，4‘-OH酸性強(qiáng)于其他位置羥基的酸性（處于羰基對位，羰基的共軛誘導(dǎo)）。b、5-OH酸性最弱（處于羰基鄰位，形成分子內(nèi)氫鍵）。c、酚羥基數(shù)目越多，酸性越強(qiáng)。羥基位置酸性溶解性7，4‘-二羥基強(qiáng)溶于5%NaHCO37或4‘-羥基溶于5%Na2CO3一般酚羥基溶于0.2%NaOH5-羥基弱溶于4%NaOH溶液當(dāng)前34頁，共109頁，星期二。（2）堿性

-吡喃酮上的1-位氧原子上有未共用電子對，表性微弱的堿性?？膳c強(qiáng)無機(jī)酸如濃硫酸，鹽酸生成洋鹽，但極不穩(wěn)定，加水即可分解。

在濃硫酸中生成的洋鹽常表現(xiàn)特殊的顏色，可用于鑒別。黃酮、黃酮醇——黃~橙色，并有熒光二氫黃酮——橙紅（冷）、紫紅（熱）查耳酮——橙紅~洋紅異黃酮（二氫）——黃色橙酮——紅~洋紅當(dāng)前35頁，共109頁，星期二。四、顯色反應(yīng)

(一)還原反應(yīng)

1.鹽酸-鎂粉（鹽酸-鋅粉）反應(yīng)——鑒定黃酮、黃酮醇及二氫黃酮、二氫黃酮醇——（＋）

橙紅-紫紅色B環(huán)有-OH或OCH3取代時，顏色隨之加深查耳酮、橙酮、兒茶素——（－）

但遇濃HCL色變，需做空白對照異黃酮——個別陽性，大多陰性當(dāng)前36頁，共109頁，星期二。

2.四氫硼鈉（鉀）反應(yīng)——專屬鑒別二氫黃酮類——（＋)紅-紫色其它——（－）取樣品10mg溶于甲醇，加NaBH410mg，再滴加1%濃鹽酸或濃硫酸，呈紅-紫色。3.磷鉬酸試劑反應(yīng)二氫黃酮類——（＋）棕褐色當(dāng)前37頁，共109頁，星期二。（二）金屬鹽類試劑的絡(luò)合反應(yīng)

黃酮類化合物分子結(jié)構(gòu)中多有一下結(jié)構(gòu)，?？膳c鋁鹽、鉛鹽、鋯鹽、鎂鹽等試劑生成有色絡(luò)合物。1.鋁鹽常用試劑：1%AlCl3或Al(NO3)3生成絡(luò)合物為黃色(

max=415nm)，并有熒光。當(dāng)前38頁，共109頁，星期二。絡(luò)合物穩(wěn)定性次序：3-OH,4-酮基絡(luò)合物>5-OH,4-酮基絡(luò)合物當(dāng)前39頁，共109頁，星期二。當(dāng)前40頁，共109頁，星期二。（三）硼酸顯色反應(yīng)當(dāng)黃酮類化合物分子中適當(dāng)位置上有羥基時，在無機(jī)酸或有機(jī)酸存在條件下，可與硼酸反應(yīng)生成六元環(huán)絡(luò)合物，呈亮黃色

條件：1具有下列結(jié)構(gòu)（5-羥基黃酮，2’-羥基查耳酮）

2有無機(jī)酸或有機(jī)酸存在在草酸存在下，顯黃色并帶綠色熒光。在枸櫞酸丙酮存在條件下，只顯黃色而無熒光。當(dāng)前41頁，共109頁，星期二。（四）堿性試劑顯色反應(yīng)

日光及紫外光下，通過紙斑反應(yīng)，觀察樣品用堿性試劑處理后的色變情況。1.二氫黃酮類易在堿液中開環(huán)，轉(zhuǎn)變成相應(yīng)異構(gòu)體(查耳酮類化合物)，顯橙-紅色。2.黃酮醇類在堿液中先呈黃色，通入空氣后變?yōu)樽厣?/p>

——據(jù)此可與黃酮類區(qū)別。3.黃酮類當(dāng)分子中有鄰二酚羥基取代或3,4’-二羥基取代時，在堿液中不安定，很快氧化，由黃色

深紅色

綠棕色沉淀。

當(dāng)前42頁，共109頁，星期二。(五)與五氯化銻的反應(yīng)

查耳酮的CCl4溶液——紅或紫紅沉淀黃酮、黃酮醇、二氫黃酮類——黃-橙黃色。（六）Gibbs反應(yīng)——5-OH對位未被取代的黃酮。將樣品溶于吡啶中，加入Gibbs試劑顯藍(lán)或藍(lán)綠色。

Gibbs試劑:甲液：0.5%2,6-二氯苯醌-4氯亞胺的乙醇溶液。乙液：硼酸-氯化鉀-氫氧化鉀緩沖液(pH9.4)

當(dāng)前43頁，共109頁，星期二。鑒別下列化合物1.Molish反應(yīng)(+)C(-)AB鋯鹽＋枸櫞酸黃色褪去A黃色不褪B當(dāng)前44頁，共109頁，星期二。鑒別下列化合物2.當(dāng)前45頁，共109頁，星期二。第三節(jié)

黃酮類化合物的提取分離

一、提取

根據(jù)化合物極性不同，溶解性不同，采用不同溶劑提取。

1.苷元

多用CHCl3、Et2O、EtOAc等極性較小有機(jī)溶劑提取

對于多OCH3化的成分，用苯、石油醚提??；對于極性大的成分，如查耳酮、橙酮、雙黃酮、羥基黃酮等，用EtOAc、EtOH、Me2CO、MeOH等溶劑提取。

當(dāng)前46頁，共109頁，星期二。

2.苷類——水或熱水提取，（多糖苷在熱水中溶解度較大，在冷水中溶解度較?。弧部捎肊tOH、MeOH、EtOAc提取。

3.含酚羥基的苷或苷元，可用堿水或堿性醇提取。

當(dāng)前47頁，共109頁，星期二。二、粗提物的精制處理

1．溶劑萃取法黃酮與雜質(zhì)分離依據(jù)：成分之間苷與苷元之間的極性差異苷元與苷元

石油醚液乙醚液乙酸乙酯水飽和正丁醇母液（葉綠素、油脂素（蛋白質(zhì)、糖等等脂溶性雜質(zhì)）回收回收

減壓回收水溶性雜質(zhì))

苷元單糖苷多糖苷

原料的提取濃縮液（水溶液）當(dāng)前48頁，共109頁，星期二。2．

堿水提酸沉淀法

適用于含酚羥基的化合物，此類易溶于堿水，故可用堿水提取，再將堿水提取液調(diào)成酸性，黃酮類即可沉淀析出。注意事項：

①酸堿度不宜過大避免在強(qiáng)堿性、加熱條件下，破壞黃酮母核；酸化時酸性也不易過強(qiáng)，以免生成佯鹽使析出黃酮又溶解了②鄰二酚羥基的保護(hù)堿性條件下，鄰二酚羥基易被氧化，加硼砂保護(hù)③加石灰乳可除去果膠、粘液等水溶性酸性雜質(zhì)（可使含羥基的雜質(zhì)生成鈣鹽沉淀）當(dāng)前49頁，共109頁，星期二。3．

炭粉吸附法

適用于苷類的精制工作。植物的甲醇提取液加活性炭至吸附完全，過濾，得吸附苷的活性炭粉末。依次用沸甲醇、沸水、7%酚/水、15%酚/醇洗脫，分步收集、檢查、合并。大部分苷類可用7%酚/水洗下，經(jīng)減壓濃縮至小體積，乙醚除酚，余下水層經(jīng)減壓濃縮得較純黃酮苷。當(dāng)前50頁，共109頁，星期二。吸附原理異黃酮、二氫黃酮（醇）氯仿-甲醇不同比例（105℃，高度甲基化或乙?；S酮（醇）混合溶劑洗脫活化）（極性小）（加水失活或不活化）（極性大）（80:20:1）等比例1．硅膠柱色譜2．氧化鋁柱色譜（少）具有3-OH或5-OH、4-羰基及鄰二酚羥基黃酮類化合物與鋁離子絡(luò)和而被牢固吸附，難于洗脫。三、分離（一）柱色譜法

分配原理多羥基黃酮醇或黃酮苷類氯仿-甲醇-水當(dāng)前51頁，共109頁，星期二。3.聚酰胺層析(適用于分離醌、酚、黃酮)

原理：酰胺羰基與黃酮酚羥基形成氫鍵締合而吸附，吸附能力與酚羥基多少、位置及介質(zhì)有關(guān)。

——制備分離洗脫劑：常用水-乙醇水可洗下非黃酮的水溶性成分及少數(shù)黃酮苷；10%-30%醇可洗下黃酮苷；50-95%乙醇可洗下黃酮苷元各種溶劑在聚酰胺柱上洗脫能力由弱至強(qiáng)依次為：

水，甲醇，丙酮，氫氧化鈉水溶液，甲酰胺，二甲基甲酰胺，脲素水溶液當(dāng)前52頁，共109頁，星期二。吸附規(guī)律：（1）酚羥基數(shù)目越多，吸附能力越強(qiáng)。（2）酚羥基數(shù)目相同的情況下，酚羥基所處的位置有利于形成分子內(nèi)氫鍵，吸附能力減弱。3-OH或5-OH黃酮的吸附力小于其他位置-OH黃酮；鄰二酚羥基黃酮的吸附力弱于間位或?qū)ξ环恿u基黃酮（3）分子內(nèi)芳香化程度越高，共軛雙鍵越多，吸附力越強(qiáng)。查耳酮>二氫黃酮（4）不同黃酮母核被吸附強(qiáng)弱：黃酮醇>黃酮>二氫黃酮醇>異黃酮（5）與介質(zhì)的關(guān)系：吸附力水（中）>甲醇、乙醇（濃度由低到高）>丙酮>堿性溶劑>甲酰胺>DMF>尿素水洗脫規(guī)律：與吸附規(guī)律正好相反，即吸附能力越強(qiáng)，越難洗脫當(dāng)前53頁，共109頁，星期二。聚酰胺“雙重色譜”原理類似正相色譜類似反相色譜聚酰胺：極性固定相（極性酰胺基團(tuán)）非極性固定相（非極性脂肪鏈）洗脫劑：有機(jī)溶劑（氯仿-甲醇，極性小）含水溶劑（甲醇-水，極性大）先洗脫：苷元>苷叁糖苷>雙糖苷>單糖苷>苷元（柱色譜分離）Rf值：苷元>苷苷元<苷（TLC色譜鑒別）上述規(guī)律也適用于黃酮類化合物在聚酰胺薄層上的行為。不符合氫鍵吸附規(guī)律符合氫鍵吸附規(guī)律當(dāng)前54頁，共109頁，星期二。4.葡聚糖凝膠柱色譜

主要用兩種型號的凝膠Sephadex-G型（適用于水溶性成分分離）Sephadex-LH20型（可用于親脂性成分分離）原理：游離黃酮——吸附作用洗脫順序：極性小

大。黃酮苷類——分子篩作用洗脫順序：分子大

小?？偟南疵擁樞颍?/p>

糖多的苷

糖少的苷

游離苷元（極性小

大）常用洗脫劑：①堿水（0.1mol/LNH4OH），鹽水（0.5mol/LNaCl）②醇及含水醇③含水丙酮，甲醇－氯仿

當(dāng)前55頁，共109頁，星期二。（二）pH梯度萃取法——利用酸性強(qiáng)弱適合于酸性強(qiáng)弱不同的黃酮苷元的分離。根據(jù)黃酮類苷元酚羥基數(shù)目及位置不同其酸性強(qiáng)弱也不同的性質(zhì)，將混合物溶于有機(jī)溶劑，依次用５％NaHCO3,５％Na2CO3,0.2%NaOH,4%NaOH萃取，7,4’-二羥基

7或4’羥基

一般酚羥基

５-羥基黃酮

當(dāng)前56頁，共109頁，星期二。（三）根據(jù)分子中某些特定官能團(tuán)進(jìn)行分離（1）醋酸鉛沉淀法一般酚羥基的成分可被堿式醋酸鉛沉淀，但有鄰二酚羥基的成分可被醋酸鉛沉淀，據(jù)此可將兩類成分分離。

（2）硼酸絡(luò)合法根據(jù)具有鄰二酚羥基的黃酮與硼酸絡(luò)合，生成物易溶于水的性質(zhì)與其它類型黃酮分離。通常在不與水混溶的有機(jī)溶劑如乙醚中，用硼酸液萃取，水相即為鄰二酚羥基類黃酮。當(dāng)前57頁，共109頁，星期二。第四節(jié)

黃酮類化合物的檢識與結(jié)構(gòu)測定

目前主要采用的方法有：①色譜方法與標(biāo)準(zhǔn)品或與文獻(xiàn)對照PPC或TLC得到的Rf②化學(xué)鑒別反應(yīng)顯色、鉛鹽沉淀③光譜方法UV光譜：分析對比樣品在甲醇溶液中及加入酸、堿或金屬鹽類試劑后UV光譜的變化1H-NMR、13C-NMR、MS當(dāng)前58頁，共109頁，星期二。一、色譜法在黃酮類鑒定中的作用

紙層析(PPC)原理：分配原理適用范圍：黃酮苷元及苷的分離鑒別

苷元則多采用醇性溶劑展開，苷類成分可采用雙相展開，第一相展開：醇性溶劑，如BAW系統(tǒng)（正丁醇：醋酸：水4：1：5）—分配原理

第二相展開：水性溶劑，如醋酸水—吸附原理當(dāng)前59頁，共109頁，星期二。雙相色譜

第I向醇性展開劑第II向水性展開劑（BAW、TBA、水飽和正丁醇）（2~6%HAc、3%NaCl、1%HCl）

正相色譜反相色譜固定相（水）極性>流動相Rf規(guī)律：極性小的化合物Rf大極性大的化合物Rf大苷元（0.7以上）>單糖苷>雙糖苷（0.7以下）苷元中，平面型分子>非平面型分子Rf規(guī)律與左邊相反母核相同，一OH>二OH>三OH>四OH>五OH黃酮

苷元的分離鑒別黃酮苷及花色素類當(dāng)前60頁，共109頁，星期二。2.薄層層析(TLC)

１）硅膠薄層用于弱極性黃酮。２）聚酰胺層析適用范圍廣，可分離含游離酚羥基或其苷類。

各種色譜的檢識：日光下觀察—多數(shù)黃酮有黃色斑點紫外光下觀察—多數(shù)黃酮呈黃綠色熒光斑點氨蒸氣熏—多數(shù)黃酮有顏色變化噴顯色劑（2%AlCl3甲醇液）—多數(shù)黃酮黃色變深，熒光加強(qiáng)當(dāng)前61頁，共109頁，星期二。二、紫外光譜在黃酮類鑒定中的應(yīng)用可用于確定黃酮母核類型及確定某些位置是否含有羥基。一般程序：

①測定樣品在甲醇中的UV譜以了解母核類型；②在甲醇溶液中分別加入各種診斷試劑后測UV譜以了解3,5,7,3’,4’有無羥基及鄰二酚羥基；常用的診斷試劑有甲醇鈉（NaOMe）、醋酸鈉（NaOAc）、醋酸鈉/硼酸（NaOAc/H3BO3）、三氯化鋁（AlCl3）及三氯化鋁/鹽酸（AlCl3/HCl）等③苷類可水解后（或先甲基化再水解），再用上法測苷元的UV譜以了解糖的連接位置。當(dāng)前62頁，共109頁，星期二。（一）在甲醇溶液中的紫外光譜

多數(shù)黃酮類化合物由兩個主要吸收帶組成：帶Ⅰ（300-400nm）——由B環(huán)桂皮?；到y(tǒng)引起，主要反應(yīng)B環(huán)取代情況；帶Ⅱ（220-280nm）——由A環(huán)苯甲?；到y(tǒng)引起，主要反應(yīng)A環(huán)取代情況當(dāng)前63頁，共109頁，星期二。

（1）黃酮、黃酮醇：在200-400nm之間出現(xiàn)兩個主要吸收峰，二者峰形相似，但帶Ⅰ位置不同，可據(jù)此進(jìn)行分類。母核上如7-及4‘位引入羥基、甲氧基等供電基取代——相應(yīng)吸收帶紅移通常整個母核上氧取代程度越高，帶Ⅰ越向長波方向位移。帶Ⅱ的峰位主要受A-環(huán)氧取代程度的影響，但B-環(huán)的取代基可影響它的形狀。當(dāng)B環(huán)有3‘，4‘-二氧取代時，帶Ⅱ?qū)殡p峰。當(dāng)前64頁，共109頁，星期二。

（2）查耳酮及橙酮類：

共同特征是帶Ⅰ強(qiáng)，為主峰；帶Ⅱ較弱，為次強(qiáng)峰。查耳酮：帶Ⅱ位于220～270nm；帶Ⅰ位于340～390nm；橙酮：常顯現(xiàn)3～4個吸收峰，但主要吸收峰一般位于370～430nm。（3）異黃酮、二氫黃酮及二氫黃酮醇

有由A-環(huán)苯甲酰系統(tǒng)引起的帶Ⅱ吸收但因B環(huán)不與吡喃酮環(huán)上的羰基共軛（或共軛很弱），故帶Ⅰ很弱。二氫黃酮（醇）異黃酮

當(dāng)前65頁，共109頁，星期二。

帶II(240-285nm)（苯甲酰系統(tǒng)）帶I(300-400nm)桂皮酰系統(tǒng)類型說明250-285304-350黃酮類-OH越多，帶I、II越紅移；B環(huán)3’,4’有-OH基，帶II為雙峰（主峰伴肩峰）328-357黃酮醇類(3-OR)352-385黃酮醇類(3-OH)245-270

異黃酮B環(huán)上有-OH,OCH3對帶I影響不大

270-295

二氫黃酮（醇）220-270(較弱)340-390或340-390(Ia)和300-320(Ib)查耳酮類查耳酮2’或4-OH使帶I紅移370-430(3-4個小峰)橙酮類

當(dāng)前66頁，共109頁，星期二。當(dāng)前67頁，共109頁，星期二。2．加入診斷試劑后引起的位移及結(jié)構(gòu)測定

P191表5－11當(dāng)前68頁，共109頁，星期二。診斷試劑帶II帶I說明樣品+MeOH

250-285304-385

兩峰強(qiáng)度基本相同，具體位置與母核上電負(fù)性取代基(-OH,-OCH3)有關(guān)，-OH,-OCH3越多，越紅移

NaOMe

紅移40-60nm（強(qiáng)度不變）有4’-OH

紅移50-60nm（強(qiáng)度下降）有3-OH，無4’-OH帶I，II隨加NaOMe時間延長，逐漸衰減有3,4’-OH或3,3’,4’-OH等

（對堿敏感）

NaOAc(未熔融)紅移5-20nm

長波一側(cè)有肩峰7-OH有4’－OH，但無3-OH或7-OHNaOAc(熔融)

紅移40-65nm（強(qiáng)度下降）4’－OH隨時間而衰退有3,4’-OH或3,3’,4’-OH等

（對堿敏感）

當(dāng)前69頁，共109頁，星期二。診斷試劑帶II帶I說明NaOAc/

H3BO3

紅移12－30nmB環(huán)有鄰二酚羥基紅移5－10nm

A環(huán)有6,7-OH或7,8-OH(5,6-OH無)AlCl3及AlCl3/HClAlCl3/HCl圖＝AlCl3圖無鄰二酚羥基AlCl3/HCl圖≠AlCl3圖有鄰二酚羥基

紫移30－40nmB環(huán)有鄰二酚羥基紫移50－65nmA、B環(huán)均可能有鄰酚二羥基AlCl3/HCl圖＝MeOH圖無3－及5－OHAlCl3/HCl圖≠MeOH圖可能有3－及或5－OH

紅移35－55nm有5－OH紅移60nm有3－OH紅移50－60nm可能同時有3－及5－OH紅移17－20nm除有5－OH外還有6－含氧取代當(dāng)前70頁，共109頁，星期二。說明：1）+NaOMe（堿性強(qiáng)）,所有酚OH解離，紅移

另有有3,4’-OH或3,3’,4’-OH時，在NaOMe作用下易氧化破壞，故峰有衰減。2）NaOAc為弱堿，僅使酸性較強(qiáng)者，如7,4’-OH解離。當(dāng)前71頁，共109頁，星期二。3）與ALCL3形成絡(luò)合物的能力：3-OH黃酮醇>5-OH黃酮>鄰二酚羥基>5-OH二氫黃酮醇不在酸性條件下，五者皆與Al3+絡(luò)合但酸性條件下，鄰二酚羥基和5-OH二氫黃酮醇不與AlCl3絡(luò)合二者相減可檢測鄰二酚羥基。形成絡(luò)合物越穩(wěn)定，紅移越多。

當(dāng)前72頁，共109頁，星期二。H-2’,6’7.在草酸存在下，顯黃色并帶綠色熒光。二氫黃酮類——（＋）棕褐色羥基位置酸性溶解性苷元的分離鑒別黃酮苷及花色素類色原酮部分原本無色，但在2位引入苯環(huán)后，即形成交叉共軛體系，且通過電子的轉(zhuǎn)移，重排，使共軛鏈延長，而表現(xiàn)出顏色。常見4’-氧代或3’、4’-二氧代當(dāng)前61頁，共109頁，星期二。將樣品溶于吡啶中，加入Gibbs試劑顯藍(lán)或藍(lán)綠色。約占黃酮類化合物總數(shù)的1/35(1H,d,J=2.H-1″位于低場吸附原理異黃酮、二氫黃酮（醇）氯仿-甲醇不同比例色原酮部分原本無色，但在2位引入苯環(huán)后，即形成交叉共軛體系，且通過電子的轉(zhuǎn)移，重排，使共軛鏈延長，而表現(xiàn)出顏色。

A環(huán)質(zhì)子B環(huán)質(zhì)子C環(huán)質(zhì)子糖上質(zhì)子取代基團(tuán)質(zhì)子芳環(huán)質(zhì)子芳環(huán)質(zhì)子與類型有關(guān)端基質(zhì)子-OH、-CH3、其它質(zhì)子-OCH3、-OCOCH3黃酮類化合物各質(zhì)子的信號特征（δ、峰形狀、J、峰面積）δA-H5.7~7.1常見5，7-二OH或7-OH取代δB-H6.5~7.9常見4’-氧代或3’、4’-二氧代gluH-1″位于低場δ較大4.8~5.70ppm三、1H-NMR當(dāng)前73頁，共109頁，星期二。（一）A環(huán)質(zhì)子

1．5,7-二OH黃酮

H-6及H-8δ5.7~6.9（J=2.5Hz）二重峰H-6較H-8在高場7-OH成苷時，則H-6及H-8信號均向低場位移。當(dāng)前74頁，共109頁，星期二。

1)黃酮（醇）及異黃酮：

H-6(6.0～6.2,d,J=2.5Hz)；H-8(6.3～6.5,d,J=2.5Hz)

7-O-糖苷：H-6(6.2～6.4,d,J=2.5Hz)；H-8(6.5～6.9,d,J=2.5Hz)2)二氫黃酮及二氫黃酮醇：H-6(5.7～5.9,d,J=2.5Hz)；H-8(5.9～6.1,d,J=2.5Hz) 7-O-糖苷：H-6(5.9～6.1,d,J=2.5Hz)；H-8(6.1～6.4,d,J=2.5Hz)當(dāng)前75頁，共109頁，星期二。2．7-OH黃酮

H-5較H-6、H-8低場，是由于羰基的負(fù)屏蔽效應(yīng)的影響。H-6、H-8較5,7-二OH黃酮中處于低場，且相互位置可能顛倒。當(dāng)前76頁，共109頁，星期二。

1）黃酮、黃酮醇及異黃酮：

H-5（7.9～8.2,d,J=9.0Hz）H-6（6.7～7.1,dd,J=9.0,2.5Hz）H-8（6.7～7.0,d,J=2.5Hz)2）二氫黃酮及二氫黃酮醇：H-5(7.7～7.9,d,J=9.0Hz)H-6(6.4～6.5,dd,J=9.0,2.5Hz)H-8(6.3～6.4,d,J=2.5Hz)當(dāng)前77頁，共109頁，星期二。（二）

B環(huán)質(zhì)子1．4’-氧取代黃酮類化合物δ6.5-8.1

C環(huán)對H-2’,6’的負(fù)屏蔽作用大于對H-3’,5’；H-3’,5’受4’-OR的屏蔽作用——H-2’,6’較H-3’,5’處于低場；C環(huán)氧化程度越高，H-2’,6’處于越低場的位置。

H-3’,5’

6.5-7.1,d,J=8.5HzH-2’,6’

7.1-8.1,d,J=8.5Hz當(dāng)前78頁，共109頁，星期二。H-2‘,H-6‘δ7.1～8.1(d,J=7～9Hz)與C環(huán)有關(guān)，據(jù)此可判斷C環(huán)氧化程度。二氫黃酮類(7.1～7.3,d);二氫黃酮醇類(7.2～7.4,d);異黃酮類(7.2～7.5,d)；查耳酮類H-2,H-6(7.4～7.6,d);橙酮類(7.6～7.8,d)；黃酮類(7.7～7.9,d);黃酮醇類(7.9～8.1,d)當(dāng)前79頁，共109頁，星期二。2．3’,4’-二氧取代黃酮類化合物

H-2’受C環(huán)負(fù)屏蔽和3’-OR屏蔽作用，H-6’也受C環(huán)負(fù)屏蔽作用，H-5’則僅4’-OR屏蔽作用故由低場到高場的順序為：H-6’

H-2’

H-5’。（1）3’,4’-二氧取代黃酮及黃酮醇H-5’

6.7-7.1d,J=8.5HzH-2’

7.2-7.9d,J=2.5HzH-6’

7.2-7.9dd,J=2.5,8.5Hz當(dāng)前80頁，共109頁，星期二。（2）3’,4’-二氧取代異黃酮、二氫黃酮及二氫黃酮醇H-2’,5’,6’常作為一個復(fù)雜多重峰（通常為兩組峰）

6.7-7.13．3’,4’,5’-三氧取代黃酮類化合物若R1=R2=R3=H，則H-2’,6’為單峰，

6.7-7.5若上述條件不成立，則H-2’,6’分別為二重峰（J=2Hz）當(dāng)前81頁，共109頁，星期二。（三）

C環(huán)質(zhì)子

C環(huán)特征是區(qū)別各類型黃酮類化合物的主要依據(jù)

1.黃酮類

H-3δ6.3（s）當(dāng)前82頁，共109頁，星期二。2.異黃酮類

H-2位于羰基

位，同時受羰基和苯環(huán)的負(fù)屏蔽作用，且通過碳與氧相連，故較一般芳香質(zhì)子低場。

H-2δ7.6-7.8(S)當(dāng)前83頁，共109頁，星期二。3.二氫黃酮和二氫黃酮醇

1)二氫黃酮

H-3a,H-3b，dd，δ2.8H-3aJ=17Hz（偕偶），5Hz（順偶）H-3bJ=17Hz（偕偶），11Hz（反偶）

H-2,dd,δ5.2,Jtrans=11Hz（反偶）Jcis=5Hz（順偶）當(dāng)前84頁，共109頁，星期二。（2）二氫黃酮醇

3-OH苷化，供電子能力下降，兩個氫的δ值升高（向低場位移），可用于判斷二氫黃酮醇苷中糖的位置。

H-2與H-3為反式雙直立鍵，J=11HzH-2δ4.9,dH-3δ4.3,d當(dāng)前85頁，共109頁，星期二。4.查耳酮

5.橙酮當(dāng)前86頁，共109頁，星期二。（四）

糖上的質(zhì)子

單糖與苷元相連時，糖上1?-H與其它H比較，一般位于較低磁場區(qū)（

4.0-6.0）

。-OR(R=苷元)表現(xiàn)吸電子的誘導(dǎo)作用，端基H受兩個O的誘導(dǎo),故處于低場葡萄糖位于不同位置時端基H化學(xué)位移的區(qū)別：

C3-OR1?-H

約為5.8

C-5,C-6,C-7,C-4’-OR1?-H

約為4.8-5.2

鼠李糖C-CH3δ0.8-1.2當(dāng)前87頁，共109頁，星期二。（五）取代基質(zhì)子（1）乙酰氧基質(zhì)子 脂肪族ROCOCH3（糖上）,其質(zhì)子δ1.6～2.1,芳香族ArOCOCH3（苷元上）,其質(zhì)子δ2.3～2.5，質(zhì)子數(shù)與苷元酚OH數(shù)有關(guān)。（2）甲氧基質(zhì)子-OCH3一般在δ3.5～4.10(3Hs)（3）6-及8-C-CH3質(zhì)子6-及8-C-CH3δ2.0～2.5其中6-位CH3質(zhì)子的化學(xué)位移較8位CH3質(zhì)子小0.2ppm左右。（4）酚羥基質(zhì)子5-OHδ12.40(12.99)7-OHδ10.933-OHδ9.704’-OHδ(10.01)3’-OHδ(9.42)當(dāng)前88頁，共109頁，星期二。四、13C-NMR（一）骨架類型的判斷

根據(jù)中央三碳鏈的碳信號，即先根據(jù)羰基碳的δ值，再結(jié)合C2、C3的裂分和δ值判斷。當(dāng)前89頁，共109頁，星期二。C=OC-2（或C-β）C-3（或C-α）歸屬168.6~169.8(s)137.8~140.7(d)122.1~122.3(s)異橙酮類

174.5~184.0(s)160.5~163.2(s)104.7~111.8(d)黃酮類

149.8~155.4(d)122.3~125.9(s)異黃酮類147.9(s)136.0(d)黃酮醇類182.5~182.7(s)146.1~147.7(s)111.6~111.9(d)(=CH-)橙酮類

188.0~197.0(s)

136.9~145.4(d)116.6~128.1(d)查耳酮類75.0~80.3(d)42.8~44.6(t)二氫黃酮類82.7(d)71.2(d)二氫黃酮醇當(dāng)前90頁，共109頁，星期二。（二）黃酮類化合物取代圖式的確定方法

黃酮類化合物中芳香碳原子的信號特征可以用來確定取代基的取代圖式。以黃酮為例，其13C-NMR信號如下所示：

黃酮母核13C-NMR信號歸屬當(dāng)前91頁，共109頁，星期二。XZiZoZmZpOH26.6-12.81.6-7.1OCH331.4-14.41.0-7.8-OH及-OCH3的引入使：直接相連碳原子(α-碳)大幅度地向低場位移間位碳雖也向低場位移，但幅度很小鄰位碳原子(β-碳)及對位碳則向高場位移1.推斷取代基的連接位置——依取代基的位移效應(yīng)規(guī)律當(dāng)前92頁，共109頁，星期二。A-環(huán)上引入取代基時，位移效應(yīng)只影響到A環(huán)，而B-環(huán)上引入取代基時，位移效應(yīng)只影響到B環(huán)。若是一個環(huán)上同時引入幾個取代基時，其位移效應(yīng)將具有某種程度的加和性。當(dāng)前93頁，共109頁，星期二。2．確定5，7-二羥基取代黃酮圖式

C-6(d)及C-8(d)信號在δ90．0～100．0C-6信號總是比C-8信號出現(xiàn)在較低的磁場

尤其在黃酮及黃酮醇中差別較大，約為4.8。當(dāng)前94頁，共109頁，星期二。3.確定黃酮類化合物O-苷中糖的連接位置

（1）糖的苷化位移酚性苷中，糖上端基碳的苷化位移約為+4.0～+6.0。（2）苷元的苷化位移

苷元糖苷化后：與糖直接相連碳原子（a-C）向高場位移，δ降低鄰位及對位碳原子則向低場位移，δ增大，且對位碳原子的位移幅度大而且恒定。當(dāng)前95頁，共109頁，星期二。五、質(zhì)譜在黃酮類結(jié)構(gòu)測定中的應(yīng)用

黃酮類化合物主要有下列兩種基本裂解途徑：途徑-I（RDA裂解）：

裂解規(guī)律1．分子離子峰為基峰—用于測定分子量。2．主要碎片離子峰為裂解途徑I產(chǎn)生的A1和B1及裂解途徑II產(chǎn)生的B2120102當(dāng)前96頁，共109頁，星期二。途徑-II

兩種途徑裂解得到的碎片離子A1、B1、B2等，保留著A-環(huán)、B-環(huán)的基本骨架，且碎片A1與相應(yīng)的B1碎片的質(zhì)荷比之和等于分子離子的質(zhì)荷比母核推斷，A、B-環(huán)取代情況確定此外，還有分子離子M+生成[M-1]+(M-H)及[M-28]+(M-CO)；由A1生成[M-28]+(A1-CO)及B2生成[B2-28]+(B2-CO)等碎片離子。當(dāng)前97頁，共109頁，星期二。-H

黃酮類化合物基本裂解當(dāng)前98頁，共109頁，星期二。M+（基峰），M-28（M-CO），120（A1+），102（B1+），92（A1+-CO）A、B-環(huán)的取代圖式可分別通過測定A1+.B1+.的m/z的值進(jìn)行推斷1．黃酮類主要按途徑－Ⅰ進(jìn)行裂解化合物A1+.B1+.黃酮1201025，7-二羥基黃酮1521025，7，4'-三羥基黃酮（