污泥中糞大腸菌群的測定 酶底物法-編制說明

PAGE1目錄TOC\o"1-2"\h\u102061項目背景 220251.1任務(wù)來源 2202591.2工作過程 251362標(biāo)準(zhǔn)制修訂的必要性分析 4172582.1被測對象（糞大腸菌群）對環(huán)境的影響 443962.2相關(guān)生態(tài)環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)和生態(tài)環(huán)境管理工作的需要 4209642.3現(xiàn)行環(huán)境監(jiān)測分析方法標(biāo)準(zhǔn)的實施情況和存在問題 565153國內(nèi)外相關(guān)分析方法研究 6201183.1主要國家、地區(qū)及國際組織相關(guān)分析方法研究 6207173.2國內(nèi)相關(guān)分析方法研究 6217804標(biāo)準(zhǔn)制修訂的基本原則和技術(shù)路線 755804.1標(biāo)準(zhǔn)制修訂的基本原則 7245904.2標(biāo)準(zhǔn)制訂的技術(shù)路線 8164405方法研究報告 8303035.1方法研究的目標(biāo) 8219295.2方法原理 9249585.3試劑和材料 9297175.4儀器的選擇 10165095.5樣品 10287645.6分析步驟 11200815.7結(jié)果計算與表示 1288476方法對比 1399176.1方法比對方案 17255616.2方法比對結(jié)果 17142167方法驗證 2452207.1方法驗證方案 24221647.2方法驗證過程及結(jié)論 25196618參考文獻 2624446附件一方法驗證報告 27《污泥中糞大腸菌群的測定酶底物法》編制說明項目背景1.1任務(wù)來源根據(jù)《廣西標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會關(guān)于下達2022年第八十一批團體標(biāo)準(zhǔn)制修訂項目計劃的通知》（桂標(biāo)協(xié)〔2022〕199號）文件精神，由廣西環(huán)境科學(xué)學(xué)會提出，廣西北投環(huán)保水務(wù)集團有限公司、廣西壯族自治區(qū)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心、廣西壯族自治區(qū)分析測試研究中心、廣西標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會共同起草的團體標(biāo)準(zhǔn)《污泥中糞大腸菌群的測定酶底物法》（項目編號：2022-8104）已獲批立項。1.2工作過程1.2.1成立標(biāo)準(zhǔn)編制小組團體標(biāo)準(zhǔn)《污泥中糞大腸菌群的測定酶底物法》項目任務(wù)下達后，廣西北投環(huán)保水務(wù)集團有限公司等單位成立了標(biāo)準(zhǔn)編制工作組，起草單位制定了起草編寫方案與進度安排，明確任務(wù)職責(zé)，確定工作技術(shù)路線，開展標(biāo)準(zhǔn)研制工作。具體標(biāo)準(zhǔn)編制工作由廣西北投環(huán)保水務(wù)集團有限公司、廣西壯族自治區(qū)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心、廣西壯族自治區(qū)分析測試研究中心、廣西標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會等起草單位相關(guān)人員負(fù)責(zé)。為高質(zhì)量編制團體標(biāo)準(zhǔn)《污泥中糞大腸菌群的測定酶底物法》，對標(biāo)準(zhǔn)編制工作組進行如下分工：表1標(biāo)準(zhǔn)編制小組分工主要起草人(單位)承擔(dān)的工作王莉莉（廣西上善若水發(fā)展有限公司）項目負(fù)責(zé)人，負(fù)責(zé)項目申請立項、整體構(gòu)思、編制思路及整體定位、項目技術(shù)把控及項目的整體組織和推進等。王莉莉（廣西上善若水發(fā)展有限公司）廣西標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會用SET2020軟件對標(biāo)準(zhǔn)文檔進行編輯；按GB/T1.1—2020要求對標(biāo)準(zhǔn)文本進行修改與撰寫；按專家提出的意見修改標(biāo)準(zhǔn)文本；匯總和撰寫編制說明，匯總征求意見，撰寫標(biāo)準(zhǔn)解讀、上報函等技術(shù)資料。王莉莉（廣西上善若水發(fā)展有限公司）潘尚麗（廣西壯族自治區(qū)分析測試研究中心）負(fù)責(zé)標(biāo)準(zhǔn)的研制工作：包括研制實驗以及方法文本、研制報告、編制說明的撰寫并征集意見等工作。何東明、劉小萍、李世龍（廣西壯族自治區(qū)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心）盧安根、潘尚麗（廣西壯族自治區(qū)分析測試研究中心）鄧文艷、蒙金燕、禤曉艷（廣西城市供水水質(zhì)監(jiān)測網(wǎng)防城港監(jiān)測站)王莉莉、馮金榮、秦國富（廣西上善若水發(fā)展有限公司）馬骉、曹珊（南京水務(wù)集團有限公司排水水質(zhì)監(jiān)測中心）白濤、王紹艷（昆明市城市排水監(jiān)測站）劉曉穎、李洪、莫婉湫（東莞市東江檢測有限公司）負(fù)責(zé)標(biāo)準(zhǔn)的驗證工作：包括驗證實驗、驗證報告的撰寫工作。王莉莉、馮金榮（廣西上善若水發(fā)展有限公司）盧安根（廣西壯族自治區(qū)分析測試研究中心）負(fù)責(zé)驗標(biāo)檢測結(jié)果數(shù)據(jù)的統(tǒng)計、分析工作。韋純忠（南寧市水安全工程技術(shù)研究中心）蔣嚴(yán)波（南寧市城鄉(xiāng)供水排水工程研究中心）吳家勇（廣西上善若水發(fā)展有限公司）管運濤（清華大學(xué)深圳國際研究生院）申佩弘（廣西大學(xué)）李悅（深圳市水務(wù)（集團）有限公司水質(zhì)監(jiān)測站）負(fù)責(zé)標(biāo)準(zhǔn)的專業(yè)技術(shù)指導(dǎo)工作。申學(xué)安、凌威（廣西澤霖環(huán)保水務(wù)有限公司）張振國、羅皓百、吳章雁、朱高俊、肖新春、冉琪、勞靜丹、林勇（廣西北投環(huán)保水務(wù)集團有限公司）負(fù)責(zé)標(biāo)準(zhǔn)文本的校核工作：包括標(biāo)準(zhǔn)文本和編制說明的校核工作。鐘文輝、梁智勇、祁效鈺、文君娟、韓靜嫻、黃義群（廣西北投環(huán)保水務(wù)集團有限公司）負(fù)責(zé)組織樣品采樣、運輸工作。1.2.2查詢國內(nèi)外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和文獻資料標(biāo)準(zhǔn)編制小組根據(jù)國家環(huán)保標(biāo)準(zhǔn)修訂工作管理辦法的相關(guān)規(guī)定，檢索、查詢和收集國內(nèi)外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和文獻資料，了解掌握測定分析方法的國內(nèi)外最新技術(shù)發(fā)展情況，對現(xiàn)有各種方法和監(jiān)測工作需求開展調(diào)查研究。1.2.3確定標(biāo)準(zhǔn)制訂技術(shù)路線，制訂原則2022年11月，編寫項目任務(wù)計劃，確定了本標(biāo)準(zhǔn)的具體內(nèi)容、原則、技術(shù)路線等內(nèi)容，明確污泥中糞大腸菌群為本標(biāo)準(zhǔn)的分析對象，在眾多方法中，酶底物法具有操作簡便、假陽性低、結(jié)果可靠、檢驗周期短等優(yōu)點而廣泛應(yīng)用，成為糞大腸菌群檢驗的最佳分析方法，因此確定檢測方法為酶底物法。1.2.4編寫標(biāo)準(zhǔn)草稿和編制說明草稿2022年12月，本標(biāo)準(zhǔn)編制組經(jīng)過大量文獻調(diào)研和基礎(chǔ)實驗，建立了酶底物法測定污泥中糞大腸菌群的方法，編制完成了《污泥中糞大腸菌群的測定酶底物法》（草案）和編制說明草稿。1.2.5方法驗證工作2023年1月～4月，組織了3家具備檢驗檢測機構(gòu)資質(zhì)的實驗室進行6組方法驗證試驗，組織廣西區(qū)外3家具備檢驗檢測機構(gòu)資質(zhì)的實驗室進行方法比對驗證試驗。于2023年4月28日收回全部的驗證報告，在此基礎(chǔ)上進行數(shù)據(jù)匯總和分析整理工作，并編寫完成了《污泥中糞大腸菌群的測定酶底物法》驗證報告。同時完善《污泥中糞大腸菌群的測定酶底物法》征求意見稿及其編制說明。1.2.6編寫標(biāo)準(zhǔn)征求意見稿和編制說明2023年2月～4月，標(biāo)準(zhǔn)編制工作組多次召開標(biāo)準(zhǔn)研制會議，對標(biāo)準(zhǔn)征求意見稿初稿進行了反復(fù)修改和研究討論。最終定稿形成了團體標(biāo)準(zhǔn)《污泥中糞大腸菌群的測定酶底物法》征求意見稿及其編制說明。標(biāo)準(zhǔn)制修訂的必要性分析2.1被測對象（糞大腸菌群）對環(huán)境的影響污泥是城鎮(zhèn)污水處理廠（凈化廠）在污水凈化處理過程中產(chǎn)生的含水率不同的半固態(tài)或固態(tài)物質(zhì)，不包括柵渣、浮渣和沉砂池砂礫。隨著我國經(jīng)濟的快速發(fā)展、人們環(huán)保意識的日益增強和城市污水處理率的不斷提高，污泥的安全處置問題愈加突出。污泥中病原微生物的種類和數(shù)量繁多，當(dāng)這些含有病原微生物的污泥施入土壤后，會對生態(tài)環(huán)境安全和人類健康構(gòu)成威脅。總大腸菌群是指一類在37℃下24小時內(nèi)發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧及兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。糞大腸菌群又稱為耐熱大腸菌群，是總大腸菌群的一部分，在44.5℃下能生長并發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，主要包括埃希氏菌屬和耐熱的克雷伯氏菌屬細(xì)菌。糞大腸菌群在自然界中分布廣泛，是我國環(huán)境衛(wèi)生管理中最具有代表性的衛(wèi)生學(xué)指標(biāo)，在許多環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和污染物排放標(biāo)準(zhǔn)中均有標(biāo)準(zhǔn)限值的規(guī)定。糞大腸菌群主要來源于人和動物的糞便，因此在衛(wèi)生學(xué)中可以指示糞便污染。糞大腸菌群濃度的高低，表明了糞便污染的程度，也反映了對人體健康危害性的大小。2.2相關(guān)生態(tài)環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)和生態(tài)環(huán)境管理工作的需要目前，我國對城鎮(zhèn)污水處理廠污泥污質(zhì)、污泥排放、污泥處置利用等已制定了相關(guān)的國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)共9項（見表2），對污泥的糞大腸菌群指標(biāo)有限值要求，同時，依據(jù)CJJ60-2011《城鎮(zhèn)污水處理廠運行、維護及安全技術(shù)規(guī)程》要求，城鎮(zhèn)污水處理廠污泥分析化驗項目糞大腸菌群的分析周期為每月1次；HJ978-2018《排污許可證申請與核發(fā)技術(shù)規(guī)范水處理（試行）》對污泥控制標(biāo)準(zhǔn)中要求：城鎮(zhèn)污水處理廠的污泥穩(wěn)定化處理后應(yīng)達到GB18918要求；污泥產(chǎn)物農(nóng)用時應(yīng)滿足GB4284要求等。表2相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)匯總表序號污泥相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)/行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)糞大腸菌群菌值指標(biāo)要求1GB/T24188-2009《城鎮(zhèn)污水處理廠污泥污質(zhì)》＞0.012GB18918-2002《城鎮(zhèn)污水處理廠污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》＞0.01(好氧堆肥)3GB4284-2018《農(nóng)用污泥污染物控制標(biāo)準(zhǔn)》≥0.014GB/T23485-2009《城鎮(zhèn)污水處理廠污泥處置混合填埋泥質(zhì)》＞0.015GB/T23486-2009《城鎮(zhèn)污水處理廠污泥處置園林綠化用泥質(zhì)》＞0.016GB/T24600-2009《城鎮(zhèn)污水處理廠污泥處置土地改良用泥質(zhì)》＞0.017GB/T25031-2010《城鎮(zhèn)污水處理廠污泥處置制磚用泥質(zhì)》＞0.018CJ/T362-2011《城鎮(zhèn)污水處理廠污泥處置林地用泥質(zhì)》≥0.019GB18466-2005《醫(yī)療機構(gòu)水污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》糞大腸菌群數(shù)≤100MPN/g2.3現(xiàn)行環(huán)境監(jiān)測分析方法標(biāo)準(zhǔn)的實施情況和存在問題目前我國關(guān)于污泥中糞大腸菌群的測定方法有濾膜法、發(fā)酵法(多管發(fā)酵法），有關(guān)使用酶底物法測定糞大腸菌群的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)有：HJ1001-2018《水質(zhì)總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測定酶底物法》，該標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了測定水中總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的酶底物法，適用于地表水、地下水、生活污水和工業(yè)廢水中總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測定；DB12/T956-2020《奶牛場糞污中總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測定酶底物法》，該標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了基于酶底物法測定規(guī)?；膛黾S污中總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的技術(shù)要求及操作方法，適用于規(guī)?；膛黾S污中總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的同時測定；DB61/T1138-2018《水質(zhì)糞大腸菌群的測定酶底物法》,該標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了水中糞大腸菌群測定的酶底物法的術(shù)語和定義、方法原理、試劑與材料、儀器與設(shè)備、樣品、分析步驟、結(jié)果計算與表示、質(zhì)量保證和質(zhì)量控制、廢物處理的要求,適用于地表水、生活污水和廢水中糞大腸菌群的測定。上述標(biāo)準(zhǔn)檢測適用范圍為水質(zhì)和牛場糞污，與污泥有所區(qū)別，不適用于檢測城鎮(zhèn)污水處理廠污泥、排水管道通挖污泥、污泥衍生產(chǎn)品中的糞大腸菌群。國內(nèi)外相關(guān)分析方法研究3.1主要國家、地區(qū)及國際組織相關(guān)分析方法研究 酶底物法技術(shù)已廣泛應(yīng)用于國內(nèi)外各類水質(zhì)中的總大腸菌群、糞大腸菌群、大腸埃希氏菌、腸球菌、銅綠假單胞菌等項目的檢測，獲得全球近50個國家的認(rèn)證、全球20多個組織發(fā)放的100多項認(rèn)證認(rèn)可，包括美國EPA認(rèn)證、ISO認(rèn)證等。如：美國EPA40CFR136.3，美國SM9223B；國內(nèi)GB5750，HJ1001以及農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、地方標(biāo)準(zhǔn)、團體標(biāo)準(zhǔn)中都有酶底物法測定水質(zhì)中微生物項目的標(biāo)準(zhǔn)化文件。英國環(huán)境署《TheMicrobiologyofSewageSludge（2003）》第3部分推薦采用酶底物法檢測污水污泥中的大腸埃希氏菌。GB5750國標(biāo)在國內(nèi)首次引入酶底物法，從2006年至今已經(jīng)17年，在國內(nèi)酶底物法的方法原理、檢測方法的普及及實際應(yīng)用已有廣泛的基礎(chǔ)。3.2國內(nèi)相關(guān)分析方法研究目前關(guān)于糞大腸菌群的檢測方法有很多，主要有多管發(fā)酵法、紙片法、濾膜法、酶底物法等。多管發(fā)酵法需要的試劑和器材比較多，分析步驟多，檢測周期長，培養(yǎng)基保存時間短，陽性結(jié)果還需平板分離、革蘭氏染色鏡檢、復(fù)發(fā)酵試驗，需檢測人員花費大量的時間，不能快速判斷樣品的污染狀況，不適用于應(yīng)急和樣品量較大時檢測使用。紙片法每批次的樣品檢測均需要使用有證標(biāo)準(zhǔn)菌株做陽性和陰性對照試驗，對實驗室標(biāo)準(zhǔn)菌株需求量比較大，且紙片法現(xiàn)階段可適用的環(huán)境排放標(biāo)準(zhǔn)和評價標(biāo)準(zhǔn)相對比較少，實驗最終結(jié)果不能直接作為執(zhí)法憑證依據(jù)，不便于從事環(huán)境監(jiān)測及執(zhí)法的實驗室分析使用。濾膜法受限于濾膜孔徑，只能適用在較清潔水樣，對渾濁較高、污染程度較大、細(xì)菌密度比較大的水樣不適用。在眾多方法中，酶底物法具有操作簡便、假陽性低、結(jié)果可靠、檢驗周期短等優(yōu)點而廣泛應(yīng)用，成為糞大腸菌群檢驗的最佳分析方法。范秀英等在《酶底物法與多管發(fā)酵法測定水中糞大腸菌群的對比研究》中的研究表明，酶底物法和多管發(fā)酵法在準(zhǔn)確性方面無太大差異，而酶底物法檢測的靈敏度要高于多管發(fā)酵法。酶底物法采用購買成品培養(yǎng)基及定量盤等耗材，操作流程簡便，減少了部分實驗過程中可能受污染的環(huán)節(jié)，最快18h即可判斷水樣中糞大腸菌群的MPN值，酶底物法較好地彌補了傳統(tǒng)方法的不足，證明酶底物法是檢測糞大腸菌群的優(yōu)選方法。標(biāo)準(zhǔn)制修訂的基本原則和技術(shù)路線4.1標(biāo)準(zhǔn)制修訂的基本原則4.1.1實用性原則本文件是在充分收集相關(guān)資料和文獻，分析和調(diào)研酶底物法測定水質(zhì)及環(huán)境樣品中糞大腸菌群的應(yīng)用現(xiàn)狀，在現(xiàn)有國家、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中相關(guān)酶底物法測定各類型樣品中的糞大腸菌群的基礎(chǔ)上，結(jié)合起草單位的方法經(jīng)驗，總結(jié)起草而成。符合當(dāng)前酶底物法測定污泥中糞大腸菌群發(fā)展需求，有利于解決污泥檢測難點且提高時效性，有力提升檢測質(zhì)量，具有較強的實用性和可操作性。4.1.2協(xié)調(diào)性原則本文件編寫過程中注意了與糞大腸菌群測定的相關(guān)法律法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)文件的協(xié)調(diào)問題，在內(nèi)容上與現(xiàn)行法律法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)協(xié)調(diào)一致。4.1.3規(guī)范性原則本文件嚴(yán)格按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的要求和規(guī)定編寫本標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)容，保證標(biāo)準(zhǔn)的編寫質(zhì)量。4.1.4前瞻性原則本文件在兼顧國內(nèi)各級檢測機構(gòu)、污水處理廠化驗室測定污泥中糞大腸菌群現(xiàn)實情況的同時，還考慮了采用酶底物法測定污泥中糞大腸菌群的實際需要和發(fā)展趨勢，在標(biāo)準(zhǔn)中體現(xiàn)了個別特色性、前瞻性和先進性條款，作為對糞大腸菌群測定的更好指導(dǎo)。4.2標(biāo)準(zhǔn)制訂的技術(shù)路線目前，國內(nèi)尚未制定有使用酶底物法測定污泥中糞大腸菌群的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，本標(biāo)準(zhǔn)的制定結(jié)合本國實際情況，引用、參考國內(nèi)外現(xiàn)有相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)實驗研究完成了本標(biāo)準(zhǔn)方法的制定。酶底物法測定污泥中糞大腸菌群標(biāo)準(zhǔn)制定的技術(shù)路線，見圖1。圖1標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)路線圖方法研究報告5.1方法研究的目標(biāo)建立適用于污泥中糞大腸菌群測定糞大腸菌群的酶底物法。通過方法研究和方法驗證，確定酶底物法測定糞大腸菌群的可行性和適用性，建立簡便、快速、準(zhǔn)確的檢測方法，并將方法標(biāo)準(zhǔn)化以期應(yīng)用。本標(biāo)準(zhǔn)的檢測結(jié)果以樣本中是否檢出糞大腸菌群表示。5.2方法原理在44.5℃培養(yǎng)24h條件下，糞大腸菌群能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，將選擇性培養(yǎng)基中的無色底物鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）分解為黃色的鄰硝基苯酚（ONP）。統(tǒng)計陽性反應(yīng)出現(xiàn)數(shù)量，査MPN表，計算樣品中糞大腸菌群的濃度值。5.3試劑和材料除非另有說明，分析時均使用符合國家標(biāo)準(zhǔn)的分析純試劑，實驗用水應(yīng)滿足GB/T6682中三級水的要求。（1）培養(yǎng)基：本標(biāo)準(zhǔn)釆用MinimalMediumONPG-MUG培養(yǎng)基。每100mL樣品需使用培養(yǎng)基粉末2.7g±0.5g,所含基本成分見表3。也可釆用市售商品化培養(yǎng)基制品。表3培養(yǎng)基基本成分及含量基本成分含量硫酸銨[(NH4)2SO4]0.5g硫酸錳（MnSO4）0.05mg硫酸鋅（ZnSO4）0.05mg硫酸鎂（MgSO4）10mg氯化鈉（NaCl）1g氯化鈣（CaC12）5mg亞硫酸鈉（Na2SO3）4mg兩性霉素B（AmphotericinB）0.1mg鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖昔（ONPG）50mg4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）7.5mg茄屬植物萃取物（Solaniutn萃取物）50mgN-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙磺酸鈉鹽（HEPES鈉鹽）0.53gN-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙磺酸（HEPES）0.69g（2）硫代硫酸鈉（Na2S2O3·5H20）。（3）硫代硫酸鈉溶液：ρ（Na2S2O3）=0.05g/mL。稱取7.85g硫代硫酸鈉，溶于適量水中，定容至100mL，臨用現(xiàn)配。（4）97孔定量盤：含49個大孔，48個小孔。其中，每個小孔可容納0.186mL樣品，大孔中48個大孔每個可容納1.86mL樣品，一個頂部大孔可容納11mL樣品。也可采用經(jīng)環(huán)氧乙烷滅菌的市售商品化成品。（5）標(biāo)準(zhǔn)陽性比色盤。（6）無菌水：取適量實驗用水，經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌20min，備用。5.4儀器的選擇（1）采樣瓶：經(jīng)過滅菌處理的耐高壓塑料瓶?？舍娪檬惺蹮o菌釆樣瓶、無菌采樣袋/均質(zhì)袋（2）樣品瓶：具螺旋帽的100mL、250mL玻璃瓶?？刹捎檬惺蹮o菌采樣瓶。（3）高壓蒸汽滅菌器：121℃可調(diào)。（4）恒溫培養(yǎng)箱：允許溫度偏差44.5℃±0.5℃。（5）程控定量封口機：用于97孔定量盤的封口。（6）天平：感量0.01g。（7）渦旋振蕩器。（8）移液管：1mL±0.1mL、10mL±0.1mL。也可采用計量合格的可調(diào)式移液。（9）三角瓶：100mL、250mL、500mL。（10）量筒：100mL±1mL。（11）一般實驗室常用儀器和設(shè)備。其中，三角瓶、移液管、樣品瓶等玻璃器皿在試驗前按無菌操作要求包扎，按需選擇121℃高壓蒸汽滅菌20min，烘干，或160℃干熱滅菌2h，備用。5.5樣品5.5.1采樣器皿的洗滌對所有與樣品直接接觸的器皿，均應(yīng)采取措施保證其潔凈度，避免造成污染或干擾。5.5.2采樣步驟污泥的表層、中層、下層斷面各采集三點，充分混合后取約500g泥樣裝入無菌樣品瓶中。5.5.3樣品的保存采得的泥樣應(yīng)立即送檢，時間不超過2h，如不能立即送檢，應(yīng)置于保溫箱或冰箱（0℃～4℃）中避光低溫保存，時間不超過24h，否則將影響檢驗結(jié)果。主要參照《CJ/T221-2005城市污水處理廠污泥檢驗方法》中13.6的要求擬定。5.6分析步驟5.6.1樣品制備將樣品置于無菌器皿內(nèi)，用無菌鑷子揀出樣品中的雜質(zhì)異物，充分混勻稱取10.0g樣品，放入無菌樣品瓶內(nèi)，加入90mL無菌水，混搖或渦旋振蕩2min～4min，混勻，制成1：10混懸液。其中，干污泥可用少量無菌水浸泡軟化，再稀釋混均。無渦旋振蕩器時，可使用均質(zhì)機慢速均質(zhì)樣品2min或者軌道式搖床以200±10rpm的速度對樣品進行均質(zhì)1h。然后根據(jù)樣品污染程度決定稀釋度，避免樣品接種結(jié)果均呈陽性或陰性。用無菌吸管吸取1:10樣品混懸液10mL加到含有90mL無菌水的無菌樣品瓶中混勻制成1:100稀釋樣品。按同法依次稀釋，可制成1:1000、1∶10000等梯度稀釋樣品。對于未知樣品，可選用多個接種量進行檢測。其中稀釋待測樣品pH值應(yīng)在4.5～10.5范圍內(nèi)，如超出此范圍，可用鹽酸或氫氧化鈉溶液預(yù)先調(diào)節(jié)pH值再進行測定。經(jīng)過石灰處理的樣品在稀釋均質(zhì)后，應(yīng)調(diào)整pH值至7.0±0.2。值得注意的是，本方法不適用于稀釋待測樣品顏色類似或深于標(biāo)準(zhǔn)陽性比色盤的樣品。在野外操作時應(yīng)避開明顯局部污染源，建議使用一次性手套、口罩、酒精燈等。5.6.2接種量取100mL稀釋樣品于滅菌瓶，加入2.7g±0.5g培養(yǎng)基粉末，充分混勻，完全溶解后，全部倒入97孔定量盤內(nèi)，以手撫平97孔定量盤背面，趕除孔內(nèi)氣泡，然后用程控定量封口機封口，確保每個孔格內(nèi)都有液體。觀察97孔定量盤顏色，若出現(xiàn)類似或深于標(biāo)準(zhǔn)陽性比色盤的顏色或者其他異色，則需排查樣品、培養(yǎng)基、無菌水等一系列因素后，終止試驗或重新操作。5.6.3培養(yǎng)將封口后的97孔定量盤放入的恒溫培養(yǎng)箱中44.5℃±0.5℃下培養(yǎng)24h。5.6.4空白對照每次試驗都要用無菌水按照步驟5.6.1～5.6.3進行實驗室空白測定。培養(yǎng)后的97孔定量盤不得有任何顏色反應(yīng)，否則，該次樣品測定結(jié)果無效，應(yīng)査明原因后重新測定。5.6.5陰性和陽性對照糞大腸菌群的陰性、陽性菌株參考表4。表4陰性、陽性菌株參考表檢測指標(biāo)陽性菌種陰性菌種糞大腸菌群大腸埃希氏菌（耐熱型）、克雷伯氏菌屬（Klebsiellatrevisan）（耐熱型）糞鏈球菌(Streptococcusfaecalis)、假單胞菌屬將標(biāo)準(zhǔn)菌株制成300個/mL～3000個/mL的菌懸液，將菌懸液按接種和培養(yǎng)要求操作，陽性菌株應(yīng)呈現(xiàn)陽性反應(yīng)；陰性菌株呈現(xiàn)陰性反應(yīng)，否則，該次樣品測定結(jié)果無效，應(yīng)重新測定。為了試驗的順利進行，可先制備較高濃度菌懸液，釆用血球計數(shù)器在顯微鏡下對其濃度進行初步測定，然后根據(jù)實際情況用無菌水稀釋至300個/mL～3000個/mL。5.6.6結(jié)果判讀與計數(shù)將培養(yǎng)24h后的97孔定量盤進行結(jié)果判讀，樣品變黃色判斷為糞大腸菌群陽性。如果結(jié)果可疑，可延長培養(yǎng)至28h進行結(jié)果判讀，超過28h后出現(xiàn)的顏色反應(yīng)不作為陽性結(jié)果。可使用保質(zhì)期內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)陽性比色盤以輔助判讀，當(dāng)樣品孔格的黃色與其顏色相同或更深，判讀結(jié)果為陽性。然后分別記錄97孔定量盤中大孔和小孔的陽性孔數(shù)量。5.7結(jié)果計算與表示5.7.1結(jié)果計算（1）計算原始（濕）污泥的糞大腸菌群濃度從97孔定量盤法MPN表中査得每100mL稀釋樣品中糞大腸菌群的MPN值后，再根據(jù)樣品不同的稀釋度，按照公式（1）換算樣品中糞大腸菌群濃度（MPN/g）： QUOTECw=MPN值fCw=式中：QUOTECwCw——原始（濕）污泥樣品中糞大腸菌群濃度，單位為MPN/g；MPN值——每100mL稀釋樣品中糞大腸菌群濃度，單位為MPN/100mL；QUOTEff——每100mL稀釋樣品代表的樣品實際接種量，單位為g/100mL。（2）計算干污泥（扣除含水率）的糞大腸菌群濃度按照式（2）計算干污泥（扣除含水率）的糞大腸菌群濃度： QUOTECd=Cw×100式中：QUOTECdCd——干污泥樣品中糞大腸菌群濃度，單位為MPN/g；QUOTECwCw——原始（濕）污泥樣品中糞大腸菌群濃度，單位為MPN/g；QUOTEωω——原始（濕）污泥樣品的含水率，單位為％。5.7.2結(jié)果表示測定結(jié)果保留兩位有效數(shù)字，當(dāng)測定結(jié)果≥100MPN/g時，以科學(xué)計數(shù)法表示；若97孔均為陰性，可報告為糞大腸菌群數(shù)未檢出或＜10MPN/g。5.7.3結(jié)果換算按照公式（3）將糞大腸菌群濃度換算成糞大腸菌群菌值： QUOTEV=1CwV式中：V——樣品的糞大腸菌群菌值；QUOTECwCw——原始（濕）污泥樣品中糞大腸菌群濃度，單位為MPN/g。方法對比目前常用的污泥中糞大腸菌群的檢測方法有發(fā)酵法（圖2）、濾膜法（圖3），但這些方法均存在操作繁瑣、檢測時間長、分析效率低的問題，對檢測人員技術(shù)經(jīng)驗要求高，因此研究制定一種更為快速、準(zhǔn)確的污泥中糞大腸菌群測定方法十分必要。圖2發(fā)酵法檢測污泥中糞大腸菌群的程序步驟（GB7959-2012《糞便無害化衛(wèi)生要求》附錄D）圖3濾膜法檢測污泥中糞大腸菌群的程序步驟（CJ/T221-2005《城市污水處理廠污泥檢驗方法》）在參照《水質(zhì)總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測定酶底物法》（HJ1001-2018）、英國環(huán)境署《TheMicrobiologyofSewageSludge（2003）》第3部分中酶底物法檢測污水污泥中的大腸埃希氏菌方法的基礎(chǔ)上，研究開發(fā)制定污泥中糞大腸菌群的測定——酶底物法。酶底物法具有操作簡便，假陽性假陰性低，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，檢驗周期短等優(yōu)點而成為糞大腸菌群檢驗的推薦分析方法，而且文獻報道，酶底物法測定水中糞大腸菌群與多管發(fā)酵法、濾膜法無顯著性差異。通過酶底物法和發(fā)酵法（多管發(fā)酵法）測定污泥樣品進行方法比對、準(zhǔn)確度和精密度試驗，判斷測定結(jié)果是否符合驗收要求，確認(rèn)檢測方法的可行性。酶底物法檢測污泥中糞大腸菌群，方法步驟只有6步（如圖4），分別為：污泥樣品稀釋、定量添加反應(yīng)試劑、混勻倒入定量盤、封口機封口、放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)、統(tǒng)計陽性數(shù)報告結(jié)果。所需儀器主要為封口機、培養(yǎng)箱、渦旋振蕩器等，所需試劑耗材主要有酶底物試劑、定量盤、采樣瓶、吸管等。酶底物法所需的儀器設(shè)備、試劑耗材種類數(shù)量少、常規(guī)，市場上均可采購，容易獲得，檢測操作步驟簡單。圖4酶底物法檢測污泥中糞大腸菌群步驟參考相關(guān)文獻資料，采用酶底物法對污泥中糞大腸菌群進行測定，已開展少量試驗確認(rèn)這種方法的有效性，計劃通過本項目進一步完成方法研究，證明酶反應(yīng)原理更能有效避免檢測結(jié)果的假陰性假陽性，避免傳統(tǒng)方法的缺陷和不足，為污泥中糞大腸菌群快速測定提供技術(shù)指導(dǎo)。表5是三種檢測方法在污泥檢測中的應(yīng)用比較。表5檢測方法對比表方法名稱多管發(fā)酵法濾膜法酶底物法適用范圍全部樣品稀釋后低濁樣品全部樣品培養(yǎng)基3種2種1種其他試劑1種1種無檢驗時限24h～72h24h～48h24h～28h確認(rèn)試驗需要需要不需要檢驗步驟較繁瑣較簡單簡單特殊設(shè)備顯微鏡顯微鏡、抽濾裝置封口機對環(huán)境污染無無無對人體傷害無無無耗材價格低低較高本項目涉及酶底物方法的培養(yǎng)基、定量儀器與方法的專利已超過保護期，不存在專利技術(shù)等知識產(chǎn)權(quán)的問題。其次，國內(nèi)已經(jīng)有多家企業(yè)開發(fā)、生產(chǎn)和銷售酶底物試劑及儀器設(shè)備，預(yù)計未來隨國產(chǎn)耗材的大量推廣普及，以及以酶底物反應(yīng)原理為基礎(chǔ)的檢測方法應(yīng)用范圍的擴大延伸，酶底物方法的耗材成本將大幅降低。本項目采用酶底物法測定污泥中的糞大腸菌群指標(biāo)，與傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)方法濾膜法、發(fā)酵法相比，具有簡單、快速、準(zhǔn)確、高效的特征，無需預(yù)先配置培養(yǎng)基，樣品經(jīng)過稀釋后的手工操作時間僅需1分鐘，操作方法十分簡單。僅需24小時即可檢測污泥中糞大腸菌群結(jié)果，相比傳統(tǒng)方法，可有效縮短檢測時間，提高分析效率，結(jié)果判讀準(zhǔn)確，可減少人工判讀誤差和人工操作時間，節(jié)省人力成本。檢測方法和技術(shù)在國內(nèi)外屬于領(lǐng)先技術(shù)水平。同時，編制組組織6家實驗室分別做了方法對比試驗，見表6。表6方法驗證及方法研制單位匯總表單位名稱單位類別廣西壯族自治區(qū)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心方法驗證單位廣西壯族自治區(qū)分析測試研究中心廣西城市供水水質(zhì)監(jiān)測網(wǎng)防城港監(jiān)測站國家城市排水監(jiān)測網(wǎng)南京監(jiān)測站/南京水務(wù)集團有限公司排水水質(zhì)監(jiān)測中心昆明市城市排水監(jiān)測站東莞市東江檢測有限公司廣西北投環(huán)保水務(wù)集團有限公司方法研制單位廣西上善若水發(fā)展有限公司6.1方法比對方案（1）與多管發(fā)酵法進行比對。由于GB7959-2012《糞便無害化衛(wèi)生要求》附錄D堆肥、糞稀中糞大腸菌群檢測法采用多管發(fā)酵法4管法，查表值跨度大，為了更好的進行方法比對，選擇GB18466-2005《醫(yī)療機構(gòu)水污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》附錄A醫(yī)療機構(gòu)污水和污泥中糞大腸菌群的檢驗方法,采用多管發(fā)酵法9管法進行方法比對。（2）每個單位至少采集30份實際樣品（高、中、低濃度）開展方法比對，樣品主要涉及城鎮(zhèn)污水處理廠污泥、處置后污泥兩個類型。樣品要求一定的陽性檢出率，若實際樣品未檢出目標(biāo)物的，可通過實際樣品基體加標(biāo)的方式獲得樣品。（3）陰性樣品的比對。廣西區(qū)內(nèi)三家驗證單位分別用無菌污泥（經(jīng)高壓滅菌的污泥樣品）進行方法比對10組。（4）通過對比實驗,將實驗數(shù)據(jù)進行整理與處理（換算成以10為底的對數(shù)），對多管發(fā)酵法與酶底物法的結(jié)果進行配對t檢驗，分析驗證兩種方法在統(tǒng)計學(xué)意義上的顯著性差異，評價兩種方法等效性、一致性；進行線性回歸分析，證明兩種方法具有可比性。6.2方法比對結(jié)果6.2.1實際樣品的測定6家實驗室分別采集廣西南寧市、防城港市、東興市以及南京市、昆明市、東莞市的污泥樣品共計201份，污泥樣品來源于當(dāng)?shù)爻擎?zhèn)污水處理廠及市政排水管，樣品類型包括：脫水污泥、深度脫水污泥、板框污泥及排水管污泥。分別用多管發(fā)酵法和酶底物法進行檢測，檢測結(jié)果見表7。表7多管發(fā)酵法和酶底物法檢測實際樣品中糞大腸菌群的結(jié)果序號多管發(fā)酵法（MPN/g）酶底物法（MPN/g）序號多管發(fā)酵法（MPN/g）酶底物法（MPN/g）1150000770100101150001100024600004611001022000360032400007556001033400590044600009804001044300026000524000011199001051400011000646000027550010693008600711000005794001074600250082400008570010829000190009120000934001097500910010150000771001109.3<10119378.011142000610001293110.61126.2<101343135.411312000110001493124.61142900029000157595.9115930012000162363.11162400013000174367.01173500024000182173.31182000016000194390.6119910019000202879.81204300660021750958121<3<10221200105912221000130002315009851233.6<102493093412423000150002512001063125930017000267508861264600003500002716001010127210000220000289301008128110000069000029120010101299300029000030950116613046000057000031240001299701319300098000322400002419601322300042000334394133110000046000034235213493000460000351100003945013524000200003646000721501362300012000372400002723001379100180003824000095700138460000170000392400004569001392400001100000402400001299700140150000380000414600007701001412400001600004224000048840014224000020000043240000129970143230007400044110000041600014464000280000451100001553101459100270004646000011199014624000160000472331147914148110000920800148240000100000491100000111990014993006900504600001413600150230003400051240000120330015115000100005243941522400002900005324000086640015323000190005411000001011201542300022000552400006167015524000220005646000033000015615000001200000571100005335015736105811000006867001582300032000592382159430003600060643016011000001400006143006570161430003600062460001413616224000200006346000913901632400018000642400038730164110000072000065240000275500165160001100006624000343601664600007300006793121167110000220000681100002778016846000580006911000001986300169939870930015860170434171110000011199001714375721100001413601722320732400007701017324009804742400004034017446001203375240000387301751100017329761100000198630176110001986377240000378401771100024196784600002419601784609597943841794600057948046000019863018046005475814600008664018146002909821100001664018224003873834600086640183460001732984150001689018411001301854600001203301851100011808624000045690186110010687110000024196018746009606882400009208001882401077894600001413600189435190460001951001901100024196914600009804001914330192437519243122934600003900001939.120942400002000001946.23195230033001952408849611000180001963.641973600260019746007270982902601982384994600180019946000165001002903102004600046110201460010390表8方法驗證數(shù)據(jù)分析結(jié)果匯總驗證單位樣品數(shù)量（份）P值r值廣西壯族自治區(qū)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心300.0970.982廣西壯族自治區(qū)分析測試研究中心300.4020.957廣西城市供水水質(zhì)監(jiān)測網(wǎng)防城港監(jiān)測站320.1050.917國家城市排水監(jiān)測網(wǎng)南京監(jiān)測站/南京水務(wù)集團有限公司排水水質(zhì)監(jiān)測中心330.5790.986昆明市城市排水監(jiān)測站430.5410.929東莞市東江檢測有限公司330.0790.9276家實驗室分別對不同地域、處理工藝、類型的污泥樣品進行兩種方法間的對比實驗，將多管發(fā)酵法與酶底物法檢測污泥中糞大腸菌群的結(jié)果進行對數(shù)轉(zhuǎn)換（lg），利用統(tǒng)計學(xué)分析軟件（SPSS）對轉(zhuǎn)換后的兩組數(shù)據(jù)進行配對t檢驗（見表8），P值均大于0.05，說明在0.05的顯著性水平上，多管發(fā)酵法與酶底物法兩種檢測方法的檢測結(jié)果無差異；相關(guān)系數(shù)r值為0.917～0.986，說明多管發(fā)酵法與酶底物法具有相關(guān)性，多管發(fā)酵法與酶底物法在進行污泥中糞大腸菌群檢測時具有等效性。將6家實驗室201組比對結(jié)果匯總后的分析結(jié)果與上述結(jié)論保持一致，統(tǒng)計結(jié)果顯示P=0.265>0.05，相關(guān)系數(shù)r=0.963（見表9、表10）。表9成對樣本相關(guān)系數(shù)配對N相關(guān)系數(shù)顯著性多管發(fā)酵法lg與酶底物法lg2010.963.000表10成對樣本相關(guān)系數(shù)配對配對差值t自由度Sig.（雙側(cè)）均值標(biāo)準(zhǔn)差均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差分的95％置信區(qū)間下限上限多管發(fā)酵法lg與酶底物法lg-.03184.40359.02847-.08797.02429-1.119200.265對實際樣品的檢測結(jié)果進行線性回歸分析（見表11、圖5）：多管發(fā)酵法與酶底物法檢測污泥中糞大腸菌群，標(biāo)準(zhǔn)化回歸系數(shù)為0.918，相關(guān)系數(shù)R=0.963，表明兩組數(shù)據(jù)相關(guān)性較好，兩種方法的檢測結(jié)果具有可比性。t檢驗的P<0.05，表明兩種方法呈正相關(guān)，在檢測糞大腸菌群時沒有顯著差異性，具有等效性。此結(jié)果說明顯色平板計數(shù)法的測定結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，可用于實際污泥樣品中糞大腸菌群的檢測。表11多管發(fā)酵法與酶底物法檢測實際樣品中的糞大腸菌群的結(jié)果線性回歸分析模型未標(biāo)準(zhǔn)化系數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化系數(shù)t顯著性B標(biāo)準(zhǔn)誤Beta（常量）.368.0794.680.000實際水樣.918.018.96350.660.000圖5多管發(fā)酵法與酶底物法檢測實際樣品中的糞大腸菌群的結(jié)果線性回歸分析6.2.2陰性樣品的測定廣西區(qū)內(nèi)三家驗證單位分別采用多管發(fā)酵法和酶底物法檢測10份無菌污泥（經(jīng)121℃高壓滅菌20min的污泥樣品），共計30組對比，檢測結(jié)果見表12。表12多管發(fā)酵法和酶底物法檢測陰性樣品中糞大腸菌群的結(jié)果序號樣品類型檢測結(jié)果（MPN/g)多管發(fā)酵法酶底物法1無菌污泥<3<102無菌污泥<3<103無菌污泥<3<104無菌污泥<3<105無菌污泥<3<106無菌污泥<3<107無菌污泥<3<108無菌污泥<3<109無菌污泥<3<1010無菌污泥<3<1011無菌污泥<3<1012無菌污泥<3<1013無菌污泥<3<1014無菌污泥<3<1015無菌污泥<3<1016無菌污泥<3<1017無菌污泥<3<1018無菌污泥<3<1019無菌污泥<3<1020無菌污泥<3<1021無菌污泥<3<1022無菌污泥<3<1023無菌污泥<3<1024無菌污泥<3<1025無菌污泥<3<1026無菌污泥<3<1027無菌污泥<3<1028無菌污泥<3<1029無菌污泥<3<1030無菌污泥<3<10多管發(fā)酵法與酶底物法檢測無菌污泥中糞大腸菌群的結(jié)果顯示，兩種檢測方法對于陰性樣品均未檢出，結(jié)果具有一致性。此外，在比對試驗中發(fā)現(xiàn)，酶底物法檢測污泥樣品時，在10-1稀釋度（每100mL稀釋待測樣品中含10g污泥）、10-2稀釋度（每100mL稀釋待測樣品中含1g污泥）時，待測樣品受到污泥顆粒物的影響，樣品背景顏色偏深，不利于培養(yǎng)后辨別黃色，判讀陽性反應(yīng)的結(jié)果，在10-3稀釋度（每100mL稀釋待測樣品中含0.1g污泥）時，可以準(zhǔn)確判讀。因此，酶底物法檢測污泥樣品的方法以1000倍為樣品最小稀釋倍數(shù)，確定方法的檢出限為10MPN/g。6.2.3排他性試驗廣西區(qū)內(nèi)三家實驗室選擇糞鏈球菌（CICC21603）和銅綠假單胞菌（CICC21636）兩種菌株，分別制備菌懸液，加入到無菌污泥稀釋液中，隨后采用酶底物法（參照《污泥中糞大腸菌群的測定酶底物法》草案）檢測糞大腸菌群濃度，測定結(jié)果均為陰性。結(jié)果顯示，排他性試驗結(jié)果均為陰性。考慮本標(biāo)準(zhǔn)與HJ1001《水質(zhì)總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測定酶底物法》等國內(nèi)現(xiàn)行有效的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)文件的統(tǒng)一及銜接，結(jié)合實驗室條件和基于生物安全考慮，最終選擇大腸埃希氏菌（耐熱型）、克雷伯氏菌屬（Klebsiellatrevisan）（耐熱型）為陽性菌，選擇糞鏈球菌（Streptococcusfaecalis）、假單胞菌屬為陰性菌。方法驗證7.1方法驗證方案7.1.1參與方法驗證的實驗室、驗證人員的基本情況有3家單位6個驗證小組參加了方法驗證工作，具體參加人員名單如表13：表13參加驗證的人員情況登記表姓名性別年齡職務(wù)或職稱所學(xué)專業(yè)參加分析工作年份驗證單位何東明女38高級工程師環(huán)境工程16廣西壯族自治區(qū)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心劉小萍女35工程師化學(xué)工藝10廣西壯族自治區(qū)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心李世龍男36工程師環(huán)境工程14廣西壯族自治區(qū)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心盧安根男48正高級工程師微生物學(xué)22廣西壯族自治區(qū)分析測試研究中心潘尚麗女33工程師微生物學(xué)7廣西壯族自治區(qū)分析測試研究中心蒙金燕女38工程師化學(xué)工程與工藝14廣西城市供水水質(zhì)監(jiān)測網(wǎng)防城港監(jiān)測站禤曉艷女34助理工程師生物工程10廣西城市供水水質(zhì)監(jiān)測網(wǎng)防城港監(jiān)測站王莉莉女44高級工程師食品科學(xué)與工程23廣西城市供水水質(zhì)監(jiān)測網(wǎng)防城港監(jiān)測站馮金榮女30工程師分析化學(xué)2廣西城市供水水質(zhì)監(jiān)測網(wǎng)防城港監(jiān)測站組織3家有資質(zhì)的實驗室進行6組試驗驗證。根據(jù)影響方法的精密度和準(zhǔn)確度的主要因素和數(shù)理統(tǒng)計學(xué)的要求，編制方法驗證報告，驗證數(shù)據(jù)主要包括精密度、正確度等。7.1.2方法驗證方案7.1.2.1精密度的驗證3家驗證單位共進行6組驗證試驗，充分考慮標(biāo)準(zhǔn)的適用范圍、國標(biāo)限值和最低檢出限，采用高、中、低三個不同濃度糞大腸菌群的實際樣品和有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制的樣品進行6次重復(fù)測定。若實際樣品沒有合適濃度，可通過使用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)人為染菌方式獲得。（1）實際樣品（人為染菌樣品）：低濃度：10～102MPN/g、中濃度103～104MPN/g、高濃度105～106MPN/g。（2）有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制的樣品：有證定量標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控樣加入無菌污泥稀釋液（10-3稀釋度）中，配制濃度在102～3MPN/g。計算實際樣品和有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制的樣品結(jié)果的平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，分析實驗室內(nèi)和實驗室間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差、重復(fù)性限、再現(xiàn)性限、95％置信區(qū)間。7.1.2.2正確度的驗證3家驗證單位共進行6組驗證試驗，低濃度（10～102MPN/g）、中濃度（103～104MPN/g）和高濃度（105～106MPN/g）三個不同濃度糞大腸菌群的實際樣品及有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制的樣品（濃度102～3MPN/g）進行6次重復(fù)測定，計算樣品結(jié)果平均值、相對誤差，通過計算實驗室內(nèi)相對誤差、相對誤差最終值等以驗證酶底物法的正確度。7.2方法驗證過程及結(jié)論7.2.1方法驗證過程（1）通過篩選確定有資質(zhì)的方法驗證單位。按照方法驗證方案準(zhǔn)備實驗用品，與驗證單位確定驗證時間。在方法驗證前，確保參加驗證的操作人員應(yīng)熟悉和掌握方法原理、操作步驟及流程。方法驗證過程中所用的試劑和材料、儀器和設(shè)備及分析步驟應(yīng)符合方法相關(guān)要求。（2）《方法驗證報告》見附件一。7.2.1方法驗證結(jié)論（1）檢出限：10MPN/g（2）以本方法確定的目標(biāo)物的測定下限與檢出限一致。（3）本課題組在進行方法驗證報告數(shù)據(jù)統(tǒng)計時，所有數(shù)據(jù)全部采用，未進行取舍。（4）方法精密度和準(zhǔn)確度統(tǒng)計結(jié)果能滿足方法特性指標(biāo)要求。參考文獻[1]GB7959-2012糞便無害化衛(wèi)生要求[2]GB24188-2009城鎮(zhèn)污水處理廠污泥泥質(zhì)[3]GB/T24600-2009城鎮(zhèn)污水處理廠污泥處置土地改良泥質(zhì)[4]CJ/T221-2015城市污水處理廠污泥檢驗方法[5]HJ1001水質(zhì)總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測定酶底物法[6]HJ168-2020環(huán)境監(jiān)測分析方法標(biāo)準(zhǔn)制訂技術(shù)導(dǎo)則[7]StandingCommitteeofAnalysts.TheMicrobiologyofSewageSludge（2003）-Part3-MethodsfortheisolationandenumerationofEscherichiacoli,includingverocytotoxigenicEscherichiacoli[M].AlmondsburyofEngland:EnvironmentAgency,2003.

附件一方法驗證報告方法驗證報告方法名稱：《污泥中糞大腸菌群的測定酶底物法》項目主編單位：廣西北投環(huán)保水務(wù)集團有限公司、廣西壯族自治區(qū)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心、廣西壯族自治區(qū)分析測試研究中心、廣西標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會驗證單位：廣西壯族自治區(qū)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心、廣西壯族自治區(qū)分析測試研究中心、廣西城市供水水質(zhì)監(jiān)測網(wǎng)防城港監(jiān)測站項目負(fù)責(zé)人及職稱：王莉莉、高級工程師通訊地址：廣西南寧市青秀區(qū)民族大道153號電話告編寫人及職稱：王莉莉高級工程師報告日期：2023年4月28日1原始測試數(shù)據(jù)本方法的3家驗證實驗室依次為：廣西壯族自治區(qū)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心、廣西壯族自治區(qū)分析測試研究中心、廣西城市供水水質(zhì)監(jiān)測網(wǎng)防城港監(jiān)測站。對《污泥中糞大腸菌群的測定酶底物法》進行方法驗證的結(jié)果進行匯總及統(tǒng)計分析，其結(jié)果如下：實驗室基本情況驗標(biāo)人員、儀器設(shè)備及試劑材料的情況見表1-1、1-2、1-3。表1-1參加驗證的人員情況登記表姓名性別年齡職務(wù)或職稱所學(xué)專業(yè)參加分析工作年份驗證單位何東明女38高級工程師環(huán)境工程16廣西壯族自治區(qū)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心劉小萍女35工程師化學(xué)工藝10廣西壯族自治區(qū)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心李世龍男36工程師環(huán)境工程14廣西壯族自治區(qū)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心盧安根男48正高級工程師微生物學(xué)22廣西壯族自治區(qū)分析測試研究中心潘尚麗女33工程師微生物學(xué)7廣西壯族自治區(qū)分析測試研究中心蒙金燕女38工程師化學(xué)工程與工藝14廣西城市供水水質(zhì)監(jiān)測網(wǎng)防城港監(jiān)測站禤曉艷女34助理工程師生物工程10廣西城市供水水質(zhì)監(jiān)測網(wǎng)防城港監(jiān)測站王莉莉女44高級工程師食品科學(xué)與工程23廣西城市供水水質(zhì)監(jiān)測網(wǎng)防城港監(jiān)測站馮金榮女30工程師分析化學(xué)2廣西城市供水水質(zhì)監(jiān)測網(wǎng)防城港監(jiān)測站表1-2參加驗證單位儀器情況登記表儀器名稱規(guī)格型號儀器出廠編號性能狀況驗證單位高壓蒸汽滅菌器LDZX-75L-I90G221152正常廣西壯族自治區(qū)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心低溫恒溫培養(yǎng)箱MIR-254-PC17070353正常廣西壯族自治區(qū)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心隔水式培養(yǎng)箱GHP-9160130815934正常廣西壯族自治區(qū)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心生物顯微鏡CX41RF1L62455正常廣西壯族自治區(qū)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心國產(chǎn)程控定量封口機2009D090209正常廣西壯族自治區(qū)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心立式壓力蒸汽滅菌器LS-B50LHX05L-167正常廣西壯族自治區(qū)分析測試研究中心電熱恒溫培養(yǎng)箱HH-B11.4201098正常廣西壯族自治區(qū)分析測試研究中心電熱恒溫培養(yǎng)箱HH-B11.500BS10901013正常廣西壯族自治區(qū)分析測試研究中心顯微鏡BX51TRF9G19571正常廣西壯族自治區(qū)分析測試研究中心國產(chǎn)程控定量封口機2009D090071正常廣西壯族自治區(qū)分析測試研究中心手提式壓力蒸汽滅菌器DSX-30L-I33GB200623正常廣西城市供水水質(zhì)監(jiān)測網(wǎng)防城港監(jiān)測站電熱恒溫培養(yǎng)箱DHP-9082BAA220419919正常廣西城市供水水質(zhì)監(jiān)測網(wǎng)防城港監(jiān)測站電熱恒溫培養(yǎng)箱303-25036正常廣西城市供水水質(zhì)監(jiān)測網(wǎng)防城港監(jiān)測站生物顯微鏡JZ-B102/正常廣西城市供水水質(zhì)監(jiān)測網(wǎng)防城港監(jiān)測站程控式定量封口機SealerPlusQT常廣西城市供水水質(zhì)監(jiān)測網(wǎng)防城港監(jiān)測站表1-3參加驗證單位試劑及溶劑情況登記表名稱生產(chǎn)廠家、規(guī)格批號驗證單位乳糖膽鹽培養(yǎng)基三河市陸橋質(zhì)檢科技有限公司250g/瓶220519廣西壯族自治區(qū)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心伊紅美藍(lán)瓊脂（EMB）三河市陸橋質(zhì)檢科技有限公司250g/瓶221109廣西壯族自治區(qū)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心乳糖蛋白胨培養(yǎng)液三河市陸橋質(zhì)檢科技有限公司250g/瓶220706廣西壯族自治區(qū)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心革蘭氏染色液試劑盒北京陸橋技術(shù)股份有限公司10mL×4瓶/盒230117廣西壯族自治區(qū)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心科立得試劑美國IDEXX公司200個試劑/盒CU624B、EU476廣西壯族自治區(qū)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基北京陸橋技術(shù)股份有限公司250g/瓶220308廣西壯族自治區(qū)分析測試研究中心伊紅美藍(lán)瓊脂（EMB）北京陸橋技術(shù)股份有限公司250g/瓶230221廣西壯族自治區(qū)分析測試研究中心乳糖蛋白胨培養(yǎng)液北京陸橋技術(shù)股份有限公司250g/瓶220706廣西壯族自治區(qū)分析測試研究中心革蘭氏染色液試劑盒北京陸橋技術(shù)股份有限公司10mL×4瓶/盒230117廣西壯族自治區(qū)分析測試研究中心科立得試劑美國IDEXX公司200個試劑/盒JU320廣西壯族自治區(qū)分析測試研究中心乳糖膽鹽培養(yǎng)基北京陸橋技術(shù)服務(wù)有限公司250g/瓶250g/瓶2206206廣西城市供水水質(zhì)監(jiān)測網(wǎng)防城港監(jiān)測站伊紅美藍(lán)瓊脂（EMB）北京陸橋技術(shù)服務(wù)有限公司250g/瓶2108035廣西城市供水水質(zhì)監(jiān)測網(wǎng)防城港監(jiān)測站乳糖蛋白胨培養(yǎng)液北京陸橋技術(shù)服務(wù)有限公司250g/瓶2207065廣西城市供水水質(zhì)監(jiān)測網(wǎng)防城港監(jiān)測站革蘭氏染色液試劑盒北京陸橋技術(shù)服務(wù)有限公司10mL×4瓶/盒221219廣西城市供水水質(zhì)監(jiān)測網(wǎng)防城港監(jiān)測站科立得試劑美國DEXX公司200個試劑/盒JU320廣西城市供水水質(zhì)監(jiān)測網(wǎng)防城港監(jiān)測站1.2方法精密度測試數(shù)據(jù)表1-4為3家實驗室6個實驗組以相同批次實際樣品和有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（混合菌種，溯源性：CICC24176、CICC23008、CICC10384)配制的樣品（糞大腸菌群參考值3600MPN/g）作為方法精密度試驗樣品，采用酶底物法（參照《污泥中糞大腸菌群的測定酶底物法》草案）檢測其糞大腸菌群濃度的原始測試數(shù)據(jù)。表1-4精密度測試數(shù)據(jù)實驗組號濃度(MPN/g)測定值(MPN/g)平均值標(biāo)準(zhǔn)偏差相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(％)第一次第二次第三次第四次第五次第六次1低濃度10～1024172844174521.80.147.7中濃度103～1041989220921411823222426133.30.051.6高濃度105～106124600842001296005120084500712004.90.153.1參考值：36002481307634483873344832553.50.071.92低濃度10～1028684748420631.80.2513.7中濃度103～1041314290929872909304431693.40.154.3高濃度105～10612340012910011870095900117800862005.00.071.4參考值：36004884201437842909201424813.50.154.53低濃度10～1024160733071411.70.169.1中濃度103～10416589857441450275321873.20.216.7高濃度105～1064786003130004225002224003725006867005.60.173.0參考值：36002495275521423130365434483.50.092.54低濃度10～10252526241116601.80.158.6中濃度103～104191883626131086116218353.20.195.9高濃度105～1061918002809001686001730004721004106005.40.203.6參考值：36003076344830762909360929093.50.041.15低濃度10～1025284747586631.90.084.5中濃度103～1042595275526672400312334333.40.061.6高濃度105～1061775001585001445009580080800914005.10.142.8參考值：36004884328230763654344854933.60.102.86低濃度10～10210952638563861.90.126.3中濃度103～1041785214332551951167020353.30.103.1高濃度105～10610710093500123400186500752001993005.10.173.3參考值：36003076488436544352488450123.60.092.4注：平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為原始數(shù)據(jù)以10為底，對數(shù)轉(zhuǎn)化后計算所得。1.3方法正確度測試數(shù)據(jù)表1-5為3家實驗室6