乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測

乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測一、HBV耐藥的有關(guān)定義二、各種耐藥檢測技術(shù)的評價三、需要重視的幾個問題一、HBV耐藥的有關(guān)定義

病毒學突破（virologicbreakthrough）病毒反跳（viralrebound）生化學突破（biochemicalbreakthrough）HBV基因型耐藥（genotypicresistance）HBV表型耐藥（phenotypicresistance）臨床耐藥（clinicalresistance）NdeI限制酶的識別序列和切割位點：檢測技術(shù)的可靠性和穩(wěn)定性HBVDNA>105copies/ml183例CHB患者中，檢出存在YMDD突變毒株者共40例，檢出率為21.MALDI-TOFMS檢測

HBVYMDD變異的原理突變株比例小于20%時，由于競爭抑制作用不能被擴增。CATATG細胞外HBV聚合酶活性分析。堿基變異可能導致：不需酶促反應，可以對寡核苷酸測序。病毒反跳（viralrebound）指核苷類藥物治療過程中患者的血清HBVDNA水平一度被抑制，但在繼續(xù)治療中血清HBVDNA升高至＞2×104IU/mL或高于治療前水平。用化學試劑在A、G、C、T處特定的裂解DNA片段，產(chǎn)生一簇各種長度的短鏈，經(jīng)過PAGE放射自顯影可直讀DNA順序。該方法類似于細菌藥物敏感試驗。②產(chǎn)生新的位點HBV耐藥的有關(guān)定義

病毒學突破（virologicbreakthrough）指在核苷類藥物治療過程中，患者的血清HBVDNA水平一度被抑制，但在繼續(xù)治療中血清HBVDNA水平與最低值相比上升或超過1個log10（10倍）。HBV耐藥的有關(guān)定義

病毒反跳（viralrebound）指核苷類藥物治療過程中患者的血清HBVDNA水平一度被抑制，但在繼續(xù)治療中血清HBVDNA升高至＞2×104IU/mL或高于治療前水平。

HBV耐藥的有關(guān)定義

生化學突破（biochemicalbreakthrough）指在核苷類藥物治療過程中血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）水平一度復常，但在繼續(xù)治療中血清ALT水平又再次升高。肝臟生活指標很多，但是在此僅指ALT。HBV耐藥的有關(guān)定義

HBV基因型耐藥（genotypicresistance）指HBV基因組中的某些位點發(fā)生改變，導致這種藥物對HBV的抑制作用下降或消失。這種HBV基因變異與HBV的耐藥性有直接因果關(guān)系，通過這些變異位點的檢測可判斷HBV有無耐藥性。HBV耐藥的有關(guān)定義

HBV表型耐藥（phenotypicresistance）通過體外細胞培養(yǎng)方法，直接測定HBV對某種藥物的敏感性，或者在體外直接測定HBV聚合酶的活性，敏感性的降低或酶活性的下降均表明有耐藥，即表型耐藥。通常以IC50來評估IC50＜5倍:敏感IC50在5～10倍:部分耐藥IC50

＞10倍:耐藥HBV耐藥的有關(guān)定義

臨床耐藥（clinicalresistance）指臨床出現(xiàn)病毒復制不能被抑制，或HBV復制一度被抑制后又出現(xiàn)HBVDNA反跳，同時伴有ALT升高，或肝炎復發(fā)的其他臨床證據(jù)。二、各種耐藥檢測技術(shù)及評價病毒學反跳或突破的監(jiān)測HBV基因型耐藥監(jiān)測HBV表型耐藥檢測臨床耐藥監(jiān)測病毒學反跳或突破的監(jiān)測基于對血清HBVDNA載量的動態(tài)監(jiān)測需重視以下三點：

1.HBVDNA載量檢測手段的敏感性

2.檢測技術(shù)的可靠性和穩(wěn)定性

3.監(jiān)測的間隔時間HBV基因型耐藥監(jiān)測時機非必須不主張常規(guī)、廣泛應用基因型耐藥相關(guān)變異的命名基因型耐藥相關(guān)變異

在HBV多聚酶序列中的位置HBV基因型耐藥的主要技術(shù)堿基序列分析法直接測序克隆測序聚合酶鏈式反應及限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)(PCR-RFLP)反向雜交分析技術(shù)（INNO—LiPA）基因芯片技術(shù)實時熒光定量PCR技術(shù)探針定點突變PCR技術(shù)引物末端堿基定點突變擴增技術(shù)熔解曲線法基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOFMS)直接測序法末端終止法化學裂解法DNA測序自動化使用特異性引物與單鏈模板DNA退火，在DNA聚合酶作用下進行延伸反應，用ddNTP終止，用PAGE區(qū)分長度僅相差1個核苷酸的ssDNA，從而完成測序的方法。用化學試劑在A、G、C、T處特定的裂解DNA片段，產(chǎn)生一簇各種長度的短鏈，經(jīng)過PAGE放射自顯影可直讀DNA順序。類似末端終止法，所不同的是用熒光染料標記，計算機自動讀出。優(yōu)點簡便、迅速、應用廣泛。不需酶促反應，可以對寡核苷酸測序。①簡便、快速、準確可靠。②安全、無放射性污染。③模板用量大大減少。④測序能力增強。HBVDNA>105copies/ml限制性內(nèi)切核酸酶的作用二、各種耐藥檢測技術(shù)及評價JKoreanMedSci2004;19:541-546.JKoreanMedSci2004;19:541-546.突變株比例小于20%時，由于競爭抑制作用不能被擴增。基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOFMS)GTACNNNPCR-RFLP檢測HBVYMDD變異不要過分依基因型耐藥檢測技術(shù)細胞外HBV聚合酶活性分析2Informationcontentisconsideredasameasureofatest’sabilitytoprovidebroad,relevantinformationaboutpossiblenewmutations.基因型耐藥相關(guān)變異的命名特異性好需要多條熒光探針，成本高YMDD自然變異的幾組數(shù)據(jù)HBVYMDD變異直接測序結(jié)果圖譜直接DNA測序的局限性1.

設(shè)備貴、技術(shù)高、耗材、費時。2.必須有充足目的基因片段。3.突變株比例小于20%時，由于競爭抑制作用不能被擴增。直接測序法檢測HBVYMDD變異克隆測序法克隆測序法優(yōu)點：

1.有助于發(fā)現(xiàn)混合株并可大致確定不同序列毒株之間的相對比。

2.提高了檢測的靈敏度。局限性：

1.技術(shù)難度較高。

2.檢測周期更長。

3.檢測的費用大大增加。

堿基變異可能導致：①原有位點消失②產(chǎn)生新的位點③識別位點移位

利用錯配引物使PCR產(chǎn)物中產(chǎn)生特異的酶切位點結(jié)果:酶切片段長、短變化和多、少變化聚合酶鏈式反應及限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)(PCR-RFLP)限制性內(nèi)切核酸酶的作用它們能識別DNA的特異序列，并在識別序列內(nèi)或其旁切割雙鏈DNA。如：NdeI限制酶的識別序列和切割位點：CA

TATGGTATACNlaIll限制酶的識別序列和切割位點：CATGNNNGTACNNNPCR-RFLP檢測HBVYMDD變異PCR錯配引物設(shè)計PCR-RFLP檢測HBVYMDD變異PCR-RFLP檢測HBVYMDD變異PCR-RFLP技術(shù)的評價優(yōu)點：簡單、廣泛易開展。缺點：

1.限制性內(nèi)切酶種類有限。

2.錯配引物將導致退火溫度降低、非特異條帶增多。

3.引物非完全匹配，可能導致擴增效率降低、檢測敏感的下降。

反向雜交分析技術(shù)（INNO—LiPA）INNO—LiPA診斷HBVYMDD變異DNA芯片技術(shù)BiologicalSampleAnalyzedataScannermicroarray“Hybridize”arrayerMicroarrayfabricationSamplepreparationMolecularhybridizationDetectionandanalysisDNA芯片技術(shù)診斷HBVYMDD變異DetectionofYMDDMotifMutantsbyOligonucleotideChipsinLamivudine-UntreatedPatientswithChronicHepatitisBVirusInfection。JKoreanMedSci2004;19:541-546.DNA芯片技術(shù)優(yōu)點局限性大通量技術(shù)和設(shè)備的要求高快速檢測成本高靈敏度高可平行檢測

實時熒光定量PCR在基因變異中的應用探針定點突變PCR技術(shù)Taqman-MGB探針引物末端堿基定點突變擴增技術(shù)高分辨熔解曲線法Taqman-MGB探針定點突變PCR技術(shù)Taqman-MGB探針技術(shù)檢測YMDD變異HBVDNA>105copies/mlW:M=1:1HBVDNA>105copies/mlW:M=10:1HBVDNA<105copies/mlW:M=10:1：W：M探針定點突變PCR技術(shù)

優(yōu)點不足

靈敏度高需要相對較貴的熒光PCR儀特異性好需要多條熒光探針，成本高費時短影響因素多，存在一定誤判引物末端堿基定點突變擴增技術(shù)引物末端堿基定點突變擴增技術(shù)

檢測YMDD變異熔解曲線法檢測YMDD變異特異性探針，其Tm值不同溶解曲線分析HBVDNA<105copies/ml檢測技術(shù)的可靠性和穩(wěn)定性DetectionofYMDDMotifMutantsbyOligonucleotideChipsinLamivudine-UntreatedPatientswithChronicHepatitisBVirusInfection。堿基變異可能導致：Taqman-MGB探針定點突變PCR技術(shù)HBVMDD變異與病毒學突破引物末端堿基定點突變擴增技術(shù)優(yōu)點局限性指在核苷類藥物治療過程中血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）水平一度復常，但在繼續(xù)治療中血清ALT水平又再次升高。該技術(shù)在操作上非常繁瑣，目前僅限于研究之需，主要用于藥物開發(fā)研究，尚不能用于常規(guī)臨床分析。細胞外HBV聚合酶活性分析MALDI-TOFMS檢測

HBVYMDD變異的原理HBV表型耐藥（phenotypicresistance）HBVDNA載量檢測手段的敏感性不要過分依基因型耐藥檢測技術(shù)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOFMS)原理MALDI-TOFMS檢測

HBVYMDD變異的原理基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOFMS)優(yōu)點：高靈敏度、準確度、分辨率能發(fā)現(xiàn)相對比例小于1%的變異株。局限性：設(shè)備昂貴，目前國內(nèi)難以用于臨床檢測。HBV耐藥不同檢測技術(shù)的比較AdvancesinMolecularDiagnosisofHBVInfectionandDrugResistance。Int.J.Med.Sci.20052(1)：8-161Sensitivityherereferstothelowestlevel(%)atwhichanassaycandetectmixturesofmutantandwild-typevirus.2Informationcontentisconsideredasameasureofatest’sabilitytoprovidebroad,relevantinformationaboutpossiblenewmutations.3Updateabilityassessestheeaseatwhichatestcanbedaptedtoincorporatethedetectionofanewmutation.na,notapplicable.nd,notdetermined.HBV表型耐藥檢測有兩種途徑：1.細胞外HBV聚合酶活性分析。2.細胞藥物敏感性實驗。細胞外HBV聚合酶活性分析目前常用的研究HBV聚合酶活性模型是將HBV基因組插入桿狀病毒載體，繼而轉(zhuǎn)染昆蟲細胞而表達HBV顆粒，應用親和層析法純化HBV顆粒后，在細胞外評價藥物對聚合酶活性的影響。引物末端堿基定點突變擴增技術(shù)

檢測YMDD變異不要過分依基因型耐藥檢測技術(shù)。用化學試劑在A、G、C、T處特定的裂解DNA片段，產(chǎn)生一簇各種長度的短鏈，經(jīng)過PAGE放射自顯影可直讀DNA順序。之間的相對比。二、各種耐藥檢測技術(shù)及評價基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOFMS)DNA芯片技術(shù)診斷HBVYMDD變異MALDI-TOFMS檢測

HBVYMDD變異的原理反向雜交分析技術(shù)（INNO—LiPA）DetectionofYMDDMotifMutantsbyOligonucleotideChipsinLamivudine-UntreatedPatientswithChronicHepatitisBVirusInfection。病毒學突破（virologicbreakthrough）基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOFMS)用化學試劑在A、G、C、T處特定的裂解DNA片段，產(chǎn)生一簇各種長度的短鏈，經(jīng)過PAGE放射自顯影可直讀DNA順序。臨床耐藥（clinicalresistance）PCR-RFLP技術(shù)的評價細胞外HBV聚合酶活性分析細胞藥物敏感性實驗該方法類似于細菌藥物敏感試驗。目前多采用病毒載體將含有被檢測的含HBV變異位點的全基因組導入肝細胞源性細胞株，然后將各種濃度的核苷類藥物加入培養(yǎng)液，經(jīng)過一定時間培養(yǎng)后檢測細胞上清中的HBVDNA