分子生物學原核生物的轉(zhuǎn)錄

分子生物學原核生物的轉(zhuǎn)錄教學要求掌握一些基本概念:轉(zhuǎn)錄的不對稱性,有義鏈,反義鏈

,轉(zhuǎn)錄單元掌握大腸桿菌RNA聚合酶的組成及各部分的功能理解大腸桿菌σ因子尤其是σ70的功能和識別序列掌握原核生物轉(zhuǎn)錄的過程第1節(jié)轉(zhuǎn)錄的基本原則第2節(jié)大腸桿菌RNA聚合酶第3節(jié)大腸桿菌σ70

啟動子第4節(jié)轉(zhuǎn)錄過程主要內(nèi)容MolecularBiologyCourse第1節(jié)

轉(zhuǎn)錄的基本原則一、轉(zhuǎn)錄概述二、RNA合成的過程1.轉(zhuǎn)錄(Transcription):生物體以DNA為模板合成RNA的過程。

TranscriptionRNADNA

一、轉(zhuǎn)錄概述CentralDogmaofmolecularbiologyInformationstoreinDNAflows:FromDNA→DNA(Replication)FromDNA→RNA(Transcription)FromRNA→Protein(Translation)FourtypesofRNAmadeMessenger

RNAMostoftheRNAincellsisfoundinribosomes--ourprotein-synthesizingmachinesThetransferRNAmoleculesusedtoaddeachnewaminoacidtogrowingproteins.SmallRNAmoleculesareinvolvedinregulating,processinganddisposingoftheconstanttrafficofmessengerRNA.MessengerRNATransferRNARibosomalRNASmallNuclearRNA(eukaryotes)Somepromotersarenot.Somepromotersequencearenotsufficientlysimilartotheconsensussequencetobestronglytranscribedundernormalcondition,thusactivatingfactorisrequiredforefficientinitiation.StructureofatypicaltranscriptionunitSensestrand由6個堿基組成，其中心位于-10位置處，在許多不同的大腸桿菌基因啟動子中都存在。顯著的增強全酶與正確啟動子結(jié)合位點相結(jié)合的特異性。AACTGT（1）新生RNA鏈發(fā)夾結(jié)構(gòu)形成Transcriptionbubble全酶（HoloEnzyme）功能2、依賴ρ因子的終止子Transcriptionbubbleb由rpoB編碼,b’由rpoC編碼.TranscriptionterminationofProkaryotic保守序列為TATAAT.2.轉(zhuǎn)錄所需的物質(zhì)Theprecursorribonucleotides(前體核糖核酸):NTP(ATP,UTP,GTP,CTP)Template(模板):DNAEnzyme(酶):RNApolymerase(RNA-pol)RNA聚合酶OtherproteinfactorsRNAistranscribed5

→3

3.轉(zhuǎn)錄所需的模板(1)結(jié)構(gòu)基因：DNA分子上，能編碼RNA或蛋白質(zhì)的DNA片段。(2)Templatestrand(antisense

strandorWatsonstrand)

模板鏈或反義鏈:

根據(jù)堿基互補原則指導RNA合成的DNA鏈。

(3)Codingstrand(sense

strandorCrickstrand)

編碼鏈或有義鏈:與mRNA序列相同的那條DNA鏈nonsensesenseRNApolymeraseATPGTPCTPUTP5

3

3

5

TemplatestrandCodingstrandCodingstrandTemplatestrandStructuralgeneDirectionoftranscriptionDirectionoftranscription4.Asymmetrictranscription(不對稱轉(zhuǎn)錄)

DNA鏈上只有部分的區(qū)段作為轉(zhuǎn)錄模板(反義鏈或模板鏈),且模板鏈并非自始至終位于同一股DNA單鏈上，稱為轉(zhuǎn)錄的不對稱性。5.transcriptionunit（轉(zhuǎn)錄單元）一段從啟動子開始至終止子結(jié)束的DNA序列。包括上游調(diào)控區(qū)、結(jié)構(gòu)基因區(qū)、下游轉(zhuǎn)錄終止區(qū)三個部分。原核生物的轉(zhuǎn)錄單位多為多順反子,真核生物中的轉(zhuǎn)錄單位多為單順反子。轉(zhuǎn)錄起點即轉(zhuǎn)錄原點記為＋1，其上游記為負值，下游記為正值。PromoterTerminatorTranscribedregionSensestrandAntisensestrandDNARNATranscription+1StructureofatypicaltranscriptionunitIstranscribedregionequaltocodingregion?Why?單林娜制作15

lacIRegulatorygenelacZlacYlacADNAm-RNAβ

-GalactosidasePermeaseTransacetylaseProteinStructuralGenesPlacIPlacOlac6.轉(zhuǎn)錄與復制的比較相同點的：Template:DNA底物:nucleotideDirection:5′→3′DNA-dependentpolymerase依賴DNA的聚合酶Watson-CrickbasepairingProduct:polynucleotidechain多聚核苷酸鏈不同點replicationtranscription模板兩股鏈均作為模板模板鏈作為模板原料dNTPNTP聚合酶DNA聚合酶RNA聚合酶產(chǎn)物子代DNA雙鏈mRNA;tRNA;rRNA配對A-T；G-CA-U；T-A；G-C引物需RNA引物--------方式(特點)半保留復制不對稱轉(zhuǎn)錄二、

RNA合成的過程RNA聚合酶識別啟動子Initiation起始Elongation延伸Termination終止第2節(jié)大腸桿菌RNA聚合酶以DNA為模板合成單鏈RNAArthurKornberg(left)withhisson,Roger,afterRogerreceivedtheNobelPrizeinChemistryfor2006.ArthurKornbergreceivedtheNobelPrizeinPhysiologyorMedicinein1959.BothfatherandsonarefacultymembersattheStanfordUniversitySchoolofMedicine.Kornbergswiththepolymerases"Therehavegottobetensofthousandsofpeoplearoundtheworldtodaywhoseeyesaretearingupwiththenewsthathe'sgone.""Hewasanextraordinaryscientist.Hisaccomplishmentsmightbecalledlegendary."

不需要引物以DNA為模板5′3′合成需要Mg2+沒有3’5’外切活性，核苷酸的錯誤摻入率為10-4-10-5

由多亞基構(gòu)成的酶一、RNApolymerase以DNA為模板，催化2個游離的NTP形成3’，5’-磷酸二酯鍵二、E.coliRNA聚合酶E.coli

只有一種RNA聚合酶，指導所有類型RNA的合成最大的酶之一全酶至少由5個亞基構(gòu)成,2alpha(a),and1ofbeta(b),betaprime(b’),omega(w)andsigma(s)亞基RNA合成的速率:37oC下

40nt/sE.ColiRNApol的亞基組成β’βα

α

ω

σ

只用于起始

用于起始和延伸

BacterialRNApolymeraseAACTGTIstranscribedregionequaltocodingregion?Why?序列形成（富含G/C）掌握大腸桿菌RNA聚合酶的組成及各部分的功能DNA-酶-底物NTP三元起始復合物的形成Thereisconsiderablevariationinsequencebetweendifferentpromoters,andthetranscriptionefficiencycanvarybyupto1000-fold.TranscriptionterminationofProkaryotic4)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA沿5’3’方向延長TransferRNA(2)Templatestrand(antisensestrandorWatsonstrand)模板鏈或反義鏈:根據(jù)堿基互補原則指導RNA合成的DNA鏈。(recognitionsite)Example:LacpromoterPlacrequiresactivatingprotein,cAMPreceptorprotein(CRP，環(huán)腺苷酸受體蛋白),tobindtoasiteontheDNAclosetothepromotersequenceinordertoenhancepolymerasebindingandtranscriptioninitiation.RNApolymeraseDNA模板上有終止信號SmallRNAmoleculesareinvolvedinregulating,processinganddisposingoftheconstanttrafficofmessengerRNA.1.α亞基由rpoA編碼核心酶的組建因子

促使RNApol與DNA模板鏈結(jié)合前端α因子－－使模板DNA雙鏈解鏈為單鏈尾端α因子－－使解鏈的單鏈DNA重新聚合為雙鏈α＋α2α＋β

α2β＋β’BacterialRNApolymeraseb

由rpoB

編碼,b’由rpoC

編碼.RNA聚合酶的催化中心.bsubunit：含有兩個結(jié)構(gòu)域分別負責轉(zhuǎn)錄的起始和延伸。2.bandb

亞基b’亞基結(jié)合兩個鋅離子，參與酶的催化功能。負責酶與模板DNA相結(jié)合(充當SSB的作用)。許多原核生物含有多個s

因子，用于識別不同的啟動子，最常見的是s70核心酶與s因子結(jié)合轉(zhuǎn)變?yōu)槿浮幼幼R別中起著關(guān)鍵的作用轉(zhuǎn)錄起始后，sfactor解離(RNAchainis9-10nt)細胞中s

因子比其他亞基少。3.s

因子E.coli中不同的

因子可識別不同的啟動子GeneFactorUseSequence

SeparationSequence

－35

－10

70

General

32Heatshock

EHeatshock

54

Nitrogen

Fflagellar

大腸桿菌RNA聚合酶的組成分析亞基基因相對分子量亞基數(shù)組分功能αrpoA365002核心酶核心酶組裝，啟動子識別βrpoB1510001核心酶β和β'共同形成RNA合成的活性中心β'rpoC1550001核心酶用于模板的結(jié)合ω？110001核心酶？σrpoD700001σ因子存在多種σ因子，用于識別不同的啟動子CoreEnzyme

具有的四個功能位點

ααβ’β★

DNA/RNA雜交位點(β)

★

D.S.DNA解鏈位點(α)

★

D.S.DNA重旋(α)

★啟動子識別位點

σ★

DNA無義鏈結(jié)合位點(β’)

4.全酶（HoloEnzyme）功能用于轉(zhuǎn)錄的起始和延伸依靠空間結(jié)構(gòu)與DNA模板結(jié)合(σ與核心酶結(jié)合后引起的構(gòu)象變化)專一性地與DNA序列(啟動子)結(jié)合結(jié)合常數(shù)：1014／mol轉(zhuǎn)錄效率低，速度緩慢（σ的結(jié)合）BacterialRNApolymerase5.核心酶（CoreEnzyme）的功能作用于轉(zhuǎn)錄的延伸過程（終止）依靠靜電引力與DNA模板結(jié)合（蛋白質(zhì)中堿性基團與DNA的磷酸根之間）非專一性的結(jié)合（與DNA的序列無關(guān)）結(jié)合常數(shù)：1011／molBacterialRNApolymeraseT3RNA聚合酶和T7

RNA聚合酶小分子轉(zhuǎn)錄速度快(200nt/sec)

識別自身啟動子RNApolymerasediffersfromorganismtoorganism6.其他RNA聚合酶第三節(jié)大腸桿菌s70啟動子一、

Promoter啟動子二、promoterefficiency啟動子的效率一、Promoter啟動子特異的短的保守序列位于轉(zhuǎn)錄起始位點的上游，用負數(shù)表示。是RNA聚合酶特異性結(jié)合和轉(zhuǎn)錄起始所必須的。是指DNA分子上被RNA聚合酶識別并結(jié)合形成起始轉(zhuǎn)錄復合物的區(qū)域，它還包括一些調(diào)節(jié)蛋白因子的結(jié)合位點。Differentpromotersresultindifferingefficienciesoftranscriptioninitiation,whichinturnregulatetranscription.PromoterTerminatorTranscribedregionSensestrandAntisensestrandDNARNATranscription+1-55to+20:全酶的結(jié)合-20to+20:聚合酶緊密結(jié)合，防止DNaseΙ的降解Uptoposition–40:最重要

(mutagenesisanalysis)-10and–35sequence:6bp,對大腸桿菌基因的起始轉(zhuǎn)錄最關(guān)鍵s70promoter開始轉(zhuǎn)錄TTGACAAACTGT-35區(qū)(Pribnowbox)TATAATPuATATTAPy-10區(qū)1-30-5010-10-40-205

3

3

5

原核生物啟動子保守序列RNA-pol辨認位點(recognitionsite)5

5

RNA聚合酶保護區(qū)結(jié)構(gòu)基因3

3

-10sequence(Pribonowbox，Pribonow框)高度保守序列，位于DNA解旋開始的部位。由6個堿基組成，其中心位于-10位置處，在許多不同的大腸桿菌基因啟動子中都存在。保守序列為TATAAT.頭兩個堿基(TA)

和最后的堿基T

高度保守。與轉(zhuǎn)錄起始位點(+1)之間的距離為5-8bp。RNAchain起始發(fā)夾結(jié)構(gòu)的突變可阻止轉(zhuǎn)錄的終止前端α因子－－使模板DNA雙鏈解鏈為單鏈Negativesupercoiling(負超螺旋)&unwinding(一)、終止子的種類RNA聚合酶的催化中心.Termination終止Elongation延伸(一)、終止子的種類使轉(zhuǎn)錄復合物趨于解離，RNA產(chǎn)物釋放。17個核苷酸的DNA形成解鏈區(qū)，產(chǎn)物RNA鏈大約有12個核苷酸與模板形成RNA-DNA雜合雙鏈StructureofatypicaltranscriptionunitRNA聚合酶（全酶）中的σ因子在DNA雙鏈上迅速、隨機滑動，尋找到啟動子-35區(qū)，形成疏松的復合物，DNA雙鏈未解開?！飭幼幼R別位點σ(rho-dependentterminators)其功能是:(1)RNApol緊密結(jié)合;(2)形成開放啟動復合體；酶在此處與DNA結(jié)合成穩(wěn)定的復合物，在轉(zhuǎn)錄方向上解開雙鏈形成開放型起始結(jié)構(gòu)。

(3)使RNApol定向轉(zhuǎn)錄。-35sequence(Sextama盒,Sextamabox):

RNA聚合酶的起始識別區(qū)；σ亞基識別-35序列，為轉(zhuǎn)錄選擇模板位于-35位置處的一個保守的六聚體序列TTGACA頭三個堿基(TTG)是高度保守的與–10box之間的距離為16-19bpRNA聚合酶的松弛（初始）結(jié)合位點RNA聚合酶依靠其σ亞基識別該位點，為轉(zhuǎn)錄選擇模板——識別位點重要性:很大程度上決定了啟動子的強度Transcriptionstartsite轉(zhuǎn)錄起始位點轉(zhuǎn)錄開始時模板上的第一個堿基，90％基因的起始位點是嘌呤G比A普遍(i.e.CGTorCAT)在起始核苷酸的兩側(cè)是C和T大腸桿菌RNA聚合酶全酶所識別的啟動子區(qū)T85T83G81A61C69A52T89A89T50A65A100以DNA為模板合成單鏈RNA酶移動到轉(zhuǎn)錄起始位點，第一個rNTP轉(zhuǎn)錄開始,σ因子釋放,形成酶-啟動子-rNTP三元復合體（ternarycomplex）。轉(zhuǎn)錄速度快(200nt/sec)——RNApol解離——轉(zhuǎn)錄終止轉(zhuǎn)錄起始后，sfactor解離(RNAchainis9-10nt)DNA模板上有終止信號1、不依賴ρ因子的終止子(強終止子)轉(zhuǎn)錄起點即轉(zhuǎn)錄原點記為＋1，其上游記為負值，下游記為正值。細胞中s因子比其他亞基少。Tonextpic.RNA聚合酶（全酶）移向-10區(qū)和轉(zhuǎn)錄起始當RNA聚合酶聚合新生RNA鏈為9~10個核苷酸時，σ因子脫離全酶，進入延伸階段。coli中不同的因子可識別不同的啟動子第三節(jié)大腸桿菌s70啟動子全酶至少由5個亞基構(gòu)成,2alpha(a),and1ofbeta(b),betaprime(b’),omega(w)andsigma(s)亞基二、promoterefficiency啟動子的效率Thereisconsiderablevariationinsequencebetweendifferentpromoters,andthetranscriptionefficiencycanvarybyupto1000-fold.The–35sequence

:s因子識別的區(qū)域.The-10sequence

對DNA解旋起著重要的作用。起始位點周圍的序列影響起始效率。最初轉(zhuǎn)錄的30個堿基控制著RNA聚合酶離開啟動子，使另一聚合酶復合物重新起始轉(zhuǎn)錄的速率。Somepromotersequence

arenotsufficientlysimilartotheconsensussequence

tobestronglytranscribedundernormalcondition,thusactivatingfactorisrequiredforefficientinitiation.Example:

Lac

promoter

Plac

requiresactivatingprotein,

cAMP

receptorprotein

(CRP，環(huán)腺苷酸受體蛋白),

tobindtoasiteontheDNAclosetothepromotersequenceinorderto

enhancepolymerasebindingandtranscriptioninitiation.Weakpromotersandactivatingfactor第4節(jié)轉(zhuǎn)錄過程一、RNA鏈起始二、RNA鏈延伸三、RNA鏈終止一、RNA鏈起始Promoterbinding啟動子結(jié)合DNAunwindingDNA解旋RNAchaininitiationRNA鏈起始1.

啟動子的結(jié)合尋找啟動子的速度非?？烊概c－35序列結(jié)合，產(chǎn)生封閉的酶-啟動子二元復合物and–10regionLink核心酶a2bb’w,

與DNA的結(jié)合無特異的親和性，結(jié)合非常松散顯著的增強全酶與正確啟動子結(jié)合位點相結(jié)合的特異性。Theroleofsfactor

inpromoterbinding

2.

DNA解旋全酶緊密地結(jié)合在-10序列處，模板DNA局部變性，形成開放的啟動子二元復合體+1DNA解旋是必須的，使反義鏈通過堿基配對合成RNA。Negativesupercoilingenhancesthetranscriptionofmanygenes，sinceitfacilitates(有利于)unwinding.Somepromotersarenot.Exceptionalexample:

promtersfortheenzymesubunitsofDNAgyrase(旋轉(zhuǎn)酶)

areinhibitedbynegativesupercoiling,servingasanelegantfeedbackloopforDNAgyraseexpression.Negativesupercoiling(負超螺旋)&unwinding3.

RNAchain起始+1酶移動到轉(zhuǎn)錄起始位點，第一個rNTP轉(zhuǎn)錄開始,σ因子釋放,形成酶-啟動子-rNTP三元復合體（ternarycomplex）。StartswithaGTPorATPRNApolymeraseholoenzyme(+sfactor)closedpromotercomplex(moderatelystable)thesigmasubunitbindstothe-10regiononceinitiationtakesplace,RNApolymerasedoesnotneedveryhighaffinityforthepromotersigmafactordissociatesfromthecorepolymeraseafterafewelongationreactionselongationtakesplacewiththecoreRNApolymeraseopenpromotercomplex(highlystable)theholoenzymehasveryhighaffinityforpromoterregionsbecauseofsigmafactorssigmacanre-bindothercoreenzymesThesigmacycless起始過程：RNA聚合酶全酶搜索并結(jié)合DNA特異位點RNA聚合酶全酶接觸DNA分子,通過接觸-解離-再接觸搜索啟動子序列閉和的啟動子復合體RNA聚合酶（全酶）中的σ因子在DNA雙鏈上迅速、隨機滑動，尋找到啟動子-35區(qū)，形成疏松的復合物，DNA雙鏈未解開。開放的啟動子復合體RNA聚合酶（全酶）移向-10區(qū)和轉(zhuǎn)錄起始點,在-20區(qū)DNA雙鏈解開12-17bp時的啟動子復合體。DNA-酶-底物NTP三元起始復合物的形成在聚合酶全酶的作用下，聚合第一個磷酸二酯鍵以及連續(xù)的一小段新生RNA鏈。當RNA聚合酶聚合新生RNA鏈為9~10個核苷酸時，σ因子脫離全酶，進入延伸階段。σα2ββ’5’5’原核生物轉(zhuǎn)錄起始過程二、

RNAchain延伸Transcriptionbubble(轉(zhuǎn)錄泡)1)

亞基脫落，RNA–pol聚合酶核心酶變構(gòu)，與模板結(jié)合松弛，沿3’5’方向前移；

2)

在核心酶作用下，NTP不斷聚合，RNA鏈不斷延長。

3)

RNA-DNA形成12bp長的雜交螺旋

4)

轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA沿5’

3’方向延長單林娜制作61

7啟動子清除:起始成功后，s

因子釋放出來，形成一個由RNA聚合酶-DNA-新生的RNA組成的三聚體，核心酶向下游移動離開啟動子。Transcriptionbubble:

(轉(zhuǎn)錄泡)17個核苷酸的DNA形成解鏈區(qū)，產(chǎn)物RNA鏈大約有12個核苷酸與模板形成RNA-DNA雜合雙鏈RNA聚合酶沿著DNA鏈移動，在轉(zhuǎn)錄泡之間解開雙螺旋，在轉(zhuǎn)錄泡之后形成雙螺旋。TheE.colipolymerasemovesatanaveragerateof~40ntpersec,dependingonthelocalDNAsequence.Transcriptionbubble三、轉(zhuǎn)錄的終止

TranscriptionterminationofProkaryoticRNA聚合酶在DNA模板上停頓下來不再前進，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA鏈從轉(zhuǎn)錄復合物上脫落下來。(一)、終止子的種類(二)、原核生物轉(zhuǎn)錄的終止TranscriptionterminationofProkaryotic

(一)、終止子的種類1、不依賴ρ因子的終止子/內(nèi)在終止子(rho-independentterminators/intrinsicterminators)

體外實驗中，只有核心酶和終止子就足以使轉(zhuǎn)錄終止。2、依賴ρ因子的終止子

(rho-dependentterminators)

蛋白質(zhì)輔助因子－－ρ因子存在時，核心酶終止轉(zhuǎn)錄

兩者有共同的結(jié)構(gòu)特征（序列差異）1、不依