第9章 催化策略(劉建華)

BiochemistrySixthEditionChapter9:CatalyticStrategies(催化(cuīhuà)策略）Copyright?2007byW.H.FreemanandCompany

Berg?Tymoczko?Stryer共七十八頁國際象棋和酶都使用策略，國際象棋通過比賽發(fā)展策略，而酶則通過進化建立酶促反應(yīng)機制。右邊是能夠酶切肽鍵(tàijiàn)的活性位點，由三個氨基酸殘基（化學(xué)鍵是白色）構(gòu)成。用黑色化學(xué)鍵表示的底物分子如同左邊比賽中已經(jīng)落入圈套的國王，面臨被裂解的命運。共七十八頁酶催化效率高、特異性強、條件溫和。這些特征的基礎(chǔ)是什么？介紹(jièshào)四類酶促反應(yīng)的機制：絲氨酸蛋白酶、碳酸脫水酶、限制性核酸內(nèi)切酶、和核苷單磷酸激酶。前三類將水分子加成到底物分子上，第四類避免水分子的加成。經(jīng)過大量的實驗研究（包括蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測定、定點突變），發(fā)現(xiàn)：酶的催化機制基本策略是結(jié)合能、誘導(dǎo)匹配、和一些特殊的催化策略，協(xié)助底物形成轉(zhuǎn)化態(tài)共七十八頁每類酶的催化機制能解決各種化學(xué)反應(yīng)(huàxuéfǎnyìng)所面臨的問題。蛋白酶：將缺乏催化劑和pH7.0幾乎不發(fā)生的反應(yīng)(蛋白質(zhì)水解）進行下去。碳酸脫水酶：將化學(xué)反應(yīng)加速到能夠與其他快速生理過程融合的水平。限制性內(nèi)切酶：實現(xiàn)酶切反應(yīng)的高度特異性。NMP激酶：把磷酸基團從ATP轉(zhuǎn)移給另一個核苷酸（而不會轉(zhuǎn)移到水分子）。共七十八頁酶采用的幾個基本的催化原則底物與酶結(jié)合啟動催化。結(jié)合能是酶和底物之間形成大量弱相互作用所釋放的自由能。這種結(jié)合能既可建立底物特異性，又能增加酶促效率。當(dāng)?shù)孜镛D(zhuǎn)化成轉(zhuǎn)化態(tài)，底物與酶之間完全互補。因此底物和酶之間的相互作用穩(wěn)定轉(zhuǎn)化態(tài)，從而降低(jiàngdī)反應(yīng)的活化自由能。結(jié)合能對底物和酶分子的結(jié)構(gòu)變化都有促進作用，使它們相互間匹配度更高（誘導(dǎo)匹配），有助于催化反應(yīng)。共七十八頁酶通常采用(cǎiyòng)下列一種或幾種策略催化特定化學(xué)反應(yīng)。共價催化。共價催化的活性位點有活潑基團，通常是很強的親核基團。在酶促過程中親核基團能暫時性共價連接底物。胰凝乳蛋白酶就采用這種策略。酸堿催化。酸堿催化中，水分子之外的物質(zhì)提供質(zhì)子或接受質(zhì)子。接近催化。很多酶有兩個不同的底物，將兩種底物置于一個酶分子的同一結(jié)合面能顯著增加反應(yīng)速度。金屬離子催化。金屬離子起催化作用的方式有幾種：有的是配位作用產(chǎn)生OH-離子（親核試劑）；有的本身是親電試劑，穩(wěn)定帶負電荷的中間體；還有的作為底物與酶結(jié)合的橋梁，增加結(jié)合能、將底物置于酶分子合適位置適于催化。共七十八頁蛋白酶能促進非常難于(nányú)發(fā)生的反應(yīng)共七十八頁圖9.1胰凝乳蛋白酶的特異性。裂解(lièjiě)芳香氨基酸或大的疏水氨基酸（已經(jīng)用桔色涂出）C-端肽鍵（用紅色標出）。共七十八頁圖9.2胰凝乳蛋白酶具有一個(yīɡè)高度活潑的絲氨酸。用DIPF

處理，胰凝乳蛋白酶分子28個絲氨酸殘基中195位絲氨酸與DIPF反應(yīng)，導(dǎo)致胰凝乳蛋白酶失活。共七十八頁圖9.3顏色底物。胰凝乳蛋白酶水解(shuǐjiě)

N-乙酰-L-苯丙氨酸-p-硝基苯酚酯產(chǎn)生黃色產(chǎn)物對硝基苯酚。在pH7.0，對硝基苯酚解離。共七十八頁停留法(stopped-flowmethod)

檢測反應(yīng)(fǎnyìng)的起始狀態(tài)，能夠在毫秒范圍內(nèi)混合酶和底物、跟蹤毫秒時間內(nèi)的反應(yīng)(fǎnyìng)結(jié)果。結(jié)果顯示起始狀態(tài)迅速形成一種顏色產(chǎn)物，隨后緩慢（即進入穩(wěn)態(tài)）（圖9.4）。這些結(jié)果提示：酶促反應(yīng)過程有兩個步驟，第一步很快，第二步很慢。圖9.4胰凝乳蛋白酶催化的動力學(xué)。酶水解N-乙酰-L-苯丙氨酸-p-硝基苯酚酯有兩個(liǎnɡɡè)階段：快速（穩(wěn)態(tài)前）階段和穩(wěn)態(tài)階段。共七十八頁胰凝乳蛋白酶促水解反應(yīng)的兩個步驟涉及酶與底物的共價結(jié)合（圖9.5）。第一步，底物的酰基與酶共價結(jié)合，同時釋放對硝基苯酚或胺類（如果底物是酰胺鍵）。酶-酰基復(fù)合物稱為?；钢虚g物。第二步，?；钢虚g物水解，釋放底物的羧酸(suōsuān)組分和游離酶。酶酰化并釋放對硝基苯酚的速度很快，但是水解?；浮盎謴?fù)”游離酶的速度很慢。圖9.5共價(ɡònɡjià)催化。胰凝乳蛋白酶水解有兩個階段：（A）?；纬甚；?酶中間體；隨后(B)去酰化釋放游離酶。共七十八頁圖9.61967年DavidBlow

解析了胰凝乳蛋白酶的三維結(jié)構(gòu)。球狀、三條多肽鏈、二硫鍵連接在一起(yīqǐ)。酶促活性位點有Ser195，位于酶表面的裂縫中（圖9.6）?；钚晕稽c的結(jié)構(gòu)說明Ser195特別活潑（圖9.7）。共七十八頁Ser195的側(cè)鏈與His57的咪唑環(huán)形成氫鍵(qīnɡjiàn)，咪唑環(huán)的NH又與Asp102形成氫鍵，活性位點氨基酸殘基這樣的排布稱為催化三聯(lián)體。這種排布使Ser195特別活潑。組氨酸殘基定位Ser殘基側(cè)鏈，極化Ser側(cè)鏈的羥基（去質(zhì)子）。底物存在時，His57側(cè)鏈接受Ser195側(cè)鏈羥基的質(zhì)子，因此His57是堿催化劑。Ser195丟失氫離子，產(chǎn)生烷基氧離子，其親核性比羥基大得多。Asp102協(xié)助His57定位，通過氫鍵和靜電相互作用使His57更能接受Ser195的質(zhì)子。共七十八頁第一階段反應(yīng)（酶的酰化）：第1步：底物與酶結(jié)合。第2步：His57（堿催化）接受Ser195質(zhì)子，后者的氧親核攻擊目標肽鍵的羰基碳原子，使這個碳從平面結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化成四面體結(jié)構(gòu)。羰基碳原子的四面體結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定（因為羰基原來的氧原子帶有負電荷），但是(dànshì)氧負離子與酶蛋白的氧負離子洞的NH基團（圖9.9）相互作用穩(wěn)定，從而穩(wěn)定羰基碳原子四面體（轉(zhuǎn)化態(tài)）。第3步，四面體崩潰產(chǎn)生酰化酶。His57的正電荷側(cè)鏈給要斷裂肽鍵的氨基提供質(zhì)子（酸催化）。第4步，斷裂肽鍵的氨基成分離開酶共七十八頁共七十八頁第二階段是酶的脫酰反應(yīng)。?；铬ユI的水解反應(yīng)基本上是重復(fù)第2至第4步。第5步：水分子占據(jù)先前底物氨基成分所在的位置(wèizhi)。第6步：His57（作為堿催化劑）的咪唑環(huán)吸收水分子的質(zhì)子，產(chǎn)生的OH-離子攻擊?；奶荚?，形成四面體碳原子。第7步：His57作為酸催化劑，提供質(zhì)子導(dǎo)致四面體碳原子崩潰，斷裂形成羧基。第8步：釋放羧酸產(chǎn)物和游離酶。共七十八頁共七十八頁圖9.8胰凝乳蛋白酶水解肽鍵的催化反應(yīng)可以解釋共價催化和酸堿催化機制。反應(yīng)(fǎnyìng)過程包括8步：（1）底物結(jié)合；（2）絲氨酸親核攻擊肽鍵的羰基碳原子；（3）四面體崩潰；（4）氨基組分釋放；（5）水分子結(jié)合；（6）水分子親核攻擊?；钢虚g體；（7）四面體崩潰；（8）羧酸成分釋放。虛線表示氫鍵。共七十八頁圖9.9氧負離子洞。胰凝乳蛋白酶促反應(yīng)的氧負離子中間體用氧負離子洞穩(wěn)定。氧負離子洞的肽鍵(tàijiàn)NH與氧負離子中間體形成氫鍵（綠色虛線）。共七十八頁該機制(jīzhì)能解釋胰凝乳蛋白酶促反應(yīng)的所有特征，但不能解釋這個酶的底物特異性。

酶與底物類似物和抑制劑形成復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)酶分子有一個相對疏水的深口袋，成為S1口袋，適于長的非極性氨基酸側(cè)鏈。適當(dāng)側(cè)鏈與該口袋結(jié)合將鄰位肽鍵定位于斷裂位點（圖9.10）。胰凝乳蛋白酶的底物特異性幾乎完全取決于肽鍵N-端的氨基酸側(cè)鏈。共七十八頁圖9.10胰凝乳蛋白酶特異性口袋。胰凝乳蛋白酶底物結(jié)合口袋用相對疏水的殘基構(gòu)建、很深，有助于結(jié)合長的疏水性(shuǐxìng)殘基如苯丙氨酸（綠色）側(cè)鏈?；钚晕稽c195位Ser定位在斷裂肽鍵。構(gòu)成結(jié)合位點的關(guān)鍵殘基已經(jīng)標出。共七十八頁其他蛋白酶的底物(dǐwù)特異性更為復(fù)雜。這些酶分子表面還有其他口袋識別底物(dǐwù)分子的其他殘基。斷裂肽鍵的N-端殘基分別稱為P1，P2，P3（從C-斷向N-端編號），斷裂肽鍵C-端氨基酸殘基分別是P1',P2',P3'（從N-端向C-端編號）。相應(yīng)地，結(jié)合這些位點的口袋對應(yīng)地稱為S1,S2或S1',S2'等。圖9.11蛋白酶和底物先互作用的命名方法。底物與酶潛在的相互作用位點用紅色的P表示。酶分子(fēnzǐ)相應(yīng)的結(jié)合位點用S表示。斷裂肽鍵（用紅色標出）是這種命名的參考位點。共七十八頁圖9.12胰蛋白酶和胰凝乳(nínɡrǔ)蛋白酶的結(jié)構(gòu)類似性。將胰凝乳蛋白酶（紅色）置于胰蛋白酶（藍色）之上，顯示兩者相似度很高。此處僅顯示a-碳原子骨架。兩種蛋白質(zhì)分子之間a-碳原子誤差是1.7A。共七十八頁圖9.9胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶(yídànbáiméi)、和彈性蛋白酶的S1口袋。有些氨基酸殘基在決定這些酶的特異性方面起關(guān)鍵作用。用顏色標出了這些殘基的側(cè)鏈和活性位點的絲氨酸。共七十八頁枯草桿菌蛋白酶（不是胰凝乳蛋白酶同源(tónɡyuán)物）也有催化三聯(lián)體活性位點和氧離子洞，但是這個酶的氧離子洞的一個氨基來自天冬酰胺殘基的側(cè)鏈而不是肽鏈骨架（圖9.14）?？莶輻U菌蛋白酶屬于另一蛋白酶家族，在古生菌、細菌、和真核生物發(fā)現(xiàn)了這一蛋白酶家族成員。圖9.14枯草桿菌的催化三聯(lián)體和氧負離子洞。氧負離子洞的兩個氨基分別來自肽鏈骨架(gǔjià)氨基和Asn155的側(cè)鏈氨基。這兩個氨基能夠穩(wěn)定活性中心Ser221親核攻擊肽鍵碳原子所形成的氧負離子。共七十八頁小麥羧肽酶II有催化三體，但是這個酶與胰凝乳(nínɡrǔ)蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶都沒有明顯的類似性（圖9.15）。圖9.15羧肽酶II。小麥羧肽酶II的結(jié)構(gòu)（右邊），有兩條肽鏈（分別用藍色和紅色標出）。活性中心的催化三體（左邊）與胰凝乳蛋白酶的組成相同。但是該酶與胰凝乳蛋白酶沒有相似之處。形成氧離子洞的氨基酸殘基用黃色涂出。該蛋白質(zhì)屬于(shǔyú)另一蛋白家族，包括乙酰膽堿酯酶和脂質(zhì)酶。在這些酶中，用組氨酸活化的親核試劑可能是半胱氨酸而不是絲氨酸。共七十八頁最后，還有一類蛋白酶活性位點的絲氨酸或蘇氨酸不是用天冬氨酸-組氨酸對活化，而是用賴氨酸側(cè)鏈氨基(ānjī)或肽鏈N-端氨基活化。因此，蛋白酶活性中心的催化三體在進化過程中產(chǎn)生的時間點至少有三個。這類催化策略在水解肽及相關(guān)化學(xué)鍵方面尤為有效。共七十八頁定點(dìnɡdiǎn)突變研究

共七十八頁定點突變也能研究氧離子洞對催化反應(yīng)的重要性。Asn155突變成甘氨酸能消除(xiāochú)枯草桿菌氧負離子洞的一個氨基，kcat值降至野生型酶的0.2%，Km值增加兩倍。這些結(jié)果顯示天冬酰胺的NH基團在穩(wěn)定羰基碳四面體中間物以及形成該四面體的轉(zhuǎn)化態(tài)方面起重要作用。共七十八頁其他(qítā)種類的肽水解酶:半胱氨酸蛋白酶組氨酸殘基活化半胱氨酸，后者親核攻擊肽鍵（與絲氨酸蛋白酶的絲氨酸相似)。木瓜蛋白酶(papain)是研究最深入的半胱氨酸蛋白酶。與該酶同源的哺乳動物蛋白酶有組織蛋白酶（cathepsins)，在免疫系統(tǒng)和其他系統(tǒng)起作用。Caspases也是半胱氨酸蛋白酶，負責(zé)細胞凋亡，但是Caspases的結(jié)構(gòu)與木瓜蛋白酶沒有關(guān)系。因此在進化過程中，半胱氨酸蛋白酶至少(zhìshǎo)獨立出現(xiàn)兩次。共七十八頁其他(qítā)種類的肽水解酶:天冬氨酸蛋白酶天冬氨酸蛋白酶活性位點中心有一對天冬氨酸，聯(lián)合作用活化水分子，后者攻擊肽鍵。一個天冬氨酸去質(zhì)子，攻擊水分子（使之脫去質(zhì)子）。另一個天冬氨酸有質(zhì)子，極化(jíhuà)肽鍵使肽鍵對親核攻擊敏感。這類蛋白酶包括腎素，HIV蛋白酶。共七十八頁活性位點有金屬離子（幾乎都是鋅離子）。金屬離子活化水分子，后者親核攻擊肽鍵(tàijiàn)的羰基。嗜熱細菌蛋白酶（thermolysin）和消化酶羧肽酶A是鋅離子蛋白酶。嗜熱菌蛋白酶是鋅蛋白酶家族成員。這個家族很大，包括基質(zhì)金屬蛋白酶（負責(zé)組織重構(gòu)和組織降解）。但是羧肽酶A不屬于這一家族。其他種類(zhǒnglèi)的肽水解酶:金屬蛋白酶共七十八頁講到此.共七十八頁圖9.19HIV蛋白酶是二聚體天冬氨酸蛋白酶。兩個亞基完全相同（分別用藍色和黃色表示）。每個亞基（有99個氨基酸）給活性位點提供一個Asp。底物(dǐwù)結(jié)合后關(guān)閉結(jié)合口袋的扇翼結(jié)構(gòu)。共七十八頁圖9.20

Indinavir

是HIV蛋白酶抑制劑。Indinavir(crixivan)的結(jié)構(gòu)與HIV蛋白酶底物多肽的結(jié)構(gòu)比較(bǐjiào)。底物斷裂化學(xué)鍵用紅色標出。共七十八頁Indinavir的醇與四面體中間(zhōngjiān)物很相似，其它基團與酶分子識別位點S2,S1,S1’,和S2’結(jié)合。在活性位點，indinavir采用的構(gòu)型接近于酶蛋白的二重對稱結(jié)構(gòu)。結(jié)合抑制劑后可變翼蓋住HIV蛋白酶活性位點。抑制劑中心醇羥基與活性位點兩個Asp相互作用。抑制劑的兩個羰基與水分子形成氫鍵(在圖9.21沒有繪出)，而水分子又與兩翼的肽鍵NH基團形成氫鍵。這種互作模式不可能出現(xiàn)(chūxiàn)在抑制劑與細胞天冬氨酸蛋白酶（如腎素）之間。這些決定indinavir抑制HIV的特異性。共七十八頁碳酸脫水酶：37℃，中性pH，沒有催化劑，CO2的水合速度常數(shù)相當(dāng)于一級反應(yīng)速度k1=0.15s-1。而碳酸脫水生成CO2的逆反應(yīng)速度是k-1=50s-1（更快）。相應(yīng)的平衡常數(shù)K1=5.4x10-5，即平衡時[CO2]/[H2CO3]是340:1。

CO2水合和HCO3-脫水常常與快速過程（尤其是運輸過程）偶聯(lián)。幾乎所有生物都有碳酸脫水酶。碳酸脫水酶能夠?qū)⒎磻?yīng)速度增加到自動反應(yīng)的合理速度之上。1.血液流過肺，碳酸脫水酶將HCO3-

脫水生成CO2。相反，碳酸脫水酶能夠?qū)O2水合生成HCO3-

，產(chǎn)生眼淚或其它分泌液。2.HCO3-和CO2是不同酶促反應(yīng)的產(chǎn)物或底物。快速轉(zhuǎn)化HCO3-和CO2才能保證這些分子處于合適的濃度水平。3.這些酶促反應(yīng)非常重要(zhòngyào)。碳酸脫水酶突變會導(dǎo)致骨質(zhì)硬化（osteopetrosis）(密度過高，貧血)和精神障礙。共七十八頁碳酸脫水酶能加速CO2水合生成(shēnɡchénɡ)HCO3-?；钚宰罡叩奶妓崦撍杆螩O2的速度達到kcat=106s-1，即一個酶分子每秒能轉(zhuǎn)化100萬分子?；镜奈锢磉^程如擴散和質(zhì)子轉(zhuǎn)移達不到這么高的水合速率，因此酶促反應(yīng)必需采用特別的策略獲得如此巨大的（prodigious）速度。共七十八頁碳酸脫水酶含有催化活性必需的鋅離子在碳酸脫水酶發(fā)現(xiàn)（1932年）10年后，發(fā)現(xiàn)這個酶有鋅離子，證實酶活性必需鋅離子—發(fā)現(xiàn)的第一例含鋅離子的酶（當(dāng)時的重大發(fā)現(xiàn)）?，F(xiàn)在知道，生物體內(nèi)超過1/3的酶要么有金屬離子，要么用金屬離子作為輔助因子。金屬離子有幾個性質(zhì)增加反應(yīng)活性：帶正電荷；能形成相對強但相當(dāng)(xiāngdāng)活潑的化學(xué)鍵；有的金屬離子有多種氧化狀態(tài)。金屬離子的化學(xué)反應(yīng)性質(zhì)提供了進化過程中很多酶利用金屬離子進行催化的理由。人類基因組至少有7種碳酸脫水酶（每種酶都有自身基因）。這些碳酸脫水酶序列一致性明顯，是同源酶。共七十八頁x-射線(shèxiàn)晶體學(xué)研究提供鋅離子的詳細而又直接的信息。碳酸脫水酶II是紅細胞的主要成分，是研究得最深入（圖9.22），也是活性最高的碳酸脫水酶之一。共七十八頁催化經(jīng)過鋅離子活化水分子：鋅離子復(fù)合物有利于二氧化碳水合。pH值對酶促二氧化碳水合反應(yīng)(fǎnyìng)的影響（圖9.23）。共七十八頁在pH8，反應(yīng)速度接近最大值。pH值降低，反應(yīng)速度迅速下降。在pH7.0反應(yīng)速度降低一半，提示pH7.0失去(shīqù)一個基團(pKa=7.0)的一半，這個基團對催化反應(yīng)很重要。而且這個曲線顯示，高pH值（脫質(zhì)子）形成該基團能有效地催化。盡管有些氨基酸，如組氨酸的pKa值接近7，但是不同證據(jù)提示負責(zé)轉(zhuǎn)化的基團不是氨基酸而是鋅結(jié)合的水分子。圖9.24鋅離子結(jié)合(jiéhé)水分子的pKa值。與鋅離子結(jié)合使水分子的pKa值從15.7降低至7。共七十八頁（1）鋅離子有利于水分子釋放H+離子，產(chǎn)生氫氧根離子。（2）二氧化碳底物結(jié)合于酶活性位點，并被定位于與氫氧根反應(yīng)(fǎnyìng)的位置。（3）氫氧根攻擊二氧化碳，產(chǎn)生碳酸氫根離子（HCO3-）。（4）釋放HCO3-后，又產(chǎn)生催化活性位點結(jié)合另一個水分子。共七十八頁合成類似物有四個氮原子與鋅離子結(jié)合（碳酸脫水酶是三個配位鍵）。一個水分子與鋅離子還能形成(xíngchéng)配位鍵。直接測定顯示鋅結(jié)合水分子的pKa值是8.7，沒有碳酸脫水酶結(jié)合水分子的pKa值那么低（但比游離水分子的pKa值顯著降低）。在pH9.2，這個類似物催化二氧化碳水合速度提高100倍以上。盡管催化速度比碳酸脫水酶低很多，但是模型系統(tǒng)的實驗結(jié)果暗示鋅結(jié)合氫氧根離子的機制是正確的。碳酸脫水酶進化使之能夠利用鋅結(jié)合的氫氧根離子作為強催化劑。共七十八頁圖9.27水脫質(zhì)子的動力學(xué)。碳酸脫水酶中鋅離子結(jié)合(jiéhé)水分子的脫質(zhì)子反應(yīng)和結(jié)合(jiéhé)質(zhì)子反應(yīng)的動力學(xué)。共七十八頁圖9.28緩沖液對脫質(zhì)子(zhìzǐ)反應(yīng)的影響。緩沖液組分B協(xié)助鋅結(jié)合水分子脫質(zhì)子。共七十八頁圖9.29緩沖液濃度對碳酸脫水酶催化(cuīhuà)二氧化碳水合反應(yīng)速度的影響。隨著緩沖液1,2-二甲基苯咪唑濃度的增加，二氧化碳水合反應(yīng)速率增加。緩沖液使酶催化產(chǎn)生很高的反應(yīng)速率。共七十八頁圖9.30組氨酸質(zhì)子穿梭。（1）His64消除鋅離子結(jié)合水的質(zhì)子，產(chǎn)生(chǎnshēng)親核氫氧根離子和質(zhì)子化組氨酸；（2）緩沖液B從這個組氨酸移去質(zhì)子，再生沒有質(zhì)子化的組氨酸。共七十八頁同一進化(convergentevolution)使不同的碳酸脫水酶產(chǎn)生鋅結(jié)合位點與人碳酸脫水酶同源的碳酸脫水酶叫a-碳酸脫水酶，常見于動物、一些細菌和藻類。另有兩類碳酸脫水酶，與a-碳酸脫水酶沒有序列類似性。b-碳酸脫水酶見于高等植物和很多細菌，包括E.coli。光譜和結(jié)構(gòu)研究(yánjiū)顯示b-碳酸脫水酶的鋅離子與一個組氨酸和兩個半胱氨酸殘基結(jié)合，但是這個酶蛋白的總結(jié)構(gòu)與a-碳酸脫水酶無關(guān)。在植物中，這些酶有助于CO2積累，CO2對光合成的Calvin循環(huán)是非常關(guān)鍵的。古生菌Methanosarcinathermophila的碳酸脫水酶屬于第三類碳酸脫水酶，即g-碳酸脫水酶。晶體結(jié)構(gòu)顯示g-碳酸脫水酶鋅離子的三個結(jié)合位點與a-碳酸脫水酶非常相像。但是鋅離子的三個結(jié)合位點處于三聚體g-碳酸脫水酶三個亞基之間的界面（圖9.31）。酶蛋白分子有非常顯著的左手b-螺旋結(jié)構(gòu)（b-鏈扭曲成左手螺旋），與a-和b-碳酸脫水酶的結(jié)構(gòu)不同。因此，在進化過程中至少有三次同一進化。產(chǎn)生鋅離子配位鍵結(jié)合的碳酸脫水酶。共七十八頁圖9.31g-碳酸脫水酶。（左邊）g-碳酸脫水酶的鋅離子位點。鋅離子與三個組氨酸和一個水分子結(jié)合。（中間）這個蛋白的三聚體結(jié)構(gòu)。三個亞基分別是A，B，和C。每條鏈主要是左手b-螺旋。（右邊(yòubian)）從頂部觀察這個三聚體，顯示該蛋白呈三重對稱。鋅離子位置由綠色表示，處于亞基界面之間。共七十八頁圖9.32用修飾保護DNA。EcoRV的識別序列（左邊），和免受這個限制酶斷裂(duànliè)DNA的甲基化位點（右邊）。限制性核酸(hésuān)內(nèi)切酶：共七十八頁圖9.33磷酸二酯鍵水解。所有限制性核酸內(nèi)切酶催化DNA磷酸二酯鍵水解的產(chǎn)物是磷酸處于(chǔyú)5’-端。斷裂化學(xué)鍵用紅色標出。共七十八頁機制(jīzhì)一（共價中間體，產(chǎn)物構(gòu)型與底物相同）共七十八頁機制二（直接(zhíjiē)水解），構(gòu)型轉(zhuǎn)換共七十八頁用兩種親核試劑攻擊磷所形成的產(chǎn)物(chǎnwù)支持流水線替代正確。共七十八頁硫代磷酸的EcoRV底物（圖9.34）。然后用富含18O標記(biāojì)水分子水解。18O相應(yīng)于磷原子的位置確定磷原子的構(gòu)型是維持還是轉(zhuǎn)換。結(jié)果顯示，磷原子構(gòu)型轉(zhuǎn)換了一次，證明水分子直接攻擊導(dǎo)致磷酸二酯鍵斷裂。酶促反應(yīng)過程沒有共價中間體這一步。共七十八頁圖9.35DNA裂解(lièjiě)得立體化學(xué)。EcoRV酶促反應(yīng)斷裂磷酸二酯鍵導(dǎo)致磷原子構(gòu)型完全翻轉(zhuǎn)（此時磷原子與一個硫原子，一個18O原子，一個16O原子，和一個與核苷酸連接的16O原子結(jié)合）。這一結(jié)果強烈提示限制性內(nèi)切酶促反應(yīng)是水分子直接攻擊磷原子。共七十八頁在Mg2+或類似的二價陽離子存在的情況下，將酶蛋白與底物分子結(jié)晶能夠直接觀察酶蛋白與底物之間的復(fù)合物是不可能的。因為酶蛋白能夠裂解底物。但是，可以通過幾種途徑觀察酶蛋白與金屬離子形成的復(fù)合物。一條途徑是沒有Mg2+或類似的二價陽離子時，將酶蛋白與識別(shíbié)序列（即配體）混合后結(jié)晶。由于缺乏金屬離子，能夠長出相應(yīng)得晶體。然后將相應(yīng)得蛋白質(zhì)晶體置于含有金屬離子的溶液中浸泡。另一種方案是用活性很低的突變酶與相應(yīng)的底物、金屬離子一道結(jié)晶。最后用Ca2+替代Mg2+，將酶蛋白、底物和金屬離子一道結(jié)晶（Ca2+作為輔助因子，酶蛋白的催化活性很弱）。所有這些操作都是使酶促反應(yīng)不發(fā)生，從而能夠確定金屬離子的位置。由于每個活性位點有三個金屬離子。多個金屬離子在活性位點的具體作用仍在研究中。一個金屬離子結(jié)合位點在所有結(jié)構(gòu)（指前面不同方法所獲得的結(jié)構(gòu)）都出現(xiàn)。這個金屬離子與蛋白質(zhì)兩個天冬氨酸和接近核酸斷裂位點的一個磷氧基團形成配位鍵。該金屬離子協(xié)助水分子定位，并活化水分子（類似碳酸脫水酶的Zn2+活化水分子），結(jié)合的水分子攻擊磷原子（圖9.36）。共七十八頁圖9.36EcoRV核酸(hésuān)內(nèi)切酶的一個Mg2+結(jié)合位點。鎂離子活化水分子，協(xié)助水分子定位，使之能夠攻擊磷原子。已經(jīng)(yǐjing)斷裂共七十八頁圖9.37EcoRV識別序列(xùliè)的結(jié)構(gòu)。（A）識別序列是圍繞軸（綠色）的旋轉(zhuǎn)對稱序列。（B）EcoRV識別序列的倒置重復(fù)具有二重旋轉(zhuǎn)對稱。共七十八頁限制性核酸內(nèi)切酶也有相應(yīng)的對稱結(jié)構(gòu)(jiégòu)：二聚體酶的兩個亞基也是二重旋轉(zhuǎn)對稱結(jié)構(gòu)(jiégòu)。酶與識別序列結(jié)構(gòu)(jiégòu)匹配有助于酶對DNA配體（即底物）的識別。蛋白質(zhì)與帶有識別序列的DNA分子形成的復(fù)合物結(jié)構(gòu)證實酶與底物分子結(jié)構(gòu)相似（圖9.38）。酶緊緊地擁抱DNAs。共七十八頁圖9.39EcoRV擁抱DNA底物分子(fēnzǐ)之間形成的氫鍵。右邊EcoRV分子的一個DNA結(jié)合環(huán)（綠色）與配體DNA分子之間的結(jié)合。圖B顯示與CG堿基對形成氫鍵的EcoRV酶蛋白分子的氨基酸殘基，圖C顯示與TA堿基對形成氫鍵的EcoRV酶蛋白分子的氨基酸殘基共七十八頁圖9.40識別位點的扭曲。DNA用球-棒模型表示。DNA雙螺旋軸用紅線表示(biǎoshì)。與酶結(jié)合發(fā)生明顯扭曲。B型DNA雙螺旋軸是直的(沒有繪出)。共七十八頁圖9.41EcoRV與配體及非配體DNA分子的結(jié)合。非配體DNA(橘色)和配體DNA(紅色)與EcoRV酶蛋白分子的結(jié)合。注意非配體DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合因距離太遠，無法(wúfǎ)構(gòu)建完整的Mg2+結(jié)合位點。共七十八頁圖9.42與非配體DNA相比，配體DNA與EcoRV的結(jié)合能高。配體DNA與EcoRV分子結(jié)合多余的結(jié)合能（與非配體DNA-EcoRV復(fù)合物相比）用于DNA扭曲，從而構(gòu)建(ɡòujiàn)出完整的催化活性位點。共七十八頁甲基化，無法(wúfǎ)扭曲。圖9.43腺嘌呤甲基化。腺嘌呤甲基化阻止EcoRV與配體DNA之間形成氫鍵(qīnɡjiàn)，因此阻止了DNA的酶促斷裂。共七十八頁基因水平轉(zhuǎn)移(zhuǎnyí)證據(jù)：進化關(guān)系疏遠的生物，限制酶序列一致性高。遺傳密碼與宿主很不相同。圖9.44II類限制性內(nèi)切酶的保守核心結(jié)構(gòu)。用顏色重點(zhòngdiǎn)標出每個酶蛋白二聚體的單一亞基含有形成活性位點區(qū)域（藍色）的四個保守結(jié)構(gòu)元件。共七十八頁核苷單磷酸激酶催化磷酸基團轉(zhuǎn)移核苷單磷酸激酶（NMPkinase）用腺苷酸激酶作為代表。這些酶催化核苷三磷酸（NTP，通常是ATP）末端的磷酸基團轉(zhuǎn)移給核苷單磷酸(NMP)的磷酸（圖9.45）。NMP激酶的主要挑戰(zhàn)是將NTP的磷酸轉(zhuǎn)移給NMP，但不促進磷酸轉(zhuǎn)移給水分子（即NTP水解反應(yīng)）。利用誘導(dǎo)匹配(pǐpèi)來解決這個問題。而且，金屬離子在這個過程中起關(guān)鍵作用。但是，金屬離子與底物而不是與酶蛋白形成復(fù)合物。共七十八頁圖9.45核苷單磷酸激酶轉(zhuǎn)移(zhuǎnyí)磷酸基團。這些酶催化磷酸轉(zhuǎn)移反應(yīng)將核苷三磷酸（此處是ATP）和核苷單磷酸（NMP）轉(zhuǎn)化成兩個核苷二磷酸。共七十八頁圖9.46腺苷酸激酶和