DB36T 1799-2023 茶樹菇菌種鑒定技術(shù)規(guī)程

ICS65.020.20CCSB30DB36TechnicalregulationsofidentificationforCyclocybeaegeritaspawn江西省市場監(jiān)督管理局發(fā)布IDB36/T1799—2023前言 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語和定義 14試劑和儀器 25鑒定方法 2附錄A（規(guī)范性）培養(yǎng)基制備 7附錄B（規(guī)范性）試劑及其制備 8附錄C（資料性）儀器 附錄D（規(guī)范性）拮抗反應(yīng)類型 附錄E（資料性）試驗(yàn)用引物參照 DB36/T1799—2023本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由江西省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并歸口。本文件起草單位：江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)應(yīng)用微生物研究所、江西省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心。本文件主要起草人：王洪秀、魏云輝、龔正、胡佳、馮艷、孫鵬、陳緒濤、袁夢涵。1DB36/T1799—2023茶樹菇菌種鑒定技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了茶樹菇菌種鑒定的過程，包括試劑和儀器、樣品制備、試驗(yàn)步驟、試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理等內(nèi)本文件適用于江西省茶樹菇菌種鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。NY/T1097食用菌菌種真實(shí)性鑒定酯酶同工酶電泳法NY/T1730食用菌菌種真實(shí)性鑒定ISSR法NY/T1845食用菌菌種區(qū)別性鑒定拮抗反應(yīng)3術(shù)語和定義NY/T1845、NY/T1097和NY/T1730界定的以及下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1茶樹菇Cyclocybeaegerita茶樹菇Cyclocybeaegerita隸屬于真菌界FungiKingdom、擔(dān)子菌門Basidiomycota、傘菌綱Agaricomycetes、傘菌亞綱Agaricomycetidae、傘菌目Agaricales、假臍菇科Tubariaceae、環(huán)傘屬Cyclocybe，分布于我國江西、福建、云南、浙江及四川等地。因其生長宿主的多樣性及形態(tài)上的細(xì)微差別，又被稱為楊樹菇、柳松茸、柳環(huán)菌。生產(chǎn)上有褐色和白色兩個(gè)品種。褐色品種特征：子實(shí)體單生或叢生。菌蓋表面平滑，呈淺土黃色至暗紅褐色；菌褶污黃褐色；菌柄較長，脆嫩，纖維質(zhì)，表面有纖維狀條紋，近白色；內(nèi)菌幕膜質(zhì)，開傘后菌環(huán)留在菌柄上部或沾附于菌蓋邊緣或自動脫落。白色品種特征：除菌蓋、菌柄和菌褶呈白色外，其他形態(tài)特征基本同褐色品種，此品種又稱雪蓮菇。3.2菌種區(qū)別性distinctnessofspawn供檢菌種和對照菌種的不符合性。3.3隆起型ridgy對峙培養(yǎng)的茶樹菇菌株間拮抗表現(xiàn)特征之一，表現(xiàn)為兩菌株菌落交界處菌絲隆起。2DB36/T1799—2023[NY/T1845，定義3.2]3.4溝壑型chimb對峙培養(yǎng)的茶樹菇菌株間拮抗表現(xiàn)特征之一，表現(xiàn)為兩菌株菌絲在交界處分別密集或稍微隆起，兩隆起之間出現(xiàn)一條溝壑狀分隔線。3.5色線型colorbar對峙培養(yǎng)的茶樹菇菌株間拮抗表現(xiàn)特征之一，表現(xiàn)為兩菌株菌落交界處形成一條色素分界線。3.6隔離型dividingline對峙培養(yǎng)的茶樹菇菌株間拮抗表現(xiàn)特征之一，表現(xiàn)為兩菌株菌落交界出現(xiàn)一條無菌絲的帶狀分隔3.7菌種真實(shí)性genuinenessofspawn供檢菌種和對照菌種的符合性。3.8對峙培養(yǎng)法face-offculture兩個(gè)不同的菌株對峙培養(yǎng)時(shí)發(fā)生拮抗反應(yīng)，是茶樹菇菌株識別異己保持群體遺傳多樣性的反應(yīng)，它是由基因組內(nèi)異核體不親和位點(diǎn)控制的。當(dāng)不親和的兩個(gè)菌株對峙培養(yǎng)時(shí)，在菌株交界處形成隆起、溝壑、色線或隔離，產(chǎn)生拮抗，防止遺傳上明顯不同的個(gè)體間菌絲融合，以保持個(gè)體遺傳上的獨(dú)立和穩(wěn)定。3.9酯酶同工酶法esteraseisoenzymemethod在生物中，酶的表達(dá)受遺傳基因的調(diào)控。酯酶是多等位基因調(diào)控的酶類，從食用菌菌絲體中提取的粗酶液經(jīng)電泳后，進(jìn)行酯酶的生物化學(xué)染色，不同的酯酶組分顯示在凝膠的不同位置而形成酯酶同工酶酶譜。相同的菌種遺傳背景相同，其酯酶同工酶酶譜也相同。因此可以用酯酶同工酶酶譜對茶樹菇菌種的真實(shí)性進(jìn)行鑒定。3.10ISSR法intersimplesequencerepeattechnique以錨定微衛(wèi)星DNA為引物，對基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到與錨定引物互補(bǔ)的重復(fù)序列的區(qū)間DNA片段。不同物種基因組DNA中的這種反相重復(fù)的微衛(wèi)星序列的數(shù)目和間隔的長短不同，就可導(dǎo)致這些特定結(jié)合位點(diǎn)分布發(fā)生相應(yīng)的變化，從而使PCR產(chǎn)物增加、減少或發(fā)生分子量的改變。通過對PCR產(chǎn)物的檢測和比較，即可識別茶樹菇菌種基因組DNA的多態(tài)片段，從而鑒定菌種的真實(shí)性。3DB36/T1799—20234試劑和儀器培養(yǎng)基制備及試劑要求按照附錄A和附錄B執(zhí)行，儀器按照附錄C準(zhǔn)備。5鑒定方法5.1對峙培養(yǎng)法5.1.1菌絲體培養(yǎng)供檢茶樹菇菌株與對照菌株在相同條件下培養(yǎng)，將固體菌種從試管斜面接種到直徑90mm固體PDA平板上，25℃避光培養(yǎng)15d。5.1.2接種組合與重復(fù)次數(shù)茶樹菇供檢菌株與對照菌株的拮抗反應(yīng)接種組合為3組，每組重復(fù)3次。第一組：供檢菌株與對照菌株對峙培養(yǎng)；第二組：供檢菌株與供檢菌株對峙培養(yǎng)；第三組：對照菌株與對照菌株對峙培養(yǎng)。5.1.3接種操作嚴(yán)格按無菌操作，用單孔直徑5mm打孔器分別打取活化后適齡的茶樹菇供檢菌株與對照菌株菌落邊緣做接種塊，菌絲朝上，兩接種塊間隔30mm，置于平板中心位置。5.1.4培養(yǎng)條件在通風(fēng)、避光、溫度為25℃條件下培養(yǎng)至接種塊菌絲接觸，需20d～25d。5.1.5判定規(guī)則在自然光下，觀察對峙培養(yǎng)的兩株菌落交界處菌絲，有隆起型、溝壑型、色線型、隔離型四者之一的拮抗反應(yīng)，判定為不同菌株，見附錄D。5.2酯酶同工酶法5.2.1液體培養(yǎng)直接將接種塊接入三角瓶液體培養(yǎng)基中，25℃,180rpm振蕩避光培養(yǎng)20d。培養(yǎng)基的制備參見附錄A.2。5.2.2酯酶同工酶樣品制備5.2.2.1將振蕩培養(yǎng)的茶樹菇菌絲球過濾除去水分，獲得供檢茶樹菇供試菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株的菌絲體各3份。稱取菌絲體0.5g于1.5mL離心管中，放入冷凍干燥機(jī)中低溫冷凍干燥24h。5.2.2.2向每個(gè)裝樣品的離心管中加入小鋼珠并將離心管放入組織研磨儀中，60Hz下研磨30s成細(xì)粉末，加入0.5mL樣品提取液（附錄B.1）。5.2.2.3將研磨后的樣品在4℃下12000rpm，離心10min，取其上清液，將上清液和上樣緩沖液按10:1比例混勻，混合液即為電泳樣品。5.2.3凝膠制備4DB36/T1799—20235.2.3.1分離膠分離膠濃度7.5%，按照分離膠緩沖液（附錄B.3）:分離膠母液（附錄B.5）:雙蒸水:過硫酸銨（附錄B.2）=2:5:1:8的比例配制，再加入膠溶液體積0.1%的TEMED，充分混勻。將分離膠灌入膠室至距短玻璃板上沿2.2cm～2.5cm，加入適量的水封住膠面，待凝膠聚合后將水吸出。5.2.3.2濃縮膠濃縮膠濃度3%，按照濃縮膠緩沖液（附錄B.4）:濃縮膠母液（附錄B.6）:雙蒸水:過硫酸銨（附錄B.2）=1:2:1:4比例混合，再加入膠溶液體積0.1%的TEMED，充分混勻，灌入膠室，立即插入樣品梳，待凝膠。5.2.4點(diǎn)樣濃縮膠聚合后，小心抽出樣品梳，用微量進(jìn)樣器吸去點(diǎn)樣孔中多余的水分后，注入電極緩沖液（附錄B.7上槽電極緩沖液面要高于短玻璃板，下槽電極緩沖液面要高于鉑金絲；用微量進(jìn)樣器吸取15μL～20μL樣品加入點(diǎn)樣孔。5.2.5電泳將電泳槽放入冰箱內(nèi)進(jìn)行低溫電泳，采用穩(wěn)壓電泳，電壓為130V，待指示劑進(jìn)入分離膠后，電壓升至260V。待前沿指示劑距膠底部約1cm～1.5cm，停止電泳。5.2.6取膠染色倒出電極緩沖液，在水中啟開玻璃板，取出凝膠片，浸入染色液（附錄B.9）中，37℃染色15min~20min，用水沖洗干凈后置乙酸溶液（附錄B.10）中固定。5.2.7遷移率Rf值計(jì)算應(yīng)按照NY/T1097的規(guī)定執(zhí)行。5.2.8判定規(guī)則將凝膠片置于觀片燈上拍照存圖。對比供檢菌株和對照菌株酶帶數(shù)量與遷移率的大小，若酶帶數(shù)量或遷移率不同，用相關(guān)軟件分析遺傳相似系數(shù)，相似系數(shù)小于1，則供檢菌株與對照菌株為不同菌株，當(dāng)相似系數(shù)等于1則須結(jié)合其他鑒定方法判斷。5.3.1DNA模板的制備5.3.1.1菌絲培養(yǎng)量以可做3次平行試驗(yàn)為準(zhǔn)，固體方法培養(yǎng)的菌絲，稱取0.2g菌絲，液體培養(yǎng)的菌絲，無菌水沖洗3次，用濾紙吸干水分備用，稱取菌絲0.5g于1.5mL離心管中，放入冷凍干燥機(jī)中低溫冷凍干燥24h。5.3.1.2向每個(gè)裝樣品的離心管中加入小鋼珠并將離心管放入組織研磨儀中，60Hz下研磨30s成細(xì)粉末，加入650μL65℃預(yù)熱的CTAB（附錄B.13）提取緩沖液?；靹蚝笾糜?5℃水浴40min～60min，不時(shí)輕輕地?fù)u動混勻。5.3.1.312000rpm離心10min，將上清液轉(zhuǎn)移至已滅菌的1.5mL離心管中，棄沉淀。5DB36/T1799—20235.3.1.4加入等體積的酚-氯仿-異戊醇（附錄B.16），輕輕混勻，4℃,12000rpm離心15min；將上清液轉(zhuǎn)移至已滅菌的1.5mL離心管中，棄下層有機(jī)相。5.3.1.5加入等體積的氯仿-異戊醇（附錄B.15），輕輕混勻，4℃,12000rpm離心15min，將上清液轉(zhuǎn)移至已滅菌的1.5mL離心管中，棄下層有機(jī)相。5.3.1.6加入2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，輕輕混勻，靜置沉淀60min，10000rpm離心10min，棄上清液。5.3.1.7加入預(yù)冷的70%乙醇（附錄B.17）洗滌沉淀2次，晾干使乙醇充分揮發(fā)，剩余無色透明狀物質(zhì)即為茶樹菇基因組DNA。5.3.1.8用100μL的TE緩沖液（附錄B.18）充分溶解DNA，加入2μLRNAase，37℃恒溫靜置8h~5.3.1.9取出上述靜置的DNA溶液，用TE緩沖液（附錄B.18）補(bǔ)足至300μL，加入5MNaCl（附錄B.19）50μL，CTAB純化緩沖液（附錄B.14）40μL，65℃水浴10min。5.3.1.10重復(fù)3.6.2.4、3.6.2.5、3.6.2.6步驟，獲得茶樹菇基因組DNA，-20℃分裝保存?zhèn)溆?。不宜反?fù)凍融使用。5.3.2DNA質(zhì)量的檢測5.3.2.1凝膠電泳檢測5.3.2.1.1凝膠成像取5μL上述溶液與1μL加樣緩沖液混勻，在0.8%瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像儀上或紫外透射儀上成像。5.3.2.1.2篩選判定與DNA分子量標(biāo)記比較，觀察所提取的基因組DNA質(zhì)量及片段大小，按下列標(biāo)準(zhǔn)判定：a)在點(diǎn)樣孔附近呈現(xiàn)一條致密亮帶，表明是質(zhì)量好、分子量大且無降解的DNA樣品，可用于鑒b)呈現(xiàn)連續(xù)分布狀態(tài)，表明是部分降解的DNA樣品，不建議用于鑒定；c)觀察不到大片段，表明是嚴(yán)重降解的DNA樣品，不可用于鑒定。5.3.2.2基因組A260/A280的OD值檢測無菌水清洗微量核酸檢測儀的點(diǎn)樣孔三次，并校正對照數(shù)值為零。將DNA適當(dāng)稀釋，取1μLDNA樣品滴在微量核酸檢測儀的點(diǎn)樣孔，重復(fù)三次讀取A260/A280的OD值，以一個(gè)OD260值相當(dāng)于50μg/mLDNA濃度來計(jì)算純化的DNA濃度。要求DNA溶液OD260/OD280在1.7～2.0之間。依據(jù)測得的質(zhì)量濃度將DNA溶液稀釋到25ng/μL～50ng/μL，-20℃保存。5.3.3ISSR擴(kuò)增5.3.3.1引物引物見附錄E。如果必要可以篩選新的引物。5.3.3.2反應(yīng)體系6DB36/T1799—2023PCR反應(yīng)的總體積為20μL，含有2×PCRPremix10μL、Primer10μmol8μL。按上述比例將反應(yīng)液依次加入0.2mL離心管中，混勻，放入PCR儀中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。設(shè)置PCR空白對照。5.3.3.3反應(yīng)條件PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行以下循環(huán)：94℃預(yù)變性3min，然后94℃變性30s，55℃退火45s，72℃延伸2min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min，4℃保存。5.3.4瓊脂糖凝膠電泳檢測5.3.4.1將適量的瓊脂糖加入1×TAE緩沖液（附錄B.21）中，加熱溶解，配制成瓊脂糖濃度為1.8%的溶液，待冷卻至50℃~60℃,加入核酸染料，混勻，將其倒入制膠模具，室溫下凝固后，放入裝有適量1×TAE緩沖液（附錄B.21）的電泳槽中。5.3.4.2取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物點(diǎn)樣，分別在膠的兩側(cè)泳道和中間的一個(gè)泳道中加入DNA分子量標(biāo)記，接通電源進(jìn)行電泳。以5V/cm電壓電泳，待指示劑距凝膠前緣1cm左右停止電泳。5.3.5數(shù)據(jù)記錄電泳結(jié)束后，將瓊脂糖凝膠置于凝膠成像儀上成像。根據(jù)DNA分子量標(biāo)記判斷擴(kuò)增出的目的條帶的大小，將電泳結(jié)果形成電子文件存檔或用照相系統(tǒng)拍照。5.3.6PCR擴(kuò)增產(chǎn)物質(zhì)量判斷觀察空白對照的凝膠成像照片，按下列結(jié)果判斷：a)空白對照為陰性，并且3個(gè)平行試驗(yàn)結(jié)果一致，則本次試驗(yàn)結(jié)果可以使用；b)在陰性提取對照或PCR空白對照中擴(kuò)增出了片段，則說明檢測過程中發(fā)生了污染，需查找原因重新檢測。5.3.7判定規(guī)則將供檢茶樹菇菌株P(guān)CR擴(kuò)增的條帶與對照菌株比較，若有顯著差別，遺傳相似系數(shù)小于1，可判定供檢菌種與對照菌種為不同菌種；若供檢菌種與對照菌種的PCR產(chǎn)物一致，再增加引物個(gè)數(shù)，進(jìn)行檢測驗(yàn)證。必要時(shí)可以增加其他方法佐證。7DB36/T1799—2023（規(guī)范性）培養(yǎng)基制備A.1固體培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200g（用浸出汁），葡萄糖20g，瓊脂20g，去離子水或相當(dāng)純度的水1000mL，pH自然。A.2液體培養(yǎng)基（PDB）：200g新鮮馬鈴薯，20g葡萄糖，加去離子水或相當(dāng)純度的水補(bǔ)齊至1000mL，pH自然。100mL三角瓶裝50mL左右。8DB36/T1799—2023（規(guī)范性）試劑及其制備除非另有說明，在分析中僅使用分析純試劑和去離子水或相當(dāng)純度的水。B.1樣品提取液（pH7.5）稱取6.02g磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）、0.50g磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）溶于水中，定容至100mL。B.2過硫酸銨(1.4g/L)稱取0.14g過硫酸銨溶于水中，定容至100mL，現(xiàn)用現(xiàn)配。B.3分離膠緩沖液（pH8.9）稱取36.3g三羥甲基氨基甲烷（C4H11NO3，Tris），用48mL1mol/LHCL溶解，TEMED0.23mL，定容至100mL，4℃貯存。B.4濃縮膠緩沖液（pH6.7）稱取5.98g三羥甲基氨基甲烷（C4H11NO3，Tris），用48mL1mol/LHCL溶解，TEMED0.46mL，定容至100mL，4℃貯存。B.5分離膠母液稱取28.0g丙烯酰胺（C3H5NO，Arc）、0.735g甲叉雙丙烯酰胺（C7H10N2O2，Bis），溶于水中，定容至100mL，用棕色瓶4℃貯存。B.6濃縮膠母液稱取10.0g丙烯酰胺（C3H5NO，Arc）、2.0g甲叉雙丙烯酰胺（C7H10N2O2，Bis）溶于水中，定容至100mL，用棕色瓶4℃貯存。B.7酯酶同工酶電極緩沖液稱取6.0g三羥甲基氨基甲烷（C4H11NO3，Tris）、28.8g甘氨酸（C2H5NO2）溶于水中，定容至1L，使用時(shí)稀釋10倍，使用液pH8.3。B.8磷酸緩沖液9DB36/T1799—2023稱取22.6g磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）、21.4g磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）溶于水中，定容B.9酯酶同工酶染色液稱取0.1g乙酸-1-萘酯、0.1g乙酸-2-萘酯、0.2g固蘭RR鹽，用10mL丙酮溶解，再加入磷酸緩沖液300mL，過濾，現(xiàn)用現(xiàn)配。B.10乙酸溶液70mL/L。量取14mL乙酸，加到適量水中，并稀釋至200mL。B.111mol/LTris-HCl(pH8.0)12.11g三羥甲基氨基甲烷（C4H11NO3，Tris）溶解于80mL去離子水中，冷卻至室溫后用濃鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH至8.0，加水定容至100mL，高壓滅菌。B.120.5mol/L乙二胺四乙酸二鈉鹽(EDTA-2Na)溶液(pH8.0)稱取37.22g二水乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na·2H2O）溶解于160mL去離子水中，磁力攪拌，用NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH至8.0，然后定容至200mL，高壓滅菌。B.132%CTAB提取緩沖液稱取16.364g氯化鈉溶解于70mL去離子水中，加入4g溴代十六烷基三甲胺（CTAB），完全溶解，再加入20mL1mol/LTris-HCl(pH8.0)、8mL0.5mol/LEDTA(pH8.0)，用水定容至100mL，高壓滅菌。使用前加入體積分?jǐn)?shù)為0.1%的β-巰基乙醇。B.14CTAB純化緩沖液稱取4.1gNaCl溶于80ml去離子水中，慢慢加入10gCTAB，55℃加熱溶解，定容至100ml。B.15氯仿-異戊醇（24:1）氯仿和異戊醇以24:1的體積比進(jìn)行配制，置于4℃冰箱中保存。B.16酚-氯仿-異戊醇（25:24:1）三者按25:24:1的體積比進(jìn)行配制，4℃保存。B.1770%乙醇溶液量取70mL無水乙醇，加水定容至100mL。DB36/T1