高效液相色譜課件

172高效液相色譜17高效液相色譜172高效液相色譜主要內(nèi)容§1概述§2高效液相色譜儀§3高效液相色譜法的類型§4應(yīng)用172高效液相色譜§1概述一、HPLC與經(jīng)典LC的比較

高速

HPLC只需數(shù)分鐘;而經(jīng)典LC完成一次分析需時(shí)數(shù)小時(shí)。

高效

HPLC柱效很高;可以在數(shù)分鐘內(nèi)完成數(shù)百種物質(zhì)的分離。靈敏度高檢測器靈敏度極高：UV—10-9g,熒光檢測器—10-11g。172高效液相色譜§1概述二、HPLC與GC的比較分析對(duì)象及范圍：

GC分析只限于氣體和低沸點(diǎn)的穩(wěn)定化合物，占有機(jī)物總數(shù)的20%；

HPLC可以分析高沸點(diǎn)、高分子量的穩(wěn)定或不穩(wěn)定化合物，這類物質(zhì)占有機(jī)物總數(shù)的80%。172高效液相色譜§1概述二、HPLC與GC的比較流動(dòng)相的選擇：

GC采用的流動(dòng)相中為有限的幾種“惰性”氣體，對(duì)組分作用??；

HPLC采用的流動(dòng)相為液體或各種液體的混合，可與組分作用，并與固定相對(duì)組分的作用產(chǎn)生競爭，可通過溶劑來控制和改進(jìn)分離。172高效液相色譜§1概述二、HPLC與GC的比較操作溫度：

GC需高溫；HPLC通常在室溫下進(jìn)行。

172高效液相色譜§2高效液相色譜儀

儀器結(jié)構(gòu)示意見下圖，分為4個(gè)主要部分：高壓輸液系統(tǒng)，進(jìn)樣系統(tǒng)，分離系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)。此外還配有輔助裝置：如梯度淋洗，自動(dòng)進(jìn)樣及數(shù)據(jù)處理等。172高效液相色譜§2§2高效液相色譜儀172高效液相色譜§2高效液相色譜儀一、高壓輸液系統(tǒng)它是高效液相色譜儀最重要的部件，一般由儲(chǔ)液罐、高壓輸液泵、過濾器、壓力脈動(dòng)阻力器等組成，其中高壓輸液泵是核心部件?！?172高效液相色譜§2高效液相色譜儀一、高壓輸液系統(tǒng)1、貯液罐2、高壓泵3、梯度洗脫裝置§2172高效液相色譜§2高效液相色譜儀1、貯液罐貯液罐為不銹鋼、玻璃或氟塑料制成的容器，容量為0.5~2L，用來貯存足夠數(shù)量、符合要求的流動(dòng)相。溶劑使用前，必須先脫氣。脫氣方法：低壓脫氣、超聲脫氣、吹氦氣脫氣等。§2172高效液相色譜§2高效液相色譜儀2、高壓泵高壓輸液泵是高效液相色譜儀中關(guān)鍵部件之一，是流動(dòng)相的動(dòng)力源。要求：流量穩(wěn)定、輸出壓力高、流量范圍寬、耐酸堿和緩沖液的腐蝕、壓力變動(dòng)小、空間小、易于清洗和更換溶劑、具有梯度洗脫功能?！?172高效液相色譜§2高效液相色譜儀2、高壓泵類型：恒壓泵、恒流泵兩大類，多使用恒流泵。往復(fù)柱塞泵是目前使用最廣泛的一種恒流泵；由偏心輪帶動(dòng)活塞往復(fù)移動(dòng)，恒流輸出，并通過改變電機(jī)轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)流量?！?172高效液相色譜§2高效液相色譜儀§2播放172高效液相色譜§2高效液相色譜儀3、梯度洗脫裝置梯度洗脫就是在分離過程中使兩種或兩種以上不同極性的溶劑按一定程序連續(xù)改變它們之間的比例，從而使流動(dòng)相的強(qiáng)度、極性、pH值或離子強(qiáng)度相應(yīng)地變化，達(dá)到提高分離效果，縮短分析時(shí)間的目的。§2172高效液相色譜§2高效液相色譜儀3、梯度洗脫裝置

1）低壓梯度（外梯度）裝置，流動(dòng)相在常溫常壓下混合，用高壓泵壓至柱系統(tǒng)，僅需一臺(tái)泵即可。

2）高壓梯度（內(nèi)梯度）裝置，先將兩種溶劑分別用泵增壓后，再由泵按程序壓入混合室，混合，再注入色譜柱。§2172高效液相色譜§2高效液相色譜儀二、進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)包括進(jìn)樣口、注射器和進(jìn)樣閥等，它的作用是把分析試樣有效地送入色譜柱上進(jìn)行分離。要求：重復(fù)性好、死體積小、保證柱中心進(jìn)樣、流量波動(dòng)小、便于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化§2172高效液相色譜§2高效液相色譜儀1、進(jìn)樣器進(jìn)樣

優(yōu)點(diǎn)：可柱頭進(jìn)樣，減小死體積，充分發(fā)揮柱的效能，簡單便宜。缺點(diǎn)：是高壓進(jìn)樣時(shí)漏液．會(huì)產(chǎn)生誤差，隔墊使用次數(shù)有限，進(jìn)樣量小，重復(fù)性差?！?172高效液相色譜§2高效液相色譜儀2、六通閥進(jìn)樣目前，廣泛采用六通進(jìn)樣閥，它可以承受很高的壓力，由于進(jìn)樣量是由進(jìn)樣定量管決定的，因此，可以獲得好的重復(fù)性，更換不同體積的進(jìn)樣定量管，可調(diào)整進(jìn)樣量?！?172高效液相色譜§2高效液相色譜儀§2172高效液相色譜§2高效液相色譜儀三、色譜分離系統(tǒng)色譜柱包括柱管和固定相兩部分

固定相的要求：柱效高、選擇性好、分析速率快粒度一般為2，5，7，10μm，理論塔板數(shù)每米16萬~5萬§2172高效液相色譜§2高效液相色譜儀四、檢測系統(tǒng)在液相色譜中，有兩種基本類型的檢測器。一類是通用型檢測器，它僅對(duì)被分離組分的物理或化學(xué)特性有響應(yīng)。另一類是選擇性檢測器，它對(duì)試樣和洗脫液總的物理或化學(xué)性質(zhì)有響應(yīng)?！?172高效液相色譜§2高效液相色譜儀1）紫外檢測器：應(yīng)用最廣，對(duì)大部分有機(jī)化合物有響應(yīng)。特點(diǎn)：靈敏度高；線形范圍高；流通池可做的很?。?mm×10mm，容積8μL）；對(duì)流動(dòng)相的流速和溫度變化不敏感；波長可選，易于操作；可用于梯度洗脫?！?172高效液相色譜§2高效液相色譜儀§2172高效液相色譜§2§2高效液相色譜儀2）二極管陣列檢測器172高效液相色譜§2高效液相色譜儀§2172高效液相色譜§2高效液相色譜儀3）熒光檢測器靈敏度高，選擇性好，可用于梯度洗脫。§2172高效液相色譜§2高效液相色譜儀4）電化學(xué)檢測器電導(dǎo)檢測器安培檢測器§2172高效液相色譜§3高效液相色譜法的類型一、HPLC的固定相和流動(dòng)相二、液固吸附色譜法三、液液分配色譜四、化學(xué)鍵合相色譜法五、離子交換色譜六、凝膠色譜法172高效液相色譜§3§3高效液相色譜法的類型一、HPLC的固定相和流動(dòng)相1.固定相高效液相色譜固定相以承受高壓能力來分類，可分為：剛性固體和硬膠固定相按孔隙深度分類可分為：表面多孔型和全多孔型固定相172高效液相色譜§3§3高效液相色譜法的類型一、HPLC的固定相和流動(dòng)相1.固定相剛性固體以二氧化硅為基質(zhì)，可承受7.0

108～1.0

109Pa的高壓，可制成直徑、形狀、孔隙度不同的顆粒。是目前最廣泛使用的一種固定相。172高效液相色譜§3高效液相色譜法的類型一、HPLC的固定相和流動(dòng)相1.固定相

硬膠主要用于離子交換和尺寸排阻色譜中，它由聚苯乙烯與二乙烯苯基交聯(lián)而成?？沙惺軌毫ι舷逓?.5

108Pa?！?172高效液相色譜§3高效液相色譜法的類型

表面多孔型擔(dān)體的基體是實(shí)心玻璃球，在玻璃球外面覆蓋一層多孔活性材料，如硅膠、氧化硅、離子交換劑、分子篩、聚酰胺等。其多孔層厚度小、孔淺，相對(duì)死體積小，出峰迅速、柱效亦高；顆粒較大，滲透性好，裝柱容易，梯度淋洗時(shí)能迅速達(dá)到平衡，較適合做常規(guī)分析?！?172高效液相色譜§3高效液相色譜法的類型全多孔型固定相由直徑為10μm的硅膠微粒凝聚而成。由于顆粒很細(xì)（5～10

m），孔仍然較淺，傳質(zhì)速率快，易實(shí)現(xiàn)高效、高速。特別適合復(fù)雜混合物分離及痕量分析?！?172高效液相色譜§3高效液相色譜法的類型一、HPLC的固定相和流動(dòng)相2.流動(dòng)相要求是：1）不與固定相發(fā)生不可逆化學(xué)反應(yīng)2）對(duì)待測樣品有足夠的溶解度3）與所用檢測器匹配4）粘度盡可能的小5）純度高§3172高效液相色譜§3高效液相色譜法的類型二、液固吸附色譜法1、原理2、固定相3、流動(dòng)相

§3172高效液相色譜§3高效液相色譜法的類型二、液固吸附色譜法1、原理溶質(zhì)分子和流動(dòng)相分子在具有表面活性的吸附中心上進(jìn)行競爭，這種作用還存在于不同溶質(zhì)分子間，以及同一溶質(zhì)分子中不同官能團(tuán)之間。由于這些競爭作用，形成了不同溶質(zhì)在吸附劑表面的吸附、解吸平衡，這就是液固色譜法的選擇性吸附分離原理?！?172高效液相色譜§3高效液相色譜法的類型二、液固吸附色譜法1、原理吸附競爭的過程可表示為：吸附達(dá)到平衡時(shí)，平衡系數(shù)為：§3172高效液相色譜§3高效液相色譜法的類型二、液固吸附色譜法2、固定相液固色譜固定相可分為極性和非極性兩大類型。極性吸附劑包括硅膠、氧化鋁、氧化鎂、硅酸鎂、分子篩及聚酰胺等。非極性吸附劑最常見的是活性炭。至于今液固色譜法應(yīng)用最廣泛的是極性固定相硅膠?！?172高效液相色譜§3高效液相色譜法的類型二、液固吸附色譜法3、流動(dòng)相選擇原則是：極性大的試樣選極性強(qiáng)的洗脫劑在液固色譜法中，常用水對(duì)硅膠固定相進(jìn)行減活處理，此時(shí)流動(dòng)相中水的飽和度應(yīng)小于25%，若水含量過高，大量水附著在硅膠上會(huì)使液固色譜過程轉(zhuǎn)變成液液色譜過程而影響分離效果?！?172高效液相色譜§3高效液相色譜法的類型三、液液分配色譜1、原理2、固定相3、流動(dòng)相

§3172高效液相色譜§3高效液相色譜法的類型三、液液分配色譜1、原理用涂漬在基體上的固定液作固定相，以不同極性溶劑作流動(dòng)相，組分分子依據(jù)它們?cè)诠潭ㄒ号c流動(dòng)相中的溶解度,即溶質(zhì)分子在固定相和流動(dòng)相間的分配系數(shù)大小來進(jìn)行分離的色譜方法。§3172高效液相色譜§3高效液相色譜法的類型三、液液分配色譜2、固定相用常用的固定液有下列幾種:

，

—氧二丙腈（ODPN）聚乙二醇（PEG）十八烷（ODS）角鯊?fù)楣潭ㄒ骸?172高效液相色譜§3高效液相色譜法的類型三、液液分配色譜3、流動(dòng)相為防止固定液的流失，可采用以下措施：選擇對(duì)固定相的溶解度盡可能小的溶劑作流動(dòng)相。流動(dòng)相進(jìn)入色譜柱前，預(yù)先用固定液飽和，這種被固定液飽和的流動(dòng)相再流經(jīng)色譜柱時(shí)就不會(huì)溶解固定液了?！?172高效液相色譜§3高效液相色譜法的類型三、液液分配色譜3、流動(dòng)相為防止固定液的流失，可采用以下措施：使流動(dòng)相保持低流速經(jīng)過固定相，并保持色譜柱溫恒定。進(jìn)樣時(shí)若溶解樣品的溶劑對(duì)固定液有較大的溶解度，應(yīng)避免過大的進(jìn)樣量?！?172高效液相色譜§3§3高效液相色譜法的類型（一）正相液液分配色譜中，使用的流動(dòng)相與液固色譜中使用極性吸附劑時(shí)所用的流動(dòng)相類似。此時(shí)流動(dòng)相主體為已烷、庚烷，可加入20%的極性改性劑，如一氯丁烷、氯仿、二氯甲烷、異丙醚、乙酸乙酯、四氫呋喃、乙醇、甲醇、乙腈、等，這樣溶質(zhì)的容量因子會(huì)隨改性劑的加入而減小，表明混合溶劑的洗脫強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。172高效液相色譜§3高效液相色譜法的類型（二）反相液液分配色譜中，，使用的流動(dòng)相與液固色譜中使用非極性吸附劑時(shí)所用的流動(dòng)相類似。此時(shí)流動(dòng)相主體為水，可加入<20%的極性改性劑，如二甲基亞砜、乙二醇、甲醇、丙酮、對(duì)二氧六環(huán)、乙醇、四氫呋喃、異丙醇等，溶質(zhì)在混合溶劑中的容量因子會(huì)隨改性劑的加入而減小，表明混合溶劑的洗脫強(qiáng)度明顯增強(qiáng)?！?172高效液相色譜§3高效液相色譜法的類型四、化學(xué)鍵合相色譜法1、化學(xué)鍵合相化學(xué)鍵合固定相是通過化學(xué)反應(yīng)將有機(jī)分子鍵合在載體表面所形成的柱填充劑，具有穩(wěn)定、流失小、適于梯度淋洗等特點(diǎn)?！?172高效液相色譜§3高效液相色譜法的類型四、化學(xué)鍵合相色譜法1、化學(xué)鍵合相

ODS(C18)鍵合相硅膠十八烷基氯硅烷非極性使用pH范圍：

2-8§3172高效液相色譜§3高效液相色譜法的類型1）正相鍵合相色譜法在正相色譜法中，共價(jià)結(jié)合到載體上的基團(tuán)都是極性基團(tuán)，如胺基、氰基、二醇基等。流動(dòng)相溶劑是與吸附色譜中的流動(dòng)相很相似的非極性溶劑，如庚烷、已烷及異辛烷等。由于固定相是極性，因此流動(dòng)溶劑的極性越強(qiáng)，洗脫能力也越強(qiáng)，即極性大的溶劑是強(qiáng)溶劑?！?172高效液相色譜§3高效液相色譜法的類型1）反相鍵合相色譜法在反相色譜法中，一般采用非極性鍵合固定相，如硅膠-C18