生物素材：教材梳理專題課題土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)

學(xué)必求其心得，業(yè)必貴于專精學(xué)必求其心得，業(yè)必貴于專精學(xué)必求其心得，業(yè)必貴于專精庖丁巧解牛知識?巧學(xué)一、篩選菌株1。PCR技術(shù)是一種在體外將少量DNA大量復(fù)制的技術(shù)，PCR技術(shù)的原理是：如果DNA片段兩端的序列是已知的，那么采用PCR就可以很容易地將此DNA片段從整個(gè)DNA分子中擴(kuò)增出來。進(jìn)行PCR需要一段寡聚核苷酸鏈作為引物,它們各自與要擴(kuò)增的靶DNA片段末端互補(bǔ)，引物與模板DNA相結(jié)合并沿模板DNA延伸，以擴(kuò)增靶DNA序列.PCR技術(shù)需要使用耐高溫的DNA聚合酶，這種酶要能夠忍受93℃左右的高溫。深化升華PCR的過程由三個(gè)基本反應(yīng)組成：（熱）變性、復(fù)性、延伸,這樣構(gòu)成一個(gè)循環(huán)的復(fù)制,新合成的DNA鏈又可以作為模板進(jìn)行下一輪復(fù)制，重復(fù)3步操作。DNA片段呈2的指數(shù)增長，在1～2小時(shí)內(nèi)可完成25～30次的循環(huán)，擴(kuò)增的DNA片段數(shù)可增至106～107倍。2。選擇培養(yǎng)基是指允許特定種類的微生物生長，同時(shí)抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基。二、統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目1.直接計(jì)數(shù)法這種方法是指利用特定的細(xì)菌計(jì)數(shù)板或者血細(xì)胞計(jì)數(shù)板,在顯微鏡下計(jì)算一定容積樣品中微生物的數(shù)量.計(jì)數(shù)板是一塊特制的載玻片，上面有一個(gè)面積為1mm2和高0。1mm的計(jì)數(shù)室，該計(jì)數(shù)室又均分成400個(gè)小格.測量時(shí)將稀釋的樣品滴加在計(jì)數(shù)板上，蓋上蓋玻片，然后在顯微鏡下數(shù)出每個(gè)小格所含的細(xì)菌的平均數(shù)，再按下面的公式求出每毫升樣品所含的細(xì)菌數(shù)。每毫升原液所含的細(xì)菌數(shù)＝每小格平均細(xì)菌數(shù)×400×1000×稀釋倍數(shù)要點(diǎn)提示此方法的缺點(diǎn)是分不清活菌和死菌。2.間接計(jì)數(shù)法稀釋涂布平板法，常用來統(tǒng)計(jì)樣品中的活菌數(shù)，此法是根據(jù)微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的一個(gè)菌落是由一個(gè)細(xì)菌繁殖而成的現(xiàn)象進(jìn)行的，也就是說一個(gè)菌落就代表一個(gè)細(xì)菌。計(jì)數(shù)時(shí)先將待測樣品進(jìn)行一系列的稀釋,再取一定量的稀釋菌液接種在固體培養(yǎng)基上，使其較均勻地分布，經(jīng)過一段時(shí)間的培養(yǎng)后，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目，即可求出原液中的細(xì)菌數(shù).疑點(diǎn)突破這種方法計(jì)算出的為活菌數(shù)目，但是該數(shù)目往往比實(shí)際數(shù)目要小，原因是如果稀釋的倍數(shù)不夠大,很可能出現(xiàn)兩個(gè)或者更多的細(xì)菌在一起共同形成一個(gè)菌落的情況,在最后計(jì)算時(shí),我們卻是按照一個(gè)細(xì)菌來計(jì)算的。聯(lián)想發(fā)散還可以用紅細(xì)胞法來測量細(xì)菌的數(shù)目。該法要求先將數(shù)目已知的紅細(xì)胞與已經(jīng)稀釋的菌液混合均勻,然后在顯微鏡下觀察一滴菌液，計(jì)算出紅細(xì)胞和細(xì)菌的數(shù)目比例,然后根據(jù)其比例推算出細(xì)菌的數(shù)目.由于這種方法偶然性較大，所以可以多觀察幾個(gè)視野,然后取平均值。三、設(shè)置對照對照實(shí)驗(yàn)是指除了被測試條件之外，其他條件都相同的實(shí)驗(yàn)。設(shè)置對照的主要目的是排除實(shí)驗(yàn)組中非測試因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響,提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度.利用稀釋平板涂布法來統(tǒng)計(jì)樣品的活菌數(shù)，步驟復(fù)雜,測定值可能會(huì)受到各種因素的影響,因而一定要設(shè)立對照。例如為了排除“培養(yǎng)基中混入了其他含氮物質(zhì)”這種可能，可以設(shè)立一對照組，在該對照組中接種某種不能利用尿素的細(xì)菌如大腸桿菌，看一下這種細(xì)菌能否在培養(yǎng)基上生長，如果能生長,則說明該培養(yǎng)基中確實(shí)混入了其他含氮物質(zhì),如果不能生長則說明沒有混入其他含氮物質(zhì).知識拓展常用的對照方式有四種:空白對照、自身對照、相互對照和條件對照。(1）空白對照就是不給對照組任何處理，如本實(shí)驗(yàn)中可以將一只培養(yǎng)皿（內(nèi)有培養(yǎng)基）作為對照組,它可以檢測出培養(yǎng)基是否被污染(目的是排除這種可能）。（2）自身對照是指對照組和實(shí)驗(yàn)組在同一對象上進(jìn)行，也就是說把對象分成幾部分,分別給予不同的處理.（3)相互對照是指不設(shè)對照組,幾個(gè)實(shí)驗(yàn)組相互比較.（4）條件對照是指給予對照組一種被證明為有效因素的處理，例如研究者正在研究一種新的抗衰老藥物,實(shí)驗(yàn)組使用這種藥物，條件對照組就用已經(jīng)被證明有抗衰老作用的維生素E來處理。如果實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同,則說明該藥物有抗衰老作用,否則就證明沒有。誤區(qū)警示不同的微生物培養(yǎng)時(shí)所需的溫度和培養(yǎng)時(shí)間都不同，不能一概而論。例如細(xì)菌一般需要在30~37℃培養(yǎng)1～2天；放線菌一般在25~28℃培養(yǎng)5～7天；霉菌一般在25～28℃培養(yǎng)3～4天。三、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案：樣品的稀釋和稀釋液的取樣培養(yǎng)1.儀器、材料和用具：滅過菌的小鐵鏟、氮源為尿素的培養(yǎng)基、1mL的無菌吸管、無菌水、試管、無菌培養(yǎng)皿、無菌信封、酒精燈、燒瓶、涂布器。2.操作步驟：（1)在富含有機(jī)質(zhì)、pH為接近中性的潮濕土壤中,用無菌小鐵鏟鏟去表層土,迅速鏟取土壤裝入無菌信封，密封。然后在火焰旁稱取土壤10g，倒入燒瓶中，塞好棉塞。（2）將稱取的樣品用無菌水稀釋101、102、103、104、105、106倍,制備成菌液.（3）將上述培養(yǎng)基的9個(gè)平板分成3組，分別標(biāo)記為104、105、106倍,用3支吸管分別吸取對應(yīng)的菌液,滴入平板后用涂布器涂布。每組另外再設(shè)立兩個(gè)對照,分別對含有硝酸鹽和尿素（滅菌）、未嚴(yán)格滅菌（不含硝酸鹽和尿素）的培養(yǎng)基進(jìn)行涂布。（4）將平板放在30～37℃的溫度下培養(yǎng)2天，菌落數(shù)目穩(wěn)定后做記錄,算出同一稀釋度的3個(gè)平板的菌落平均數(shù)。要點(diǎn)提示(1）整個(gè)過程中要注意無菌操作，一定要建立“有菌觀念"，知道雜菌無處不在。對不同的器具要選擇不同的滅菌方法.(2）做好標(biāo)記:整個(gè)操作中所用的培養(yǎng)皿、試管、吸管等都很多，因此要事先做好標(biāo)記，避免混淆。（3）規(guī)劃時(shí)間：微生物培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)都是耗時(shí)很長的實(shí)驗(yàn)，因此要事先規(guī)劃好時(shí)間，以便提高工作效率。（4)實(shí)驗(yàn)完成后，不同的實(shí)驗(yàn)小組要對結(jié)果進(jìn)行比較，如果結(jié)果相差很大，一定要分析其原因。問題?探究問題1自生固氮菌是土壤中一種常見菌，以土壤中的腐殖質(zhì)為營養(yǎng)物質(zhì)來源,它能夠利用空氣中的氮?dú)夂铣勺陨砟軌蚶玫陌?，試探究其分離方法。思路:由題目提供的材料可知，自生固氮菌是異養(yǎng)微生物，因此培養(yǎng)基中必須添加有機(jī)碳源；一般微生物都不能直接利用氮?dú)?，而自生固氮菌可以利用氮?dú)猓眠@一特點(diǎn)可以配制選擇培養(yǎng)基分離自生固氮菌。探究：配制固體培養(yǎng)基，其中加入有機(jī)碳源如葡萄糖、生長因子、水、無機(jī)鹽,但一定要注意培養(yǎng)基內(nèi)不能含有氮元素，滅菌后用涂布器涂布土壤稀釋液，放在30℃下培養(yǎng)4天，培養(yǎng)基上所生菌落即是自生固氮菌的菌落。問題2培養(yǎng)基滅菌不徹底或者滅菌后使用之前被雜菌污染都能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，試探究怎樣鑒別培養(yǎng)基中是否有雜菌。思路：如果培養(yǎng)基中含有雜菌,那么在適宜的環(huán)境中它能繁殖而形成菌落.探究：將待檢測培養(yǎng)基放在恒溫箱內(nèi)（35℃）培養(yǎng)2～4天，如果培養(yǎng)基上長出菌落，則說明培養(yǎng)基中含有雜菌，否則就沒有雜菌，可以放心使用.典題?熱題例1在微生物學(xué)中,將允許特定種類的微生物生長，同時(shí)又能抑制或者阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基稱作（）A.鑒別培養(yǎng)基 B.加富培養(yǎng)基C.選擇培養(yǎng)基 D?；A(chǔ)培養(yǎng)基解析：考查培養(yǎng)基的分類.基礎(chǔ)培養(yǎng)基是含有一般微生物生長繁殖所需基本營養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基，例如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；加富培養(yǎng)基一般用來培養(yǎng)營養(yǎng)要求比較苛刻的異養(yǎng)型微生物；鑒別培養(yǎng)基是在培養(yǎng)基中加入某種特殊的化學(xué)物質(zhì)，微生物的代謝產(chǎn)物能與該物質(zhì)產(chǎn)生特定的化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生明顯的特征變化，如出現(xiàn)某種特定顏色等，從而鑒別出微生物種類；選擇培養(yǎng)基是在培養(yǎng)基中加入某種物質(zhì)，促進(jìn)需要的微生物生長、抑制不需要的微生物生長，從而選擇出某種微生物。答案:C拓展延伸培養(yǎng)基的分類標(biāo)準(zhǔn)有很多，因此類別也很多,不同類別的培養(yǎng)基所培養(yǎng)的微生物的種類和生長狀況都是不同的，例如液體培養(yǎng)基常用于工業(yè)生產(chǎn)，而觀察菌落就只能用固體培養(yǎng)基,分離菌種常用選擇培養(yǎng)基，發(fā)酵工程常用天然培養(yǎng)基等。例2能夠測定樣品活菌數(shù)的方法是()A.稀釋涂布平板法 B.直接計(jì)數(shù)法C。重量法 D.比濁法解析：考查各種計(jì)數(shù)方法的區(qū)別。直接計(jì)數(shù)法是利用計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下計(jì)算出微生物的數(shù)量，該法不能區(qū)分死菌與活菌；重量法又分成干重和濕重法，主要用于測定微生物的群體生長量，也不能區(qū)分菌的死活;比濁法的原理是在一定范圍內(nèi)，菌液的濃度和渾濁度成正比，即與光密度成正比，該法也不能區(qū)分菌的死活;平板涂布法是先讓細(xì)菌形成菌落，然后根據(jù)菌落數(shù)推算菌數(shù)的方法，由于只有活菌能形成菌落，因此該法能測定樣品活菌數(shù)。答案：A.巧妙變式統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的方法有(）①涂布平板法②重量法③直接計(jì)數(shù)法④比濁法⑤生理指標(biāo)法⑥膜過濾法A.①②③⑥ B。③④⑤⑥ C.①D。①③解析:考查微生物的計(jì)數(shù)方法,解答時(shí)要抓住“菌落”這個(gè)關(guān)鍵要求。答案：C例3在做土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)時(shí),甲組用氮源只有尿素的培養(yǎng)基，乙組實(shí)驗(yàn)用氮源除尿素外還有硝酸鹽的培養(yǎng)基,其他的成分都相同，在相同的條件下培養(yǎng)、觀察。乙組實(shí)驗(yàn)為（）A?？瞻讓φ? B。標(biāo)準(zhǔn)對照C.相互對照 D.條件對照解析：考查對照的分類。本實(shí)驗(yàn)的目的應(yīng)該是證明只有分解尿素的細(xì)菌才能利用尿素，其他細(xì)菌不能利用尿素。由于硝酸鹽是常用的氮源，這一點(diǎn)是已知的，因此該對照應(yīng)該是條件對照。答案:D方法點(diǎn)撥在解析對照實(shí)驗(yàn)的作用時(shí)，一定先要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，比較出實(shí)驗(yàn)組和對照組的不同因素，一般情況下這一因素就是單因子變量（有時(shí)也不是)，然后再確定對照的類型和所起的作用.例4某同學(xué)用101、102、103倍稀釋液涂布平板時(shí)得到的平均菌落數(shù)為2760、295、和46，則菌落總個(gè)數(shù)為（）A.2。76×104個(gè)/mLB。2。95×104個(gè)/mLC.4.6×104個(gè)/mLD.3。775×104個(gè)/mL解析:對菌落計(jì)數(shù)時(shí),要選擇平板的平均菌落數(shù)在30～300個(gè)之間的稀釋倍數(shù)，當(dāng)只有一個(gè)稀釋倍數(shù)符合此條件時(shí)，則對應(yīng)平板的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)就是該樣品的細(xì)菌總數(shù),若兩個(gè)稀釋倍數(shù)