DB21T 2209-2013 海綿種屬分子生物學(xué)鑒定技術(shù)規(guī)程

ICS65.150B51DB21DB21/T2209—2013海綿種屬分子生物學(xué)鑒定技術(shù)規(guī)程TechnicalSpecificationofIdentifyingSpongethroughMolecularBiologyTechniques遼寧省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布IDB21/T2209—2013本標(biāo)準(zhǔn)是按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草的。本標(biāo)準(zhǔn)由大連海洋大學(xué)提出。本標(biāo)準(zhǔn)由大連市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局歸口。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草單位：大連海洋大學(xué)、中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：付晚濤、鄭長波、曹旭鵬、蘇延明、宋悅凡、潘勍宇、安宗福。本標(biāo)準(zhǔn)于2013年**月**日首次發(fā)布。1DB21/T2209—2013本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了海綿種屬分子生物學(xué)鑒定的總則、海綿樣品采集與保存、海綿種屬鑒定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于海綿的樣品采集、保存、處理和種屬分子生物學(xué)鑒定方法。2術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。2.1海綿2.2海綿分子條碼海綿的細(xì)胞色素氧化酶亞基Ⅰ（cytochromeoxidasesubunitⅠ,簡稱COI）的DNA序列為海綿的保守基因序列信息，作為海綿分子條碼。3.1原理海綿細(xì)胞色素氧化酶亞基Ⅰ（COI）的DNA序列為海綿的保守基因序列，作為海綿分子條碼，用于鑒定海綿種屬。通過分子生物學(xué)技術(shù)——聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，簡稱PCR）擴(kuò)增海綿的COI基因部分序列，測序后與已經(jīng)鑒定海綿的COI基因序列比對，以此鑒定海綿的種屬。3.2儀器與設(shè)備——野外生物樣品保存箱或泡沫保溫箱；——高速低溫冷凍離心機(jī)；——水浴鍋；——-80℃冰柜。3.3試劑與材料——無水乙醇（分析純——細(xì)胞裂解緩沖液（10mmol/LTris-Cl，pH8.0；1mmol/LEDTA，pH8.0；0.1%(m/V)SDS——異丙醇（分析純2DB21/T2209—2013——醋酸甲溶液（60ml5mol/L醋酸鉀；11.5ml冰醋酸；28.5ml超純水——細(xì)胞裂解液（20mmol/LTris-Cl，pH7.6——蛋白酶K（20mg/ml——TE緩沖液（pH7.6100mol/LTris-Cl，pH7.6；10mmol/LEDTA，pH8.0——超純水；——PCR酶(5U/μL)；高壓滅菌10min）。4海綿樣品采集與保存4.1對于潮間帶海綿，在海水退潮后，先拍照或攝像，再用金屬或木質(zhì)的小板采集海綿樣品于塑料采樣瓶中，立刻加入75%乙醇浸沒海綿樣品并超過2cm以上，然后放入裝有冰袋的泡沫保溫箱或野外生物樣品保存箱，用于分子生物學(xué)鑒定。4.2對于潮下帶海綿和深海海綿，采樣器采集海綿后放入塑料采樣瓶中并在瓶中裝滿樣品附近的海水。裝有海綿樣品和海水的樣品瓶被帶上船或帶上岸后，倒掉采樣瓶中海水，立刻加入75%乙醇浸沒海綿樣品并超過2cm以上，然后放入裝有冰袋的泡沫保溫箱或野外樣品保存箱，用于分子生物學(xué)鑒定。4.3上述樣品均可在4℃條件下保存1天。4.4海綿樣品采集與保存記錄于《海綿資源調(diào)查采樣表》（詳見附錄A）。5海綿種屬鑒定方法以海綿的COI基因序列為鑒定海綿種屬的分子生物學(xué)信息。5.1海綿DNA提取與純化5.1.1取約0.5g保存在乙醇中的海綿樣品，放入事先用液氮冷卻過的研缽中，加入液氮研磨海綿樣品成粉末狀。5.1.2將研磨成粉末的海綿樣品移入裝有600μL細(xì)胞裂解緩沖液的聚丙烯離心管中混勻，加入3μL蛋白酶K，在55℃水浴鍋上放置3h以上。5.1.3從水浴鍋取下裝有海綿的離心管，放置室溫后，加入200μL醋酸鉀溶液，振蕩、混勻。5.1.4在4℃離心（12,000rpm）3min,將上清液轉(zhuǎn)移至裝有600μL異丙醇的新的聚丙烯離心管中，振蕩、混勻，然后在室溫離心（12,000rpm）3min。5.1.5吸去上清液，加入600μL乙醇（70%），振蕩混勻，在室溫離心（12,000rpm）3min（重復(fù)此過程一次）。5.1.6吸去上清液，在空氣中干燥DNA沉淀15min；將DNA沉淀溶解于300μLTE緩沖液（pH7.6作為海綿基因組DNA提取純化液。5.1.7海綿基因組DNA提取純化液保存于-80℃。5.2海綿COI基因序列片段的PCR擴(kuò)增與測序3DB21/T2209—20135.2.1使用擴(kuò)增海綿COI基因序列片段的特異引物對（LCO1490:GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG；COX1-R1:TGTTGRGGGAAAAARGTTAAATT）。5.2.2在100μLPCR反映管中加入如下試劑：10×PCR緩沖液10μL、引物L(fēng)CO1490（20pmol/L）0.5μL、引物COX1-R1（20pmol/L）0.5μL、海綿基因組DNA提取純化液10μL、Taq酶(5U/μL)0.5μL、超純水定容至50μL。5.2.3把此PCR反應(yīng)管放在普通PCR儀中，并按照如下條件在進(jìn)行PCR擴(kuò)增海綿COI基因序列片段的反應(yīng)：一個循環(huán)反應(yīng)（94℃2min、50℃1min、72℃2min），30個循環(huán)反應(yīng)（94℃50秒、50℃50秒、72℃2min），最后在72℃停留10min，結(jié)束PCR反應(yīng)。5.2.4從PCR儀中取出擴(kuò)增的海綿基因片段產(chǎn)品，經(jīng)測序后獲得海綿COI基因片段DNA序列信息。5.3海綿分子生物學(xué)種屬鑒定5.3.1新測序的海綿COI基因DNA片段序列在在線網(wǎng)站（/）進(jìn)行核苷酸（nucleotide）序列比對，初步獲知海綿種屬信息；5.3.2根據(jù)初步獲得的海綿種屬信息，根據(jù)國際公認(rèn)的已鑒定海綿COI基因DNA片段序列信息（在線網(wǎng)站：/）確認(rèn)海綿種屬，COI基因DNA片段序列一致性不低于99%的海綿被鑒定為同一種屬海綿，記下種屬名，記錄于《海綿分子生物學(xué)鑒定記錄表》（詳見附錄B）。5.3.3對于海綿COI基因DNA片段序列一致性低于99%的海綿，作為暫時不能鑒定海綿，記錄于《暫時不能鑒定海綿的記錄表》（詳見附錄C）。4DB21/T2209—2013（資料性附錄）海綿資源調(diào)查采樣表采樣點(diǎn)經(jīng)度緯度；采樣人；水深水溫鹽度；序號標(biāo)本瓶號海綿樣品記錄名稱數(shù)量備注1234567記事：采樣記錄校對5DB21/T2209—2013（資料性附錄）海綿分子生物學(xué)鑒定記錄表鑒定人；地點(diǎn)；分子生物學(xué)儀器的名稱型號；序號標(biāo)本瓶號海綿樣品記錄名稱海綿分子生物學(xué)鑒定結(jié)果備注123456789記事：采樣記錄校對6DB21/T2209—2013