DNA的生物合成-DNA復(fù)制（生物化學(xué)）

DNA的生物合成生物化學(xué)DNA復(fù)制生物化學(xué)

復(fù)制是指以親代DNA為模板合成子鏈DNA的過程。復(fù)制的方式——半保留復(fù)制雙向復(fù)制半不連續(xù)復(fù)制復(fù)制的高保真性基本規(guī)律一、DNA復(fù)制的特點(一)半保留復(fù)制1.概念

DNA合成時，以親代DNA解開的兩股單鏈為模板，按堿基配對規(guī)律，合成子代DNA的過程。子代DNA，一股單鏈來源于親代，另一股單鏈為新合成。子代和親代的DNA堿基序列一致。這種復(fù)制方式稱為半保留復(fù)制。AGGTACTGCCTCCATGACGGCCACTGGGGTGACCAGGTATCCATTCCATAGGTAAGGTACTGCCTCCATGACGGAGGTACTGCCTCCATGACGG+母鏈DNA

復(fù)制過程中形成的復(fù)制叉子代DNA

密度梯度實驗

——實驗結(jié)果支持半保留復(fù)制的設(shè)想含重氮-DNA的細(xì)菌培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液

第一代繼續(xù)培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液

第二代梯度離心結(jié)果151415151514按半保留復(fù)制方式，子代DNA與親代DNA的堿基序列一致，即子代保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳的保守性。半保留復(fù)制的意義遺傳的保守性，是物種穩(wěn)定性的分子基礎(chǔ)，但不是絕對的。DNA從起始點(origin)向兩個方向解鏈，形成兩個延伸方向相反的復(fù)制叉，稱為雙向復(fù)制。（二）雙向復(fù)制原核生物復(fù)制中的放射自顯影圖像2.真核生物每個染色體有多個起始點，是多復(fù)制子的復(fù)制。習(xí)慣上把從一個DNA復(fù)制起始點到終止點的復(fù)制區(qū)域稱為復(fù)制子。復(fù)制子是獨立完成復(fù)制的功能單位。5’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’5’5’3’復(fù)制子3’（三）復(fù)制的半不連續(xù)性3

5

3

5

解鏈方向3′5′3′3′5′領(lǐng)頭鏈隨從鏈DNA新鏈生成需引物和模板；新鏈的延長只可沿5→3

方向進(jìn)行領(lǐng)頭鏈：順著解鏈方向生成的子鏈，復(fù)制是連續(xù)進(jìn)行的，這股鏈稱為。隨從鏈：另一股鏈因為復(fù)制的方向與解鏈方向相反，不能順著解鏈方向連續(xù)延長。復(fù)制中的不連續(xù)片段稱為岡崎片段。

領(lǐng)頭鏈連續(xù)復(fù)制而隨從鏈不連續(xù)復(fù)制，就是復(fù)制的半不連續(xù)性。

1.DNA-pol的核酸外切酶活性和及時校讀A：DNA-pol的外切酶活性切除錯配堿基；并用其聚合活性摻入正確配對的底物。B：堿基配對正確，DNA-pol不表現(xiàn)活性。DNA-polⅠ外切活性聚合活性AGA:CGB:5/3/5/3/無活性(四)復(fù)制的高保真性2.復(fù)制保真性的堿基選擇a)DNA聚合酶靠其大分子結(jié)構(gòu)協(xié)調(diào)非共價(氫鍵)與共價鍵(磷酸二酯鍵)的有序形成。b)嘌呤的化學(xué)結(jié)構(gòu)能形成順式和反式構(gòu)型，與相應(yīng)的嘧啶形成氫鍵配對，嘌呤應(yīng)處于反式構(gòu)型。

3.DNA復(fù)制保真性依賴三種機(jī)制

a)遵守嚴(yán)格的堿基配對規(guī)律。b)聚合酶在復(fù)制延長時對堿基的選擇功能。c)復(fù)制出錯時DNA-pol的及時校讀功能。NN9P-RNHHNN6順式NN9R-PNHHNN6反式二、DNA復(fù)制的體系(一)

原料(substrate)

dATP,dGTP,dCTP,dTTP。(二)模板(template)

解開成單鏈的DNA母鏈。(三)

引物(primer)

提供3

-OH末端使dNTP可以依次聚合的RNA(DNA)片斷。(四)

酶和蛋白因子1.DNA聚合酶

全稱為依賴DNA的DNA聚合酶(DNA-dependentDNApolymerase)，簡稱DNA-pol。(1)活性：5

3

的聚合活性；3

5

外切酶活性能辨認(rèn)錯配的堿基對，并將其水解；5

3

外切酶活性能切除突變的DNA片段。5′AGCTTCAGGATA

3′

|||||||||||3′TCGAAGTCCTAGCGAC5′?大腸桿菌E.coli中的三種DNA聚合酶分類DNA聚合酶IDNA聚合酶IIDNA聚合酶III分子量(KD)109120900聚合速率(核苷酸/分)1000—600005ˊ→3ˊ聚合酶活性+++3ˊ→5ˊ外切酶活性+++5ˊ→3ˊ外切酶活性+——生物學(xué)功能切除引物延長岡崎片段DNA損傷修復(fù)延長子鏈校讀作用校讀作用DNA損傷修復(fù)(2)原核生物的DNA聚合酶DNA-polⅠDNA-polⅡDNA-polⅢ(3)真核生物的DNA聚合酶填補引物空隙，切除修復(fù)，重組延長子鏈的主要酶，解螺旋酶活性線粒體DNA復(fù)制起始引發(fā)，引物酶活性功能+++--3￠→5￠高高高？中5￠→3￠聚合活性25.512.514.04.016.5分子量（kD）εδγβαDNA-pol填補引物空隙，切除修復(fù)，重組延長子鏈的主要酶，解螺旋酶活性線粒體DNA復(fù)制起始引發(fā)，引物酶活性+++--3￠→5￠外切酶活性高高高？中5￠→3￠聚合活性25.512.514.04.016.5分子量（kD）εδγβαDNA-pol參與損傷與修復(fù)生物學(xué)2.復(fù)制中的分子解鏈及DNA分子拓?fù)鋵W(xué)變化

DNA分子的堿基埋在雙螺旋內(nèi)部，只有把DNA解成單鏈，它才能起模板作用。

（2）解螺旋酶——利用ATP供能，作用于氫鍵，使DNA雙鏈解開成為兩條單鏈（3）單鏈DNA結(jié)合蛋白(singlestrandedDNAbindingprotein,SSB)——在復(fù)制中維持模板處于單鏈狀態(tài)并保護(hù)單鏈的完整（1）DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶(DNAtopoisomerase)

改變DNA的超螺旋狀態(tài)，理順DNA鏈的酶（5）DNA連接酶連接DNA鏈3

-OH末端和相鄰DNA鏈5

-P末端，使二者生成磷酸二酯鍵，從而把兩段相鄰的DNA鏈連接成一條完整的鏈。作用方式（4）引物酶(primase)

——復(fù)制起始時催化生成RNA引物的酶HO5’3’3’5’DNA連接酶ATPADP5’3’5’3’POO-O-O三、DNA復(fù)制的過程

(TheProcessofDNAReplication)(一)復(fù)制的起始需要解決兩個問題DNA解開成單鏈，提供模板。合成引物，提供3-OH末端。原核生物的DNA生物合成

DnaADnaB、DnaCDNA拓?fù)洚悩?gòu)酶引物酶SSB3

5

3

5

引發(fā)體和引物含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA復(fù)制起始區(qū)域的復(fù)合結(jié)構(gòu)稱為引發(fā)體。

3

5

3

5

引物是由引物酶催化合成的短鏈RNA分子。

引物3'HO5'引物酶

5'

3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH3'3'DNA-pol復(fù)制的延長指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐個加入引物或延長中的子鏈上，其化學(xué)本質(zhì)是磷酸二酯鍵的不斷生成。

(二)復(fù)制的延長領(lǐng)頭鏈的合成1.領(lǐng)頭鏈的延長領(lǐng)頭鏈沿著5/→3/方向可以連續(xù)的延長。2.隨從鏈的延長復(fù)制簡圖1.原核生物基因是環(huán)狀DNA，雙向復(fù)制的復(fù)制片段在復(fù)制的終止點(ter)處匯合。oriter

E.coli8232oriterSV40500(三)復(fù)制的終止5

5

5

RNA酶OHP5

DNA-polⅠdNTP5

5

PATP

ADP+Pi5

5

DNA連接酶2.隨從鏈上不連續(xù)性片段的連接哺乳動物的細(xì)胞周期DNA合成期G1G2SM真核生物的DNA生物合成

真核生物DNA復(fù)制在細(xì)胞周期的S期進(jìn)行，也可分為起始、延長和終止三個階段，每個階段的基本過程與原核生物DNA復(fù)制相似，但存在不少差異。

1.真核生物每個染色體有多個起始點，是多復(fù)制子復(fù)制。復(fù)制有時序性，即復(fù)制子以分組方式激活而不是同步起動。

2.復(fù)制的起始需要DNA-polα（引物酶活性）和polδ（解螺旋酶活性）參與。還需拓?fù)涿负蛷?fù)制因子(replicationfactor,RF)。

3.增殖細(xì)胞核抗原(proliferationcellnuclearantigen,PCNA)在復(fù)制起始和延長中起關(guān)鍵作用。(一)復(fù)制的起始3

5

5

3

領(lǐng)頭鏈3

5

3

5

親代DNA隨從鏈引物核小體(二)復(fù)制的延長

真核生物的聚合酶δ催化子鏈的延長，并有校正功能。引物和岡崎片段(約200bp)都比較短。

5

3

3

55

3

3

5+5

3

3

3

3

5

5

1.染色體DNA呈線狀，復(fù)制在末端停止。2.復(fù)制中岡崎片段的連接，復(fù)制子之間的連接。3.染色體兩端DNA子鏈上復(fù)制的RNA引物，去除后留下空隙。(三)復(fù)制的終止1.端粒(telomere)指真核生物染色體線性DNA分子末端的結(jié)構(gòu)。TTTTGGGGTTTTGGGG…(四)端粒與端粒酶3.功能維持染色體的穩(wěn)定性。維持DNA復(fù)制的完整性。2.結(jié)構(gòu)特點由末端單鏈DNA序列和蛋白質(zhì)構(gòu)成。末端序列是多重復(fù)富含G、C的短序列。