PCR儀原理及其應(yīng)用

PCR儀的原理及其操作應(yīng)用§1.PCR儀的技術(shù)原理§2.PCR儀的分類與應(yīng)用§3.PCR儀的操作步驟輕紡與食品學(xué)院報(bào)告人：裴樂(lè)樂(lè)指導(dǎo)老師：林教授2021/6/271§1.PCR原理簡(jiǎn)介

PCR(PolymeraseChainReaction)即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，主要用于DNA片段的體外擴(kuò)增，基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。2021/6/272PCRCycle-Step1-DenaturationTemplateDNAbyHeat(94oC)TargetSequenceTargetSequencePCR原理示意圖①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；2021/6/273PCRCycle-Step2–

Temperatureislowered(Tm)andprimersannealtotargetsequencesTargetSequenceTargetSequencePrimer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；2021/6/274PCRCycle-Step3-

At72oCTaqDNApolymerasecatalysesprimerextensionascomplementarynucleotidesareincorporatedTargetSequenceTargetSequencePrimer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNAPolymerase③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的DNA鏈。2021/6/275Endofthe1stPCRCycle–

ResultsintwocopiesoftargetsequenceTargetSequenceTargetSequence每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。2021/6/276TargetAmplificationNo.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon2021/6/277§2.PCR儀的分類與應(yīng)用

普通PCR儀：一次PCR擴(kuò)增只能運(yùn)行一個(gè)特定退火溫度的PCR儀，如果要做不同的退火溫度需要多次運(yùn)行。梯度PCR儀：一次性PCR擴(kuò)增可以設(shè)置一系列不同的退火溫度條件（溫度梯度），因?yàn)楸粩U(kuò)增的不同DNA片段，其最適退火溫度不同，通過(guò)設(shè)置一系列的梯度退火溫度進(jìn)行擴(kuò)增，從而一次性PCR擴(kuò)增，就可以篩選出表達(dá)量高的最適退火溫度，進(jìn)行有效的擴(kuò)增。主要用于研究未知DNA退火溫度的擴(kuò)增，這樣節(jié)約成本的同時(shí)也節(jié)約了時(shí)間。2021/6/278原位PCR儀：用于從細(xì)胞內(nèi)靶DNA的定位分析的細(xì)胞內(nèi)基因擴(kuò)增儀，如病源基因在細(xì)胞的位置或目的基因在細(xì)胞內(nèi)的作用位置等。是保持細(xì)胞或組織的完整性，使PCR反應(yīng)體系滲透到組織和細(xì)胞中，在細(xì)胞的靶DNA所在的位置上進(jìn)行基因擴(kuò)增。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀：在普通PCR儀的基礎(chǔ)上增加一個(gè)熒光信號(hào)采集系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)分析處理系統(tǒng)，就成了熒光定量PCR儀。其PCR擴(kuò)增原理和普通PCR儀擴(kuò)增原理相同，只是PCR擴(kuò)增時(shí)加入的引物是利用同位素、熒光素等進(jìn)行標(biāo)記，使用引物和熒光探針同時(shí)與模板特異性結(jié)合擴(kuò)增。擴(kuò)增的結(jié)果通過(guò)熒光信號(hào)采集系統(tǒng)實(shí)時(shí)采集信號(hào)連接輸送到計(jì)算機(jī)分析處理系統(tǒng)得出量化的實(shí)時(shí)結(jié)果輸出。2021/6/279普通PCR梯度PCR原位PCR熒光定量PCR四種PCR儀示意圖2021/6/2710§3.PCR的操作步驟1.配置反應(yīng)體系：引物、模板、buffer，dNTPs,酶，Mg2+,(如果是熒光定量PCR，則還有染料或探針）。2.在PCR儀上設(shè)置程序：一般是94℃變性5min使模板充分變性,之后“94℃變性、退火（不同引物溫度不同）、72℃延伸”共30-35個(gè)循環(huán)，再72℃延伸10min，使產(chǎn)物延伸完整，設(shè)置完程序后啟動(dòng)機(jī)器運(yùn)行。3.如果是常規(guī)PCR，則后面還有電泳實(shí)驗(yàn)，如果是熒光定量PCR則可以實(shí)時(shí)觀察實(shí)驗(yàn)過(guò)程。2021/6/2711PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)2021/6/27121234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬(wàn)倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍2021/6/2713模板DNA95℃2021/6/2714PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)50℃引物1引物2DNA引物2021/6/2715PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶2021/6/2716PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)72℃第1輪結(jié)束第2輪開(kāi)始2021/6/2717PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaq2021/6/2718PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)72℃第2輪結(jié)束2021/6/2719PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)重復(fù)30輪后230=1,073,741,824模板DNA第1輪擴(kuò)增第2輪擴(kuò)增第3輪擴(kuò)增第4輪擴(kuò)增第5輪擴(kuò)增第6輪擴(kuò)增理想拷貝數(shù)=2nn循環(huán)次數(shù)實(shí)際拷貝數(shù)=(1+x)nX平均效率,約為0.85n循環(huán)次數(shù)

2021/6/2720最近自己做的PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)1.提取樣品中酵母菌的DNA2.配置好體系后用普通PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增(所用引物是EF3和EF4)3.做瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，并用凝膠成像儀觀察DNA條帶用到的PCR擴(kuò)增程序：(1)94℃5min(2)94℃45s51℃1min