免疫標記技術課件

免疫標記技術Immunolabelingtechnique3.免疫標記技術免疫標記技術=抗原抗體反應示蹤物標記靈敏性特異性免疫標記技術的主要特點：高特異性、高靈敏性免疫技術+標記技術酶熒光素同位素3.免疫標記技術3.免疫標記技術1.ELISA檢測HBsAg(小組做)實驗內容3.免疫標記技術(錄像)2.尿液HCG檢測(膠體金法)(小組做)3.免疫標記技術實驗目的1.掌握酶聯(lián)免疫吸附實驗的基本原理；2.了解利用雙抗體夾心法測定HBsAg的方法。3.了解膠體金法檢測HCG的原理、方法。3.免疫標記技術基本原理

利用酶催化底物反應的生物放大作用,提高特異性抗原-抗體免疫學反應的檢測敏感性的一種標記免疫技術。Ag+AbEAgAbE+

底物呈色反應一、酶免疫技術3.免疫標記技術EIA固相聚苯乙烯Ag或Ab吸附到固相上的過程,稱為包被

(酶免疫測定法)3.免疫標記技術基本特點：①標記后保留酶和抗原(抗體)的活性；②酶促反應專一性，保證特異性；③底物反應放大作用，提高敏感性；④酶標試劑保存穩(wěn)定；⑤操作簡便，安全易行。3.免疫標記技術常用酶及其底物常用底物：鄰苯二胺(OPD)：反應顯橙黃色，應避光，致癌性。四甲基聯(lián)苯胺(TMB)：反應后呈藍色，無需避光，無致癌性,但水溶性差。常用底物：對硝基苯磷酸酯(p-NPP)：產(chǎn)物為黃色。AP靈敏性高于HRP，但不易獲得純品，且穩(wěn)定性低于HRP、價高，故應用不如HRP普及。1.辣根過氧化物酶(HRP)2.堿性磷酸酶(AP)3.免疫標記技術3.免疫標記技術

酶聯(lián)免疫吸附實驗enzymelinkedimmunosorbentassay

（ELISA）3.免疫標記技術ELISA基本的實驗過程3.免疫標記技術雙抗體夾心法檢測HBsAg

3.免疫標記技術HBV感染后的血清學指標:HBsAg,HBsAbHBeAg,HBeAbHBcAb(IgG,IgM)乙肝表面抗原,存在于HBV感染的急性期及慢性期的血清中,為感染指標。3.免疫標記技術實驗材料1.HBV診斷試劑盒；2.HBsAg陽性對照品，陰性對照品，待檢品。3.免疫標記技術實驗步驟2.在各孔內加入酶標抗體1滴,37℃溫育30分鐘。3.各孔分別加入洗滌液(加滿)---甩掉，反復3次，然后在吸水紙上吸干(倒扣在吸水紙上)。4.各孔內加入底物液A、B各1滴，輕輕搖動混勻，室溫避光反應15分鐘。5.各孔內加入終止液1滴，觀察結果。1.將已包被的孔編號，分別加入陽性對照血清、陰性對照血清及待測血清各1滴。3.免疫標記技術結果判定2.若待檢孔顯色深于或等于陽性對照孔則判定為陽性；3.若待檢孔顯色介于陰性對照孔和陽性對照孔之間則判定為弱陽性。1.若待檢孔顯色淺于陰性對照則判定為陰性；3.免疫標記技術注意事項2.洗滌必須徹底，防止產(chǎn)生假陽性。1.加樣應加在板孔的底部，避免產(chǎn)生氣泡并迅速完成。3.免疫標記技術二、膠體金法檢測尿液HCG人絨毛膜促性腺激素

(humanchorionicgonadotropin,HCG)

受精卵子移行到子宮內著床后，形成胚胎，在胚胎的發(fā)育過程中，胎盤合體滋養(yǎng)層細胞產(chǎn)生大量的HCG，是一種具有促性腺發(fā)育的糖蛋白類激素,可通過孕婦血液循環(huán)而排泄到尿中。臨床上常用抗HCG檢測尿液中的HCG以輔助早孕診斷和其他臨床相關疾病。3.免疫標記技術膠體金標記免疫技術(金標法)

膠體金是由氯化金與還原劑反應形成的一種膠體顆粒，具有吸附蛋白質的特性(可以標記Ag或Ab)；膠體金顆粒具有呈色性，中等大小的膠體金顆粒呈現(xiàn)酒紅色。膠體金標記免疫技術是將金顆粒光學檢測的靈敏性和抗原抗體反應的特異性相結合。3.免疫標記技術AGTB層析流方向HCG金標試紙A：加待檢尿液G：金標鼠抗人HCG單抗T：鼠抗人HCG單抗C：羊抗鼠IgG抗體B：吸水紙滴加標本C3.免疫標記技術AGTB層析流方向HCG金標試紙滴加標本C復溶固定反應條帶質控條帶雙抗體夾心法A：加待檢尿液G：金標鼠抗人HCG單抗T：鼠抗人HCG單抗C：羊抗鼠IgG抗體B：吸水紙3.免疫標記技術3.免疫標記技術3.免疫標記技術膠體金免疫法與RIA、ELISA等方法相比,有許多優(yōu)點：1.它不需ELISA法中所要求的作用的底物和顯色