第七章-第二節(jié)、微生物代謝與生長

第七章

第二節(jié)、微生物生長代謝生物個體由小到大的增長，即表現(xiàn)為細胞組分與結(jié)構(gòu)在量方面的增加

生長指生物個體數(shù)目的增加

繁殖

在單細胞微生物中，生長繁殖的速度很快，而且兩者始終交替進行，個體生長與繁殖的界限難以劃清，因此實際上常群體生長作為衡量微生物生長的指標。

群體生長的實質(zhì)是包含著個體細胞生長與繁殖交替進行的過程個體生長個體繁殖群體生長群體生長個體生長+個體繁殖由于微生物的個體極小，所以常用群體生長來反映個體生長的狀況一、微生物純培養(yǎng)的獲得

平板劃線分離法

稀釋倒平板法

單孢子或單細胞分離法

利用選擇性培養(yǎng)基分離法

富集培養(yǎng)從自然界中分離到所需的特定微生物特定的環(huán)境條件僅適應(yīng)于該條件的微生物旺盛生長待分離微生物在群落中的數(shù)量大大增加

二、微生物生長的測定評價不同的抗菌物質(zhì)對微生物產(chǎn)生抑制(或殺死)作用的效果；客觀地反映微生物生長的規(guī)律；評價培養(yǎng)條件、營養(yǎng)物質(zhì)等對微生物生長的影響；微生物生長微生物生長測量方法計數(shù)法重量法生理指標法1.計數(shù)法a.直接法利用血球計數(shù)板，在顯微鏡下計算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。缺點：不能區(qū)分死菌與活菌；不適于對運動細菌的計數(shù)；需要相對高的細菌濃度；個體小的細菌在顯微鏡下難以觀察；b.簡接法原理是每個活細菌在適宜的培養(yǎng)基和良好的生長條件下可以通過生長形成菌落。根據(jù)菌懸液的光吸收值能反映出細菌細胞濃度的原理，用濁度計或分光光度計測出細菌懸液的光吸收值，由此計算細菌的細胞數(shù)。C、比濁法2.重量法通過樣品中蛋白質(zhì)、核酸含量的測定間接推算微生物群體的生物量；測定多細胞及絲狀真菌生長情況的有效方法以干重、濕重直接衡量微生物群體的生物量；3.生理指標測定法樣品中微生物數(shù)量多或生長旺盛，這些指標愈明顯，因此可以借助特定的儀器如瓦勃氏呼吸儀、微量量熱計等設(shè)備來測定相應(yīng)的指標。常用于對微生物的快速鑒定與檢測微生物的生理指標，如呼吸強度，耗氧量、酶活性、生物熱等與其群體的規(guī)模成正相關(guān)。三微生物的生長規(guī)律（一）、細菌群體生長規(guī)律

在不補充營養(yǎng)物質(zhì)或移去培養(yǎng)物，保持整個培養(yǎng)液體積不變條件下，以時間為橫坐標，以菌數(shù)為縱坐標，根據(jù)不同培養(yǎng)時間時細菌數(shù)量的變化，可以作出一條反映細菌在整個培養(yǎng)期間菌數(shù)變化規(guī)律的曲線。生長曲線生長曲線可分：延滯期對數(shù)期衰亡期穩(wěn)定期1.延滯期將少量菌種接入新鮮培養(yǎng)基后，在開始一段時間內(nèi)菌數(shù)不立即增加，或增加很少，生長速度接近于零。也稱延遲期、適應(yīng)期。遲緩期的特點：細菌不分裂，菌數(shù)不增加，但細胞內(nèi)合成代謝活躍，胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)的量均增加，細胞體積變大。影響遲緩期的因素：菌種、菌齡、接種量以及接種前后培養(yǎng)基成分的差異等。加入酶激活劑如Mg2+能縮短遲緩期。在工業(yè)發(fā)酵和科研中通常采取一定的措施縮短延滯期：①通過遺傳學(xué)方法改變種的遺傳特性使遲緩期縮短；②利用對數(shù)生長期的細胞作為“種子”；③盡量使接種前后所使用的培養(yǎng)基組成不要相差太大；④適當(dāng)擴大接種量等方式縮短遲緩期，克服不良的影響。2.對數(shù)期

特點：細菌數(shù)量呈對數(shù)增加；生長速度常數(shù)R最大；酶系活躍，細菌代謝旺盛；群體中的細胞化學(xué)組成及形態(tài)、生理特征一致，且細菌的形態(tài)、大小、染色性均典型，對外界環(huán)境因素的作用比較敏感。影響指數(shù)期微生物增代時間的因素菌種；營養(yǎng)成分；營養(yǎng)物的濃度發(fā)酵工業(yè)上盡量延長該期，以達到較高的菌體密度；實驗室研究細菌生物學(xué)性狀和做藥敏試驗選取用對數(shù)期細菌為佳（多數(shù)為8~18h培養(yǎng)的培養(yǎng)物）

特點：

1生長速率常數(shù)R等于02菌體產(chǎn)量達到了最高值

3合成次生代謝產(chǎn)物

4細菌形態(tài)和生理發(fā)生改變，細胞內(nèi)出現(xiàn)儲藏物質(zhì)，芽孢菌內(nèi)開始產(chǎn)生芽孢，G+菌可被染成G-菌。產(chǎn)生原因：

營養(yǎng)物尤其是生長限制因子的耗盡營養(yǎng)物的比例失調(diào)，如碳氮比不合適有害代謝廢物的積累（酸、醇、毒素等）物化條件（pH、氧化還原勢等）不合適通過補充營養(yǎng)物質(zhì)或取走代謝產(chǎn)物或改善培養(yǎng)條件，如對好氧菌進行通氣、攪拌或振蕩等獲得更多的代謝產(chǎn)物3.穩(wěn)定期4.衰亡期特點：

1R為負值

2細胞的形態(tài)發(fā)生變化，出現(xiàn)畸形、菌體變長、腫脹或扭曲

3釋放次生代謝產(chǎn)物，芽孢等

4菌體開始自溶產(chǎn)生原因：

生長條件的進一步惡化，有害代謝產(chǎn)物大量積累，使細胞內(nèi)的分解代謝大大超過合成代謝，繼而導(dǎo)致菌體的死亡研究細菌生長曲線的意義在無菌制劑和輸液的制備時，為減少菌數(shù)的增加，要把滅菌工序放在遲緩期；在大量培養(yǎng)細菌時，選擇適當(dāng)?shù)木N、菌齡、培養(yǎng)基及控制培養(yǎng)條件，以縮短遲緩期；對數(shù)生長期的細菌生長繁殖快，代謝旺盛，利用此時期的細菌作為連續(xù)發(fā)酵的種子；實驗室工作中，多采用對數(shù)期的細菌進行細菌形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理代謝等方面的研究。穩(wěn)定期時細菌代謝產(chǎn)特增多并達到最大，發(fā)酵工業(yè)上，為獲得更多的代謝產(chǎn)物如：氨基酸、抗生素等，適當(dāng)補充營養(yǎng)物，延長穩(wěn)定期；形成芽孢的細菌，選擇衰退期作為保藏菌種。四、細菌的新陳代謝

新陳代謝：發(fā)生在活細胞中的各種分解代謝（catabolism）和合成代謝（anabolism）的總和。 新陳代謝=分解代謝+合成代謝

分解代謝：指復(fù)雜的有機物分子通過分解代謝酶系的催化，產(chǎn)生簡單分子、腺苷三磷酸（ATP）形式的能量和還原力的作用。

合成代謝：指在合成代謝酶系的催化下，由簡單小分子、ATP形式的能量和還原力一起合成復(fù)雜的大分子的過程。按物質(zhì)轉(zhuǎn)化方式分分解代謝：指細胞將大分子物質(zhì)降解成小分子物質(zhì)，并在這個過程中產(chǎn)生能量。合成代謝：是指細胞利用簡單的小分子物質(zhì)合成復(fù)雜大分子的過程。在這個過程中要消耗能量。物質(zhì)代謝：物質(zhì)在體內(nèi)轉(zhuǎn)化的過程.能量代謝：伴隨物質(zhì)轉(zhuǎn)化而發(fā)生的能量形式相互轉(zhuǎn)化.按代謝產(chǎn)物在機體中作用不同分：初級代謝：提供能量、前體、結(jié)構(gòu)物質(zhì)等生命活動所必須的代謝物的代謝類型；產(chǎn)物：氨基酸、核苷酸等.次級代謝：在一定生長階段出現(xiàn)非生命活動所必需的代謝類型；產(chǎn)物：抗生素、色素、激素、生物堿等（一）、微生物的能量代謝能量代謝是新陳代謝中的核心問題。中心任務(wù)：把外界環(huán)境中的各種初級能源轉(zhuǎn)換成對一切生命活動都能使用的能源——ATP。

有機物最初能源 日光 通用能源 還原態(tài)無機物化能自養(yǎng)菌化能異養(yǎng)菌光能營養(yǎng)菌生物氧化的功能：產(chǎn)能(ATP)產(chǎn)還原力【H】小分子中間代謝物底物脫氫的途徑

1、EMP途徑

2、HMP3、ED4、TCAⅡ、遞氫、受氫和ATP的產(chǎn)生★根據(jù)遞氫特別是受氫過程中氫受體性質(zhì)的不同,把微生物能量代謝分為呼吸作用和發(fā)酵作用兩大類.發(fā)酵作用：沒有任何外援的最終電子受體的生物氧化模式；呼吸作用：有外援的最終電子受體的生物氧化模式；★呼吸作用又可分為兩類：

有氧呼吸——最終電子受體是分子氧O2;

無氧呼吸——最終電子受體是O2以外的無機氧化物，如NO3-、SO42-等.概念:是以分子氧作為最終電子(或氫)受體的氧化過程；是最普遍、最重要的生物氧化方式。途徑：EMP,TCA循環(huán)特點：必須指出，在有氧呼吸作用中，底物的氧化作用不與氧的還原作用直接偶聯(lián)，而是底物在氧化過程中釋放的電子先通過電子傳遞鏈（由各種電子傳遞體，如NAD,FAD,輔酶Q和各種細胞色素組成）最后才傳遞到氧。1、有氧呼吸2、無氧呼吸某些厭氧和兼性厭氧微生物在無氧條件下進行無氧呼吸；無氧呼吸的最終電子受體不是氧，而是NO3-、NO2-、SO42-、S2O32-、CO2等無機物，或延胡索酸（fumarate）等有機物。由于部分能量隨電子轉(zhuǎn)移傳給最終電子受體，所以生成的能量不如有氧呼吸產(chǎn)生的多。☆概念：在生物氧化中發(fā)酵是指無氧條件下，底物脫氫后所產(chǎn)生的還原力不經(jīng)過呼吸鏈傳遞而直接交給一內(nèi)源氧化性中間代謝產(chǎn)物的一類低效產(chǎn)能反應(yīng)。在發(fā)酵工業(yè)上，發(fā)酵是指任何利用厭氧或好氧微生物來生產(chǎn)有用代謝產(chǎn)物的一類生產(chǎn)方式?！畎l(fā)酵途徑：葡萄糖在厭氧條件下分解葡萄糖的產(chǎn)能途徑主要有EMP、HMP、ED和PK途徑。3、發(fā)酵作用五、微生物的代謝調(diào)控微生物代謝過程中的自我調(diào)節(jié)酶活性的調(diào)節(jié)酶合成的調(diào)節(jié)☆微生物自我調(diào)節(jié)代謝的方式1.控制營養(yǎng)物質(zhì)透過細胞膜進入細胞如：只有當(dāng)速效碳源或氮源耗盡時，微生物才合成遲效碳源或氮源的運輸系統(tǒng)與分解該物質(zhì)的酶系統(tǒng)。2.通過酶的定位控制酶與底物的接觸3.控制代謝物流向:

（一）、酶活性的調(diào)節(jié)通過改變現(xiàn)成的酶分子活性來調(diào)節(jié)新陳代謝的速率的方式。是酶分子水平上的調(diào)節(jié)，屬于精細的調(diào)節(jié)。（一）調(diào)節(jié)方式：包括兩個方面：1、酶活性的激活：在代謝途徑中后面的反應(yīng)可被較前面的反應(yīng)產(chǎn)物所促進的現(xiàn)象；常見于分解代謝途徑。如：粗糙脈孢霉的異檸檬酸脫氫酶的活性受檸檬酸促進2、酶活性的抑制：包括：競爭性抑制和反饋抑制。概念：反饋：指反應(yīng)鏈中某些中間代謝產(chǎn)物或終產(chǎn)物對該途徑關(guān)鍵酶活性的影響。

凡使反應(yīng)速度加快的稱正反饋；凡使反應(yīng)速度減慢的稱負反饋（反饋抑制）；反饋抑制——主要表現(xiàn)在某代謝途徑的末端產(chǎn)物過量時可反過來直接抑制該途徑中第一個酶的活性。主要表現(xiàn)在氨基酸、核苷酸合成途徑中。特點：作用直接、效果快速、末端產(chǎn)物濃度降低時又可解除1.直線式代謝途徑中的反饋抑制： 蘇氨酸脫氨酶蘇氨酸 α-酮丁酸 異亮氨酸 反饋抑制 其它實例：谷氨酸棒桿菌的精氨酸合成2.分支代謝途徑中的反饋抑制：在分支代謝途徑中，反饋抑制的情況較為復(fù)雜，為了避免在一個分支上的產(chǎn)物過多時不致同時影響另一分支上產(chǎn)物的供應(yīng)，微生物發(fā)展出多種調(diào)節(jié)方式。主要有：同功酶的調(diào)節(jié)，順序反饋，協(xié)同反饋，積累反饋調(diào)節(jié)等。（二）反饋抑制的類型（1）、同功酶調(diào)節(jié)——isoenzyme定義：催化相同的生化反應(yīng)，而酶分子結(jié)構(gòu)有差別的一組酶。意義：在一個分支代謝途徑中，如果在分支點以前的一個較早的反應(yīng)是由幾個同功酶催化時，則分支代謝的幾個最終產(chǎn)物往往分別對這幾個同功酶發(fā)生抑制作用?！骋划a(chǎn)物過量僅抑制相應(yīng)酶活，對其他產(chǎn)物沒影響。舉例：大腸桿菌的天冬氨酸族氨基酸合成的調(diào)節(jié)（2）、協(xié)同反饋抑制定義：分支代謝途徑中幾個末端產(chǎn)物同時過量時才能抑制共同途徑中的第一個酶的一種反饋調(diào)節(jié)方式。舉例：谷氨酸棒桿菌（Corynebacteriumglutamicum） 多粘芽孢桿菌（Bacilluspolymyxa） 天冬氨酸族氨基酸合成中天冬氨酸激酶受賴氨酸和蘇氨酸的協(xié)同反饋抑制和阻遏。（3）、合作反饋抑制定義：兩種末端產(chǎn)物同時存在時，共同的反饋抑制作用大于二者單獨作用之和。舉例：在嘌呤核苷酸合成中，磷酸核糖焦磷酸酶受AMP和GMP（和IMP）的合作反饋抑制，二者共同存在時，可以完全抑制該酶的活性。而二者單獨過量時，分別抑制其活性的70%和10%。（4）積累反饋抑制定義：每一分支途徑末端產(chǎn)物按一定百分比單獨抑制共同途徑中前面的酶，所以當(dāng)幾種末端產(chǎn)物共同存在時它們的抑制作用是積累的，各末端產(chǎn)物之間既無協(xié)同效應(yīng)，亦無拮抗作用。Try16%CTP14%氨甲酰磷酸

13%AMP41%……積累反饋抑制——E.coli谷氨酰胺合成酶的調(diào)節(jié)（5）順序反饋抑制一種終產(chǎn)物的積累,導(dǎo)致前一中間產(chǎn)物的積累，通過后者反饋抑制合成途徑關(guān)鍵酶的活性，使合成終止。舉例：枯草芽孢桿菌芳香族氨基酸合成的調(diào)節(jié)（三）、酶活力調(diào)節(jié)的機制變構(gòu)酶理論：變構(gòu)酶為一種變構(gòu)蛋白，酶分子空間構(gòu)象的變化影響酶活。其上具有兩個以上立體專一性不同的接受部位，一個是活性中心，另一個是調(diào)節(jié)中心。活性位點:與底物結(jié)合變構(gòu)位點:與抑制劑結(jié)合,構(gòu)象變化,不能與底物結(jié)合與激活劑結(jié)合,構(gòu)象變化,促進與底物結(jié)合

變構(gòu)酶（四）、酶合成的調(diào)節(jié)通過調(diào)節(jié)酶的合成量進而調(diào)節(jié)代謝速率的調(diào)節(jié)機制，是基因水平上的調(diào)節(jié)，屬于粗放的調(diào)節(jié)，間接而緩慢。1.誘導(dǎo)(induction)：是酶促分解底物或產(chǎn)物誘使微生物細胞合成分解代謝途徑中有關(guān)酶的過程。微生物通過誘導(dǎo)作用而產(chǎn)生的酶稱為誘導(dǎo)酶（為適應(yīng)外來底物或其結(jié)構(gòu)類似物而臨時合成的酶類）。

舉例：E.coli在含乳糖的培養(yǎng)基中合成β-半乳糖苷酶和半乳糖苷滲透酶等。誘導(dǎo)物(inducer)：底物或結(jié)構(gòu)類似物，如：異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）；

★誘導(dǎo)作用的類型：同時誘導(dǎo)：誘導(dǎo)物加入后，微生物能同時誘導(dǎo)出幾種酶的合成，主要存在于短的代謝途徑中。順序誘導(dǎo)：先合成能分解底物的酶，再合成分解各中間代謝物的酶達到對復(fù)雜代謝途徑的分段調(diào)節(jié)。組成酶（固有酶）：不依賴底物或底物結(jié)構(gòu)類似物的存在而合成的酶。如：EMP途徑的一些酶。誘導(dǎo)酶：依賴于底物或底物結(jié)構(gòu)類似物的存在而合成的酶。如：乳糖酶。

是阻礙代謝過程中包括關(guān)鍵酶在內(nèi)的一系列酶的合成的現(xiàn)象，從而更徹底地控制和減少末端產(chǎn)物的合成。①末端產(chǎn)物阻遏（end-productrepression）：由于終產(chǎn)物的過量積累而導(dǎo)致生物合成途徑中酶合成的阻遏的現(xiàn)象，常常發(fā)生在氨基酸、嘌呤和嘧啶等這些重要產(chǎn)物生物合成的時候。例如過量的精氨酸阻遏了參與合成精氨酸的許多酶的合成。2.阻遏（repression）②分解代謝物阻遏（cataboliterepression）：當(dāng)微生物在含有兩種能夠分解底物的培養(yǎng)基中生長時，利用快的那種分解底物會阻遏利用慢的底物的有關(guān)酶的合成的現(xiàn)象。最早發(fā)現(xiàn)于大腸桿菌生長在含葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基時,故又稱葡萄糖效應(yīng)。分解代謝物阻遏導(dǎo)致出現(xiàn)“二次生長（diauxicgrowth）”.直接作用者是優(yōu)先利用的碳源的中間代謝物——實質(zhì)是：因代謝反應(yīng)鏈中某些中間代謝物或末端代謝物的過量積累而阻遏代謝中一些酶的合成的現(xiàn)象。

二次生長：細菌對不同營養(yǎng)物質(zhì)的利用能力是不同的，有的可以直接被利用，如葡萄糖或NH4+，有的需要過一段時間才能被吸收利用，如乳糖或魚粉等。當(dāng)培養(yǎng)基中同時含有兩類碳源或氮源時，細菌生在生長過程中就會出現(xiàn)二次生長現(xiàn)象。（五）、代謝的人工控制及其在發(fā)酵工業(yè)中的應(yīng)用工業(yè)發(fā)酵的目的：大量積累人們所需要的微生物代謝產(chǎn)物。代謝的人工控制：人為地打破微生物的代謝控制體系，使代謝朝著人們希望的方向進行。人工控制代謝的手段：

改變微生物遺傳特性(遺傳學(xué)方法）；控制發(fā)酵條件（生物化學(xué)方法）；改變細胞膜透性；（1）對于直線式代謝途徑：選育營養(yǎng)缺陷性突變株只能積累中間代謝產(chǎn)物

AaBbCcDdE

（1）營養(yǎng)缺陷型菌株的應(yīng)用

末端產(chǎn)物E對生長乃是必需的，所以，應(yīng)在培養(yǎng)基中限量供給E，使之足以維持菌株生長，但又不至于造成反饋調(diào)節(jié)（阻遏或抑制），這樣才能有利于菌株積累中間產(chǎn)物C。1.遺傳學(xué)方法（2）、抗反饋控制突變株的應(yīng)用★抗反饋控制突變株——是指對反饋抑制不敏感或?qū)ψ瓒粲锌剐裕騼烧呒嬗兄木??！锟狗答伩刂仆蛔冎昕梢詮慕K產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株和營養(yǎng)缺陷性回復(fù)突變株中獲得?！铽@得方法及其原理：目標產(chǎn)