PCR的原理與應(yīng)用

第二章PCR技術(shù)的原理及應(yīng)用2021/7/11故事發(fā)生在1983年

的春夏之交2021/7/12KaryB.Mullis(1944-)，在Cetus公司工作期間，發(fā)明了PCR。他原本是要合成DNA引物來進(jìn)行測序工作，卻常為沒有足夠多的模板DNA而煩惱。1983年春夏之交的一個(gè)晚上，他開車去鄉(xiāng)下別墅的路上萌發(fā)了用兩個(gè)引物（而不是一個(gè)引物）去擴(kuò)增模板DNA的想法…...很少有在公司工作的科研人員得

諾貝爾獎，Mullis是其中之一2021/7/13Mullis開車的時(shí)候,瞬間感覺兩排路燈就是DNA的兩條鏈，自己的車和對面開來的車象是DNA聚合酶，面對面地合成著DNA，……2021/7/14Mullis的第一個(gè)PCR實(shí)驗(yàn)1983年9月中旬。

Mullis在反應(yīng)體系中加入DNA聚合酶后在37

℃一直保溫。結(jié)果第二天在瓊脂糖電泳上沒有看到任何條帶。于是他認(rèn)識到有必要用加熱來解鏈，每次解鏈后再加入DNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)，依次循環(huán)。1983年12月，他終于看到了被同位素標(biāo)記的PCR條帶。2021/7/152021/7/16第一種高溫菌DNA聚合酶的分離美國黃石國家公園2021/7/17Thermusaquaticus2021/7/18TheThermusaquaticusDNApolymeraseTaqNotpermanentlydestroyedat94oCOptimaltemperatureis72oC2021/7/19耐高溫DNA聚合酶的種類TaqDNA聚合酶(Thermusaquaticus，Cetus/Roche)TthDNA聚合酶(Thermusthermophilus，Toyobo)PfuDNA聚合酶（Pyrococcusfuriosus，Stratagene）Deep

VentDNA聚合酶

(Bio-labs）

TflDNA聚合酶（Thermusflavus，Promega)TliDNA聚合酶(Thermococcuslitoralis，Promega)VentDNA聚合酶

(Bio-labs）

PwoDNA聚合酶(Pyrococcuswoesei，Roche)PfxDNA聚合酶

(Thermococcuskodakaraensis,Invitrogen)DynazymeDNA聚合酶（Thermusbrockianus，F(xiàn)innazyme）FDDNA聚合酶(Thermussterophilus？，復(fù)旦大學(xué))Tma,Tne,KOD,……2021/7/110PCR儀器的變遷三個(gè)水浴鍋，用手移動（Mullis等人當(dāng)時(shí)用的）電加熱塊＋自來水冷卻（PE，1988）電加熱塊＋內(nèi)置循環(huán)液冷卻（PE，1989）三個(gè)加熱塊＋機(jī)械手（Stratagene，1994）半導(dǎo)體制冷和加熱（MJ,PE,BioMetra,Eppendrof）溫度梯度,熒光檢測(如Roche的Lightcycler)風(fēng)加熱Lab-on-chip式的PCR儀(所謂的芯片PCR)中國的狀況1991年出現(xiàn)三個(gè)水浴鍋+機(jī)械手的原始PCR儀（華美，復(fù)日等）現(xiàn)在以半導(dǎo)體（Peltier板）制冷式為主（杭州博日,上海天呈,廈門安普利等）2021/7/111PCR的發(fā)展史1983年春，Mullis發(fā)展出PCR的概念；1983年9月，Mullis用大腸桿菌DNA聚合酶做了第一個(gè)PCR實(shí)驗(yàn)，只用一個(gè)循環(huán)；1983年12月，用同位素標(biāo)記法看到了10個(gè)循環(huán)后的49bp長度的第一個(gè)PCR片斷；1985年12月20日，Mullis的同事Saiki在Science上發(fā)了一篇論文，方法中用了PCR技術(shù)，導(dǎo)致Mullis的文章到處被拒；1985年10月25日申請了PCR的專利，1987年7月28日批準(zhǔn)（專利號4,683,202），這回Mullis是第一發(fā)明人。1986年5月，Mullis在冷泉港實(shí)驗(yàn)室做專題報(bào)告，全世界從此開始學(xué)習(xí)PCR的方法；1986年6月，Cetus公司純化了第一種高溫菌DNA聚合酶，TaqDNApolymerase，這是85年春天Mullis建議做的；1988年，第一臺PCR儀問世；1991年，HoffmanLaRoche以3億美元的代價(jià)從Cetus公司獲得全權(quán)開發(fā)權(quán)。2021/7/112PCR不只是一個(gè)方法改進(jìn)Mullis的上司有句“名言”，“我們要擴(kuò)增這么多DNA樣品有什么用”；到了1991，Cetus公司以3億美元的轉(zhuǎn)讓費(fèi)將PCR相關(guān)專利轉(zhuǎn)讓給瑞士HoffmanLaRoche公司，并在此后的經(jīng)營中又獲得了數(shù)億美元的分紅；Mullis于1993年獲得諾貝爾化學(xué)獎，PCR和DNA重組技術(shù)一樣意義深遠(yuǎn)。2021/7/113PCR相關(guān)的術(shù)語和產(chǎn)品層出不窮T-vectorHotStartTaqRT-PCRRAPD-PCRDDRT-PCRLM-PCRInversePCRNestedPCRReal-timePCRRACEFlowchipPCRTASMultiplexPCRImmunoPCRAsymmetricPCRLP-PCRNASBARecombinantPCRAFLPSSCPInsituPCRTaqMan/SYBRgreen2021/7/114

1stcycle2ndcycle3rdcycle過程變性引物退火DNA復(fù)制（一）PCR的基本原理2021/7/115（二）PCR的種類

1.普通PCR2021/7/116PCR瓊脂糖凝膠電泳最終產(chǎn)物紫外光觀察3-4小時(shí)2021/7/117PCR具有極高的靈敏度樣品正對照負(fù)對照標(biāo)準(zhǔn)分子量污染是PCR實(shí)驗(yàn)的常見問題。只要實(shí)驗(yàn)室里曾經(jīng)擴(kuò)增過某個(gè)片段，就有可能以后的實(shí)驗(yàn)中發(fā)生污染。因此，做實(shí)驗(yàn)的時(shí)候絕對不要忘了負(fù)對照。用紫外燈破壞污染物也是一個(gè)辦法2021/7/118（二）PCR的種類2.RT-PCR：反轉(zhuǎn)錄PCR(reversetranscriptase-PCR)原理：RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用從RNA合成cDNA，再以cDNA為模板，擴(kuò)增合成目的片段。特點(diǎn)：作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物。無論使用何種RNA，關(guān)鍵是確保RNA中無RNA酶和基因組DNA的污染。用于反轉(zhuǎn)錄的引物可視實(shí)驗(yàn)的具體情況選擇隨機(jī)引物、Oligo

dT

及基因特異性引物(GSP)中的一種。對于短的不具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的真核細(xì)胞mRNA，三種都可。應(yīng)用：RT-PCR技術(shù)靈敏而且用途廣泛，分析基因的轉(zhuǎn)錄水平，細(xì)胞中RNA病毒的含量，直接克隆特定基因的cDNA序列。2021/7/119兩步法RT-PCR示意圖一步法RT-PCR示意圖2021/7/120兩步法RT-PCR一步法RT-PCR起始第一鏈cDNA合成使用：起始第一鏈合成使用Oligo(dT)，隨機(jī)六聚體，GSP引物GSP引物優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)?靈活?方便引物選擇擴(kuò)增酶同逆轉(zhuǎn)錄酶預(yù)先混合擴(kuò)增酶的選擇轉(zhuǎn)管步驟少，減少污染可能性?困難RT-PCR的優(yōu)化能力?高靈敏度?適用于在單個(gè)樣品中檢測幾個(gè)mRNA?適用于大量樣品分析一步法和兩步法RT-PCR的比較2021/7/121EcoRI寡聚(dT)12-18隨機(jī)6堿基引物R6寡聚(dT)12-18隨機(jī)6堿基引物R6mRNA(A)n(T)12-18(A)n(A)n(T)12-18R6R6R6R6R6R6第二鏈合成(A)n(T)12-18(A)nR6R6R6R6R6R6(A)n(T)12-18EcoRI加上EcoRI接頭，磷酸化，cDNA分級cDNA合成完畢，準(zhǔn)備連接第一鏈合成cDNA合成過程示意圖2021/7/122cDNA序列的克隆2021/7/123（二）PCR的種類2.NestedPCR：巢式PCR原理：利用兩套PCR引物（巢式引物）對進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)。在第一輪擴(kuò)增中，外引物用以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物，此產(chǎn)物在內(nèi)引物的存在下進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。優(yōu)點(diǎn)：由于巢式PCR反應(yīng)有兩次PCR擴(kuò)增，從而降低了擴(kuò)增多個(gè)靶位點(diǎn)的可能性（因?yàn)榕c兩套引物都互補(bǔ)的引物很少）增加了檢測的敏感性；兩對PCR引物與檢測模板的配對，增加了檢測的可靠性；增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的靈敏度，并且提高了困難PCR（如5'RACE）的特異性。應(yīng)用：一般應(yīng)用于動物方面。如：病毒，梅毒螺旋體，HIV，腫瘤基因等。2021/7/124NestedPCR原理示意圖FirstPCRSecondPCR2021/7/125（二）PCR的種類3.InversePCR：反向PCR原理：用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切裂解含核心區(qū)的DNA，以產(chǎn)生適合于PCR擴(kuò)增大小的片段，然后片段的末端再連接形成環(huán)狀分子。PCR的引物同源于環(huán)上核心區(qū)的末端序列，但其方向可使鏈的延長經(jīng)過環(huán)上的未知區(qū)而不是分開引物的核心區(qū)。這種反向PCR方法可用于擴(kuò)增本來就在核心區(qū)旁邊的序列，還可應(yīng)用于制備未知序列探針或測定邊側(cè)區(qū)域本身的上、下游序列。

優(yōu)點(diǎn)：可使已知序列的核心區(qū)邊側(cè)的未知DNA成幾何級數(shù)擴(kuò)增。應(yīng)用：一般應(yīng)用于未知序列的擴(kuò)增，有時(shí)也用于定點(diǎn)突變。2021/7/126InversePCR原理示意圖2021/7/127（二）PCR的種類4.PCR-RFLP:

多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)-限制性片段長度多態(tài)性

(restrictionfragmentlengthPolymorphism，RFLP)

原理：PCR產(chǎn)物－限制性內(nèi)切酶切－多態(tài)性分析，DNA發(fā)生重排后，酶切位點(diǎn)發(fā)生改變。

優(yōu)點(diǎn)：具有分辯率高，無需標(biāo)記,重復(fù)性好，簡便快速直觀等。主要用于核酸變異性分析與比較,微生物的分群分型分亞型，癌基因分析，遺傳病的診斷等。

局限：只能應(yīng)用突變引起限制性酶切位點(diǎn)改變的情況下，一次只能完成一個(gè)特定位點(diǎn)突變篩選，檢測效率低。2021/7/128PCR-RFLP原理示意圖2021/7/1295.PCR-SSCP：聚合酶鏈反應(yīng)一單鏈構(gòu)象多態(tài)性(singlestrandconformationpolymorphism)原理：是將經(jīng)擴(kuò)增的DNA片段經(jīng)過變性處理，形成單鏈，由于序列不同，單鏈構(gòu)象就有差異，在中性聚丙烯酰胺凝膠中電泳的遷移率不同，通過與標(biāo)準(zhǔn)物的對比，即可檢測出有無變異。特點(diǎn)：剛建立時(shí)是將同位素?fù)饺隤CR擴(kuò)增的產(chǎn)物中，通過放射自顯影顯示結(jié)果。后用銀染取代同位素顯示DNA帶型，大大降低了成本，具有經(jīng)濟(jì)、快速、靈敏等特點(diǎn)。1993年起用EB染色法顯示DNA帶型。優(yōu)點(diǎn)：檢測基因變異，具有操作簡便、快速、不需特殊設(shè)備，適用于大樣本篩選。己廣泛應(yīng)用于檢測各種病原體基因的點(diǎn)突變及缺失突變，基因的多態(tài)性分析等。（一）PCR的種類2021/7/130PCR-SSCP示意圖2021/7/131從定性到定量的革命2021/7/132聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)可對特定核苷酸片斷進(jìn)行指數(shù)級的擴(kuò)增。在擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束之后，我們可以通過凝膠電泳的方法對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定性的分析，也可以通過放射性核素?fù)饺霕?biāo)記后的光密度掃描來進(jìn)行定量的分析。無論定性還是定量分析，分析的都是PCR終產(chǎn)物。但是在許多情況下，我們所感興趣的是未經(jīng)PCR信號放大之前的起始模板量。例如我們想知道某一轉(zhuǎn)基因動植物轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)或者某一特定基因在特定組織中的表達(dá)量。在這種需求下熒光定量PCR技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。普通PCR定量分析的困惑2021/7/133PCR產(chǎn)物生成曲線log[DNA]Cycles2021/7/134log[DNA]Cycles不同樣品有不同的生成曲線2021/7/135實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，使每一個(gè)循環(huán)變得“可見”，最后通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對樣品中的DNA(orcDNA)的起始濃度進(jìn)行定量的方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是目前確定樣品中DNA(或cDNA)拷貝數(shù)最敏感、最準(zhǔn)確的方法。2021/7/136RealTimePCRandConventionalPCRVS2021/7/1375’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’5’TaqTaq5’3’RepeatDenaturationPrimerAnnealingElongation常規(guī)PCR

ProcessIntheory,productaccumulationisproportionalto2n,wherenisthenumberofamplificationcyclerepeats2021/7/138Realityvs.TheoryAmplificationisexponential,buttheexponentialincreaseislimited:AlinearincreasefollowsexponentialEventuallyplateausTheoreticalRealLifeLogTargetDNA2021/7/139定量的最佳時(shí)期Quantitativeinformationcomesfrommonitoringtheearlystagesofamplification.RealLifeDetectorTheoreticalLogTargetDNACycle#2021/7/140普通PCR和熒光定量PCR的區(qū)別常規(guī)PCR是通過電泳對擴(kuò)增反應(yīng)的最終產(chǎn)物進(jìn)行定性分析（定量不準(zhǔn)確），無法進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測；熒光定量PCR是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，使每一個(gè)循環(huán)變得“可見”，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對樣品中的DNA(orcDNA)的起始濃度進(jìn)行定量的方法（準(zhǔn)確定量）。2021/7/141普通PCR和定量PCR的區(qū)別適用定性分析，不適合定量分析；PCR產(chǎn)物的長度從100bp－數(shù)kb實(shí)時(shí)檢測:每個(gè)循環(huán)都產(chǎn)出熒光信號絕對定量，靈敏度更高PCR產(chǎn)物的長度一般在60-150bps2021/7/142熒光定量PCR的原理基本原理：擴(kuò)增呈指數(shù)增長，在反應(yīng)體系和條件完全一致的情況下，樣本DNA含量與擴(kuò)增產(chǎn)物的對數(shù)成正比。由于反應(yīng)體系中的熒光染料或熒光標(biāo)記物(熒光探針)與擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合發(fā)光，其熒光量與擴(kuò)增產(chǎn)物量成正比。因此，通過熒光量的檢測就可以測定樣本核酸量。熒光化合物分為兩類（1）非特異性的嵌入熒光染料：利用嵌入熒光染料檢測，只是簡單地反映PCR反應(yīng)體系中總的核酸量，是一種非特異性的檢測方法。（2）特異性熒光(引物)探針：增加了探針的識別步驟,特異性、專一性更高。2021/7/143非特異性的嵌入熒光染料

（Non-specificDNAbindingdyes）SYBR?GreenISYBR?GoldEthidiumBromide2021/7/144Real-TimePCR，SYBRgreenCycle1Cycle3Cycle2MolecularProbe公司的一個(gè)專利產(chǎn)品，USPatent5,436,134

1993年7月12日申請2021/7/145SYBRgreen的優(yōu)缺點(diǎn)簡便可以使用已有的引物普遍通用可以檢測所有的雙鏈DNA，包括引物二聚體；需要化大力氣優(yōu)化反應(yīng)條件，以消除非特異性擴(kuò)增；價(jià)格

$1/PCR反應(yīng)定量的靈敏度有所欠缺2021/7/146Extension5’3’5’3’5’3’5’3’ExtensionContinuedApplyExcitationWavelength5’3’5’3’5’5’TaqTaq3’5’3’TaqTaq5’5’RepeatDNAbindingdyesBDBDBDBDBDBDBDBDBDBDlllll2021/7/147特異性的熒光探針特異性的熒光探針是把熒光化合物標(biāo)記到特異性的寡核苷酸上形成熒光標(biāo)記的DNA探針。通過探針與PCR產(chǎn)物特異性的結(jié)合,在PCR過程中可對產(chǎn)物實(shí)現(xiàn)均相、實(shí)時(shí)、定量檢測,也適用于多通道檢測。TaqMan探針2021/7/148定量PCR，TaqMan體系A(chǔ)BI公司首先推出(PRISM7000系列)USPatent5,723,591,

1995年11月申請。實(shí)時(shí)檢測:每個(gè)循環(huán)都會產(chǎn)生與PCR產(chǎn)物成正比的熒光物質(zhì)2021/7/149TaqMan探針是一段5’端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)(R),3’端標(biāo)記淬滅熒光基團(tuán)(Q)的寡核苷酸,其序列與模板DNA中的一段完全互補(bǔ)。當(dāng)探針單獨(dú)存在時(shí),由于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的發(fā)生,R的熒光受到Q的猝滅。在PCR過程中,由于TaqDNA酶的5’-3’外切酶活性的作用,使探針的5’端的R被切斷,加大了與Q的距離而使熒光恢復(fù)。一分子的產(chǎn)物生成就伴隨著一分子的熒光信號的產(chǎn)生。隨著擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的增加,釋放出來的熒光基團(tuán)不斷積累。因此,Taqman探針檢測的是積累熒光。2021/7/150Cleavage-basedassay:TaqManTM5’5’3’3’d.NTPsThermalStableDNAPolymerasePrimers5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’AddMasterMixandSampleDenaturation5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’AnnealingReactionTubeTaql5’3’RQProbe5’3’RQ2021/7/1515’3’5’3’5’3’RQExtensionStep5’3’1.StrandDisplacementTaq3’QR5’5’3’3’QTaqR5’2.Cleavage3.PolymerizationComplete5’3’QTaqR3’5’4.Detection5’3’3’QTaqR5’lRCleavage-basedassay:TaqManTM2021/7/152Cycle一般而言，熒光擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號階段,熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴(kuò)增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，我們無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加。PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，所以根據(jù)最終的PCR產(chǎn)物量不能計(jì)算出起始DNA拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段，PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。

為了定量和比較的方便，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念：熒光閾值和CT值。熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，但一般我們將熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為CT值。2021/7/153CtvalueandReal-TimeQuantitativePCRTheoryCt值(ThresholdCycle)

PCR擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物熒光信號超過基線值（進(jìn)入指數(shù)增長期）時(shí)的循環(huán)數(shù)。2021/7/154principleofquantitativereal-timePCR…

use

when

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howmuchfluorescentsignal

PCRcycles

Low

(highcopyno.)HighCT

(lowcopyno.)real-timePCRamplificationplots(7x10-folddilns.+NTC)Endpoi