《包裝飲用水中銅綠假單胞菌的快速檢測(cè)方法》

ICS67.160.20

CCSX51

團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

T/CBIA0XX—20XX

包裝飲用水中銅綠假單胞菌的

快速檢測(cè)方法

（征求意見稿）

202X-XX-XX發(fā)布202X-XX-XX實(shí)施

中國飲料工業(yè)協(xié)會(huì)發(fā)布實(shí)施

T/CBIA0XX—202X

包裝飲用水中銅綠假單胞菌的快速檢測(cè)方法

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了包裝飲用水中銅綠假單胞菌的快速定性檢測(cè)方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于包裝飲用水銅綠假單胞菌的檢驗(yàn)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引

用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修

改單）適用于本文件。

GB4789.1食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)總則

GB8537-2018食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)飲用天然礦泉水

GB8538食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)飲用天然礦泉水檢驗(yàn)方法

GB19298-2014食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)包裝飲用水

3原理

銅綠假單胞菌是專性需氧微生物，液體培養(yǎng)基組合振蕩培養(yǎng)的方式可以為銅綠假單胞菌提供

充分的營養(yǎng)條件和氧氣環(huán)境，通過測(cè)量培養(yǎng)液濁度可以客觀、便捷地識(shí)別微生物的生長狀態(tài)。萘

啶酮酸等抗生素具有一定選擇性，可抑制銅綠假單胞菌外的革蘭氏陰性菌生長。對(duì)培養(yǎng)液劃線分

離純化菌落后，通過綠膿菌素試驗(yàn)、產(chǎn)氨試驗(yàn)等技術(shù)，可以對(duì)疑似菌進(jìn)行鑒定。

GB19298-2014、GB8537-2018對(duì)銅綠假單胞菌的限量要求是0CFU/250mL，本方法采

用250mL等量定性檢測(cè)，未檢出/250mL的檢測(cè)結(jié)果可等同于0CFU/250mL檢測(cè)結(jié)果下作出

的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)論。

4定義

CN本底濁度值CNbackgroundNTU

多次試驗(yàn)陰性對(duì)照樣濁度的平均值。

因萘啶酮酸不易溶于水，故含有萘啶酮酸的CN液體培養(yǎng)基呈現(xiàn)微渾濁狀態(tài)。在培養(yǎng)過程中，

具有孔狀結(jié)構(gòu)的濾膜會(huì)改變CN液體培養(yǎng)基的濁度，故將陰性對(duì)照的濁度定義為CN本底濁度。

5實(shí)驗(yàn)室要求

應(yīng)符合GB4789.1中2實(shí)驗(yàn)室基本要求的規(guī)定。

6設(shè)備和材料

1

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除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其它設(shè)備和材料要求如下：

6.1膜過濾系統(tǒng)。

6.2無菌濾杯。

6.3無菌平頭無齒鑷子。

6.4無菌濾膜：微孔薄膜，直徑47mm或50mm，孔徑0.45μm。

6.5無菌錐形瓶及配套透氣瓶塞：容積100mL。

6.6恒溫振蕩培養(yǎng)箱：溫度36℃±1℃，轉(zhuǎn)速150rpm。

6.7濁度計(jì)及配套比色管：測(cè)量范圍宜0～200NTU。

6.8紫外燈檢測(cè)器：波長360nm±20nm。

7培養(yǎng)基和試劑

7.1CN液體培養(yǎng)基：見A.1。

7.2無菌水：經(jīng)121℃滅菌15min的純水。

7.3CN瓊脂：見A.2。

8檢驗(yàn)程序

檢驗(yàn)程序見圖1。

水樣過濾：將250mL水樣過濾至濾膜

轉(zhuǎn)膜：將濾膜轉(zhuǎn)移至CN液體培養(yǎng)基中

培養(yǎng)：36℃±1℃，150rpm，24h

濁度辨別

肉眼觀察肉眼觀察

無明顯微生物繁殖樣品濁度有明顯微生物繁殖

＞1.5倍陰性對(duì)照濁度

濁度測(cè)量劃線分離可疑菌落

樣品濁度

≤1.5倍陰性對(duì)照濁度

銅綠假單胞菌陰性按照GB8538或其它方法進(jìn)行確證

結(jié)果報(bào)告

圖1檢驗(yàn)程序

9操作步驟及報(bào)告

9.1樣品消毒處理

2

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用75%酒精等消毒劑對(duì)樣品包裝容器充分擦拭消毒后傳入潔凈室，去除大包裝水樣品的帽標(biāo)

等塑料包裝，再次用75%酒精等消毒劑對(duì)包裝容器口蓋處、外壁等充分擦拭消毒。

9.2初篩培養(yǎng)

9.2.1滅菌并組裝過濾系統(tǒng)

在100級(jí)潔凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行無菌操作。將膜過濾系統(tǒng)過濾頭滅菌并降溫后，用無菌平頭無齒

鑷子夾取無菌濾膜的邊緣部分，將濾膜網(wǎng)格面向上，貼放在已滅菌的過濾頭濾床面上，將無菌濾

杯固定到已貼好濾膜的過濾頭上。

9.2.2水樣采集

對(duì)于小瓶包裝水，直接在100級(jí)的潔凈工作臺(tái)內(nèi)倒取250mL水樣至無菌濾杯內(nèi)。對(duì)于大瓶

包裝水，在100級(jí)潔凈環(huán)境中（或使用100級(jí)潔凈保證的無菌采樣器），抽取250mL水樣并轉(zhuǎn)

移到無菌濾杯內(nèi)。

9.2.3水樣過濾

在100級(jí)潔凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行無菌操作。打開濾泵過濾水樣，待杯內(nèi)水樣過濾完畢后，小心卸

下過濾杯，用無菌平頭無齒鑷子夾取濾床上已過濾好的濾膜的邊緣，轉(zhuǎn)移濾膜至裝有50mLCN

液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，濾膜最終應(yīng)完全與培養(yǎng)液接觸，不應(yīng)粘貼在瓶內(nèi)壁上。

9.2.4陰性對(duì)照試驗(yàn)

每批次檢測(cè)需做一個(gè)陰性對(duì)照，作為后續(xù)濁度判定的陰性參比樣。按照9.2.3的方法，過濾

250mL無菌水并將該膜轉(zhuǎn)移至另一瓶50mLCN液體培養(yǎng)基中，作為陰性對(duì)照。

9.2.5培養(yǎng)

將所有接種后的錐形瓶放置于36℃±1℃的恒溫振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)，150rpm轉(zhuǎn)速，培養(yǎng)24h。

9.2.6初篩判定

9.2.6.1濁度觀察方法

從培養(yǎng)箱中取出錐形瓶，將待觀察樣品的錐形瓶對(duì)向明亮光源處，輕緩搖晃錐形瓶使培養(yǎng)液

混勻，肉眼觀察培養(yǎng)液體的渾濁度。

9.2.6.2陰性對(duì)照樣濁度觀察

按9.2.6.1觀察陰性對(duì)照樣，如陰性對(duì)照樣明顯表現(xiàn)為微生物繁殖的濁度，說明陰性對(duì)照樣受

到污染，該次檢測(cè)無效，需排查原因。如陰性對(duì)照樣無微生物繁殖，僅呈現(xiàn)CN本底的濁度，則

按9.2.6.4測(cè)量其濁度。

9.2.6.3檢測(cè)樣品濁度觀察

按9.2.6.1逐一將檢測(cè)樣品和陰性對(duì)照樣對(duì)比，觀察兩者的濁度情況。如檢測(cè)樣品的濁度大于

陰性對(duì)照樣，且明顯表現(xiàn)為微生物繁殖的濁度，該樣品可直接判定為銅綠假單胞菌初篩可疑樣；

反之，如檢測(cè)樣品與陰性對(duì)照樣的濁度無明顯差別，則需按9.2.6.4測(cè)量樣品濁度，以濁度值進(jìn)行

判定。

9.2.6.4濁度測(cè)量方法

濁度測(cè)量的采樣操作應(yīng)在100級(jí)潔凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。輕緩搖晃錐形瓶使培養(yǎng)液混勻，倒取或

吸取一定量的培養(yǎng)液至潔凈干燥的比濁管中。

濁度測(cè)量操作可不在100級(jí)超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。宜選擇測(cè)量范圍約為0～200NTU的濁度計(jì)，

按濁度計(jì)說明書進(jìn)行儀器維護(hù)及測(cè)量，每次濁度測(cè)量前都應(yīng)用已知濁度的標(biāo)液或零濁度水進(jìn)行核

查。

9.2.6.5陰性對(duì)照樣濁度測(cè)量及判定

按9.2.6.4測(cè)量陰性對(duì)照的濁度，如陰性對(duì)照樣濁度≤2倍CN本底濁度，說明該批次檢測(cè)

試驗(yàn)有效，該陰性對(duì)照樣濁度值將作為本批次檢測(cè)樣品濁度判定的依據(jù)。

注：CN本底濁度值受多因素影響，與CN液體培養(yǎng)基的成分及含量、培養(yǎng)基配制及使用條

件、培養(yǎng)時(shí)間、濾膜材質(zhì)有關(guān)，故試驗(yàn)中應(yīng)固化這些變量因素。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)固化這些變量因素后，

3

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再積累一定數(shù)量的陰性對(duì)照濁度值，將陰性對(duì)照濁度值的平均值作為CN本底濁度值。實(shí)驗(yàn)室可

積累相關(guān)數(shù)據(jù)并驗(yàn)證后，適當(dāng)調(diào)整判定依據(jù)的倍數(shù)（本方法建議為2倍）。

9.2.6.6檢測(cè)樣品濁度測(cè)量及判定

按9.2.6.4測(cè)量檢測(cè)樣品的濁度，并將測(cè)量值逐一與陰性對(duì)照樣濁度值相比較，如檢測(cè)樣品的

濁度＞1.5倍陰性對(duì)照樣濁度，則該檢測(cè)樣品判定為銅綠假單胞菌初篩可疑樣；反之，如檢測(cè)樣

品的濁度≤1.5倍陰性對(duì)照樣濁度，則該檢測(cè)樣品判定為銅綠假單胞菌初篩陰性樣。

9.2.6.7初篩報(bào)告

對(duì)于銅綠假單胞菌初篩可疑樣，需按9.3進(jìn)行鑒定操作；對(duì)于銅綠假單胞菌初篩陰性樣，以

銅綠假單胞菌未檢出/250mL報(bào)告。

9.3銅綠假單胞菌鑒定

9.3.1平板劃線及培養(yǎng)

在100級(jí)潔凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行無菌操作。輕緩搖晃銅綠假單胞菌初篩可疑樣的錐形瓶使培養(yǎng)液

混勻，用無菌接種環(huán)沾取培養(yǎng)液，于CN瓊脂平板上四區(qū)劃線，以分離純化單菌落。需劃線3個(gè)平

板。平板倒置于36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24h。

9.3.2GB8538法確證試驗(yàn)

分別在日光燈及360nm±20nm紫外燈下觀察CN瓊脂平板上生長的可疑菌落的顏色，參照

GB8538，按照菌落顏色選擇做相應(yīng)的確證試驗(yàn)，每種菌落表現(xiàn)類型選取不少于3個(gè)可疑菌落（當(dāng)

不足3個(gè)時(shí)，則全部挑取）做確證試驗(yàn)。

9.3.3其它鑒定法確證試驗(yàn)

亦可通過其它鑒定技術(shù)對(duì)可疑菌落進(jìn)行確證，如MALDI-TOFMS、16SrRNA測(cè)序等。

挑取不少于10個(gè)可疑菌落（當(dāng)不足10個(gè)時(shí)，則全部挑?。┳龃_證試驗(yàn)，按鑒定方法的具體要

求進(jìn)行操作。

9.3.4確證報(bào)告

若按照9.3.2開展可疑菌落確證的，依據(jù)GB8538逐一判定可疑菌落是否為銅綠假單胞菌。

若按照9.3.3開展可疑菌落確證的，根據(jù)各方法的規(guī)則判定可疑菌落是否為銅綠假單胞菌。

如3個(gè)平板上有任一菌落確證后判定為銅綠假單胞菌，則該檢測(cè)樣品以銅綠假單胞菌檢出

/250mL報(bào)告。否則，以銅綠假單胞菌未檢出/250mL報(bào)告。

4

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附錄A

（資料性附錄）

培養(yǎng)基和試劑

A.1CN液體培養(yǎng)基

A.1.1成分

明膠蛋白胨17.6g

胰蛋白胨11.6g

硫酸鉀（K2SO4）10.0g

氯化鎂（MgCl2）1.4g

蒸餾水1000mL

CN補(bǔ)充成分

十六烷基三甲溴化銨0.2g

萘啶酮酸0.015g

A.1.2制法

將明膠蛋白胨、胰蛋白胨、硫酸鉀、氯化鎂溶解于1000mL蒸餾水中，加熱溶解，121℃

高壓滅菌15min。滅菌后，待培養(yǎng)基冷卻至50℃以下時(shí)，加入溶于2mL滅菌蒸餾水的CN

補(bǔ)充成分，培養(yǎng)基25℃的pH為7.1±0.2。宜現(xiàn)配現(xiàn)用。

A.2CN瓊脂

A.2.1成分

明膠蛋白胨16.0g

胰蛋白胨10.0g

硫酸鉀（K2SO4）10.0g

氯化鎂（MgCl2）1.4g

甘油