測序與疾病研究系列02高通量測序技術(shù)在腸道微生態(tài)研究中的應(yīng)用

?高通量測序技術(shù)在腸道微生態(tài)研究中的應(yīng)用解

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長知識金牌01020304腸道微生態(tài)研究前沿微生態(tài)組學(xué)介紹研究思路與案例分享取樣方法CONTENTS課程目錄腸道微生態(tài)研究前沿01微生物具有維持生態(tài)系統(tǒng)平衡、多樣性的重要功能，并與人類/動/植物健康、環(huán)境和食品安全等諸多方面密切相關(guān)解

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長知識金牌腸道微生態(tài)研究前沿微生物組生活在某一生境（土壤、大氣、水體、人體、動/植物等）中微生物的總和。研究微生物解讀大世界解

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陪伴醫(yī)生科研成長知識金牌微生物組計(jì)劃巴西微生物組計(jì)劃美國國家微生

物組計(jì)劃(NMI)非洲土壤微生物組計(jì)劃2016年微生物組計(jì)劃2017年微生物組計(jì)劃2017年12月-中國科學(xué)院微生物組計(jì)劃聚焦微生物組的功能網(wǎng)絡(luò)解析與調(diào)節(jié)機(jī)制創(chuàng)建微生物組功能解析技術(shù)與計(jì)算方法學(xué)建設(shè)中國微生物組數(shù)據(jù)庫與資源庫2017年10月-全球微生物基因組測序計(jì)劃計(jì)劃完成超過覆蓋人體、環(huán)境、海洋等主要方向的1000個微生 物組樣本測序建立微生物基因組、微生物組資源共享和挖掘的國際標(biāo)準(zhǔn)體系建立全球權(quán)威的微生物組學(xué)參考數(shù)據(jù)庫和數(shù)據(jù)分析平臺DOI：10.1021/acsnano.5b07826;

10.1007/978-3-319-59997-7_1;

10.1038/539152a解

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生科研成長知識金牌人體微生態(tài)IF：29.886目前對人體微生物組的認(rèn)知①人體菌群已證實(shí)與多種疾病相關(guān)，菌群研究正從描述和關(guān)聯(lián)性研究，向機(jī)制和應(yīng)用性研究轉(zhuǎn)變；②每個人高度個性化的菌群受許多因素共同影響：發(fā)育早期的遺傳和免疫互作、所處身體部位、飲食、抗生素、生活方式；③人體菌群不斷發(fā)生著動態(tài)變化，彈性和穩(wěn)定性在不同時(shí)間尺度上并存，菌群的變化率存在個體差異；④研究菌群在疾病中的作用機(jī)制應(yīng)注意：深入菌株層面，在人群研究中鑒定疾病相關(guān)菌群特征并用動物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，菌群本身可作為疾病標(biāo)志物；DOI:

10.1038/nm.4517解

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長知識金牌人體微生態(tài)OttmanNet

al.,Front

Cell

Infect

Microbiol.

2012;

Peterson

J

etal.,Genome

research,

2009;

López-Otín

C

et

al.,

Cell,

2016腸道菌群與人體健康腸道菌群與疾病治療人體菌群變化代謝干預(yù)和飲食影響人體菌群變化解

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長知識金牌腸道微生態(tài)人體腸道菌群組成的地理、種族或生活方式特異性Doi：10.3389/fmicb.2017.01162知識金牌腸道微生態(tài)腸道菌群——尚待被認(rèn)知的器官腸道微生態(tài)：菌群+宿主的互作統(tǒng)一體人體重1-3%由細(xì)菌組成人體糞便干重50%以上為細(xì)菌及其“尸體”人腸道微生物：常見1000多種腸道細(xì)菌：約4×1013個99%以上由30-40種細(xì)菌構(gòu)成健康人腸道共生菌占99%以上腸道非冗余基因集：11.4

millionHooper

LV

et

al.,

Science,

2001;

Sender

R,

et

al.,

Cell,

2016;

Lynch

S

V,et

al.,

New

England

Journal

of

Medicine,2016.促進(jìn)營養(yǎng)吸收改善腸易激癥狀增強(qiáng)免疫功能防治腫瘤疾病緩解腸道炎癥調(diào)節(jié)血糖血脂解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長知識金牌腸道菌群與疾病的關(guān)系DOI:

10.1161/CIRCRESAHA.117.309715解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長腸道菌群、代謝產(chǎn)物與不同疾病間存在復(fù)雜的相互作用知識金牌腸道菌群與腸道疾?、儆幸婢ㄈ鏔.prausnitzii）寄生在表皮細(xì)胞粘膜層時(shí)，其分泌的短鏈脂肪酸（SCFA）進(jìn)入細(xì)胞，會激活免疫抑制細(xì)胞（如T輔助細(xì)胞），阻斷炎癥反應(yīng)的發(fā)生；②當(dāng)有益菌缺失或致病菌存在時(shí)，粘膜屏障會被破壞，粘膜層變薄、細(xì)胞間隙擴(kuò)大，病原菌極其有毒代謝物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，從而激發(fā)炎癥反應(yīng)。IF：40.137IBD：炎癥性腸?。║C、CD）IBS：腸易激綜合癥DOI：10.1038/518S3a解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長解

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長知識金牌腸道菌群與代謝疾病肥胖糖尿病ZmoraN,

et

al.,

Cell

Metabolism,

2017;

Liu

RX,

et

al.,NatureMedcine,2017;Wu

H,

et

al.,

Nature

Medcine,

2017;解

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長知識金牌腸道菌群與免疫系統(tǒng)疾病Thaiss

et

al.,

Nature,

2016; Belkaid

Yet

al.,

Immunity,2017；Pickard

J

M,

et

al.,

Immunological

reviews,2017腸道微生物組整合環(huán)境、基因和免疫信號，影響 宿主的代謝、免疫力和對感染的響應(yīng)菌群在宿主免疫系統(tǒng)的誘導(dǎo)、訓(xùn)練及功能中都發(fā) 揮了重要作用，宿主免疫系統(tǒng)也進(jìn)化出了多種方 法以維持與菌群的共生關(guān)系環(huán)境和遺傳因素的改變可導(dǎo)致腸道菌群的紊亂， 為病原體的入侵提供機(jī)會，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生解

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長知識金牌腸道菌群與心血管疾病DOI：10.1161/CIRCULATIONAHA.116.024251解

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|陪伴醫(yī)生科研成長知識金牌腸腦軸10.1016/j.cell.2017.11.024腸道菌群決定認(rèn)知和思維腸道菌群參與決定神經(jīng)系統(tǒng)中化學(xué)物質(zhì)的變化和認(rèn)知水平外界環(huán)境壓力也可以導(dǎo)致腸道菌群改變和腸腦異常腸-腦軸，通過交感神經(jīng)系統(tǒng)與副交感神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元、循環(huán)激素及其他神經(jīng)調(diào)節(jié)分子，相關(guān)疾病中起調(diào)節(jié)作用解

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長知識金牌腸道菌群與神經(jīng)系統(tǒng)疾病Fung

T

C,

et

al.,

Nature

Neuroscience,

2017腸道微生物和免疫系統(tǒng)都涉及自閉癥、抑郁 癥和阿爾茲海默癥等神經(jīng)發(fā)育、精神性和神 經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)理和表現(xiàn)解

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長知識金牌宿主與腸道菌群互作10.1016/j.chom.2015.12.005；10.1111/1462-2920.13926糞便中宿主miRNA進(jìn)入F.nucleatum和E.coli等腸內(nèi)細(xì)菌，調(diào)控其基因轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞生長宿主的腸腔環(huán)境決定腸道菌群的空間分布，而菌群的定殖又影響先天性及和適應(yīng)性粘膜免疫系統(tǒng)發(fā)育、上皮細(xì)胞更新、屏障完整性以及腸神經(jīng)系統(tǒng)等解

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長知識金牌腸道菌群與疾病治療IF：37.205腫瘤免疫治療，基于菌群的精準(zhǔn)醫(yī)療時(shí)代來臨DOI：10.1126/science.aar2946①臨床前動物模型中，細(xì)菌可調(diào)節(jié)化療及免疫療法的抗癌效果，近期研究關(guān)注人體腸道菌群對抗癌藥物的影響②PD-1單抗對于肺癌、腎癌等上皮細(xì)胞腫瘤的療效受腸道菌群影響，抗生素顯著降低患者的平均生存期，Akk菌可能改善PD-1單抗的療效③PD-1單抗治療黑色素瘤的效果與腸道菌群組成相關(guān)，柔嫩梭菌豐度較高的患者無進(jìn)展生存期較長④PD-1單抗治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的效果與腸道菌群相關(guān)，長雙歧桿菌、產(chǎn)氣柯林斯菌和屎腸球菌的豐度影響療效知識金牌腸道菌群與疾病治療CRC：結(jié)直腸癌DOI：10.1016/j.cell.2017.07.008①在化療后復(fù)發(fā)的大腸癌患者的癌組織中，發(fā)現(xiàn)具核梭桿菌的豐度占優(yōu)，并與病人的臨床病理特征相關(guān)；②通過生物信息學(xué)和功能分析發(fā)現(xiàn)具核梭桿菌促進(jìn)針對化療的大腸癌耐藥；③相關(guān)機(jī)制：具核梭桿菌靶向TLR4、MYD88先天免疫信號和特定的微小RNA，激活自噬通路并改變大腸癌的化療響應(yīng)；④未來可通過檢測和靶向具核梭桿菌及相關(guān)信號通路，對大腸癌的臨床管理產(chǎn)生重要價(jià)值，并可能改善大腸癌患者的預(yù)后解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長IF：30.410知識金牌飲食、益生菌和藥物等調(diào)節(jié)腸道菌群金銀花與二甲雙胍聯(lián)用可緩解脂肪肝及葡萄糖不耐受，與調(diào)節(jié)腸道菌群相關(guān)植物和蘑菇的抗肥胖和抗糖尿病作用利拉魯肽與沙格列汀調(diào)節(jié)腸道菌群與體重車前子多糖緩解2型糖尿病大鼠的高血糖及高血脂并影響結(jié)腸菌群解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長知識金牌微生物多樣性：群落中有哪些微生物？宏基因組：這些微生物能干什么？宏轉(zhuǎn)錄組：這些微生物要干什么？多組學(xué)：這些微生物為什么這么干？高通量測序解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長微生態(tài)組學(xué)介紹02微生物多樣性

知

識

金

牌1991年P(guān)ace首次提出環(huán)境基因組學(xué)的概念，基于核糖體rRNA基因的擴(kuò)增子測序來反映系統(tǒng)中的微生物多樣性的組成(16S、18S、ITS、功能基因等)。16Sgenome

size:

~5Mb常見Marker

gene：細(xì)菌：16S；真菌：ITS，18S功能基因：AOA，AOB，nirK，nifH，McrA解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長知識金牌微生物多樣性測序分析流程測序流程解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長分析流程知識金牌交互式分析云平臺生物信息挖掘進(jìn)入交互時(shí)代/解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長知識金牌微生物多樣性分析內(nèi)容OTU聚類與注釋OTU(Operational

Taxonomic

Units)：操作分類單元。通常將相似性高于97%的序列（如細(xì)菌古菌16S

rDNA）定義為一個OTU，每個OTU即為理論上的一個物種。數(shù)據(jù)庫解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長知識金牌微生物多樣性分析內(nèi)容1、物種注釋與評估數(shù)據(jù)優(yōu)化統(tǒng)計(jì)OTU聚類分類學(xué)分析Pan/Core物種分析α多樣性指數(shù)分析α多樣性指數(shù)差異檢驗(yàn)稀釋曲線分析2、物種組成分析物種Venn圖分析群落Heatmap圖群落Bar圖群落Pie圖多級物種Sunburst圖Circos樣本與物種關(guān)系圖稀釋曲線判斷測序深度是否足夠多樣性指數(shù)差異檢驗(yàn)物種Venn圖分析解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長知識金牌微生物多樣性分析內(nèi)容群落Bar圖群落Pie圖多級物種Sunburst圖Circos樣本與物種關(guān)系圖群落Heatmap2、物種組成分析物種Venn圖分析群落Heatmap圖群落Bar圖群落Pie圖多級物種Sunburst圖Circos樣本與物種關(guān)系圖解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長解

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長知識金牌微生物多樣性分析內(nèi)容3、樣本比較分析樣本層次聚類分析PCA主成分分析PCoA主坐標(biāo)分析NMDS非度量多維尺度分析ANOSIM相似性分析ANOSIM相似性分析Adonis多因素方差分析PLS-DA偏最小二乘判別分析NMDSANOSIM/Adnois樣本層次聚類樹PCoAPCA知識金牌微生物多樣性分析內(nèi)容LEfSe分析屬門4、物種差異分析LDA

Effect

Size(LEfSe

分析)Ternary三元相圖MetagenomeSeq分析多組物種差異分析兩組物種差異分析兩樣本物種差異分析兩樣本差異分析兩組物種差異分析多組物種差異分析解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長知識金牌微生物多樣性分析內(nèi)容5、關(guān)聯(lián)與模型預(yù)測分析(層級)相關(guān)性Heatmap圖RDA/CCA分析Mantel

Test分析Network網(wǎng)絡(luò)分析樣本與物種的共線性關(guān)系圖隨機(jī)森林分析ROC曲線環(huán)境因子排序回歸分析SourceTracker分析RDA/CCA分析物種物種相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖環(huán)境因子相關(guān)性Heatmap圖隨機(jī)森林分類ROC曲線解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長解

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|知識金牌微生物多樣性分析內(nèi)容7、16S功能預(yù)測COG功能預(yù)測KEGG功能預(yù)測KEGG

pathway陪伴醫(yī)生科研成長COG

function知識金牌文獻(xiàn)案例1doi:10.1136/gutjnl-2013-306541≤25>28運(yùn)動和飲食影響腸道菌群多樣性2014IF：16.65816S+代謝組1個項(xiàng)目解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長2篇Gut16S→宏基因組循序漸進(jìn)知識金牌運(yùn)動員腸道菌群α多樣性高，運(yùn)動員與對照組腸道菌群具有明顯差異SobsPDShannonSimpsonChao1Unweighted

UniFrac

PCoA解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長文獻(xiàn)案例1知識金牌文獻(xiàn)案例1運(yùn)動員與對照組營養(yǎng)攝入有差異運(yùn)動員蛋白攝入量對能量攝入貢獻(xiàn)率高飲食結(jié)構(gòu)可以區(qū)分運(yùn)動員與對照組飲食結(jié)構(gòu)可以區(qū)分運(yùn)動員與對照組解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長知識金牌文獻(xiàn)案例1蛋白攝取和肌酸激酶驅(qū)動腸道菌群多樣性增加蛋白攝取與菌群α多樣性指數(shù)相關(guān)性分析解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長肌酸激酶與菌群α多樣性指數(shù)相關(guān)性分析知識金牌文獻(xiàn)案例1研究結(jié)論16S+代謝組文章亮點(diǎn)首次證明運(yùn)動和腸道菌群有關(guān)運(yùn)動和飲食影響腸道菌群組成運(yùn)動量和蛋白攝入量的增加可以提高腸道菌群多樣性與對照組相比，運(yùn)動員代謝水平高，炎癥水平低不足對腸道菌群僅有物種水平分析，無功能水平分析運(yùn)動和飲食對人的腸道菌群的功能有何影響？影響了哪些代謝通路？宏基因組解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長知識金牌文獻(xiàn)案例22017.03IF：16.658宏基因組+代謝組專業(yè)運(yùn)動員的菌群在組成及功能代謝水平上與久坐人群有差異1個項(xiàng)目解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長2篇Gut16S→宏基因組循序漸進(jìn)知識金牌文獻(xiàn)案例2研究方法糞便樣本宏基因組測序分析測序平臺：Illumina

HiSeq

2500臨床、運(yùn)動和飲食數(shù)據(jù)收集：飲食攝入頻率問卷表和食物圖集；采集空腹血液樣本測定肌酸激酶；用EPIC-Norfolk問卷來記錄評價(jià)運(yùn)動量水平。代謝分析：尿液樣本，H-NMR（核磁共振氫譜）、RP（反相液相色譜）and

HILICchromatography（親水作用超高效色譜-質(zhì)譜）分析；糞便樣本，H-NMR、HILIC、膽汁酸質(zhì)譜聯(lián)用儀分析、GC-MS-targeted

SCFA

分析。解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長知識金牌文獻(xiàn)案例2與運(yùn)動狀態(tài)相關(guān)的腸道微生物與功能結(jié)構(gòu)16S多樣性數(shù)據(jù)在較高的分類學(xué)水平識別度高；宏基因組在較低分類學(xué)水平上具有更高的保真度和優(yōu)越性運(yùn)動員代謝通路多樣性高；三組人群代謝通路組成具有顯著差異組間代謝通路組成與多樣性分析解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長解

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長知識金牌文獻(xiàn)案例2MetaCyc代謝途徑（Kruskal-Wallis

p<0.05）與飲食成分和血清代謝顯著相關(guān)的代謝通路數(shù)量統(tǒng)計(jì)（Benjamini-Hochberg

corrected

p<0.05）微生物代謝功能組間差異及代謝通路與臨床、飲食關(guān)聯(lián)分析A：High-BMI組僅VB、LB、AAB合成類代謝通路豐度顯著較高。Athletes涉及碳水化合物降解、輔酶因子合成和能量代謝等29個代謝通路豐度顯著較高。B：對照組與飲食（糖類及其他碳水化合物、能量攝入）的代謝通路相關(guān)性強(qiáng)；Athletes組主要以與CK、總膽紅素、纖維素?cái)z入有關(guān)的代謝通路為優(yōu)勢?？偰懠t素運(yùn)動員與短鏈脂肪酸含量相關(guān)的代謝通路高于對照組解

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長知識金牌文獻(xiàn)案例2代謝組和16S、宏基因組結(jié)果關(guān)聯(lián)分析乙丙丁戊異異酸酸酸酸丁戊酸酸16S結(jié)果中與短鏈脂肪酸具有相關(guān)性的細(xì)菌類群（Spearman）丙酸乙酸戊酸異丁酸異戊酸丁酸解知識金牌文獻(xiàn)案例2糞便low-BMI與運(yùn)動員在功能組成上較為相似螺

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長尿液代謝通路與代謝物的相關(guān)性分析解

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長知識金牌文獻(xiàn)案例2研究結(jié)論運(yùn)動員氨基酸、抗生素生物合成、碳水化合物等代謝通路增加，與增強(qiáng)肌肉更新（健康）和總體健康相關(guān)的糞便代謝物，如微生物產(chǎn)生的短鏈脂肪酸、乙酸、丙酸和丁酸也增加。運(yùn)動員和久坐不動的對照組相比，腸道微生物功能和代謝水平的差異遠(yuǎn)大于在組成水平上的差異，為飲食-運(yùn)動- 腸道微生物范例研究提供新的視角。文章亮點(diǎn)16S+宏基因組+代謝組結(jié)合微生物功能水平分析深入，挖掘到與運(yùn)動相關(guān)的代謝通路，涉及氨基酸、抗生素生物合成、碳水化 合物，從功能水平上證實(shí)了運(yùn)動和飲食對人體腸道菌群的影響解

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陪伴醫(yī)生科研成長知識金牌如何從大量的多樣性樣本中挑選代表性樣本做宏基因組？多樣性宏基因組MicroPITA知識金牌宏基因組研究現(xiàn)狀DOI：10.1007/s00294-017-0693-8全球宏基因組文章發(fā)表統(tǒng)計(jì)1580篇解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長宏基因組

知

識

金

牌宏基因組(Metagenome)：生態(tài)環(huán)境中全部微小生物的基因組(Handelsman

et

al.,1998)。16SMetagenomeManor

O

et

al.,

Cell

Host

&

Microbe,

2017.解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長多樣性宏基因組物種組成√√物種豐度√√基因預(yù)測×√功能注釋×√代謝通路×√功能分析×√……知識金牌宏基因組測序分析流程物種與功能注釋物種與功能分析測序流程分析流程解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長知識金牌宏基因組宏基因組云平臺強(qiáng)勢來襲，全面上線！/解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長解螺旋陪伴醫(yī)生科研成長知識金牌宏基因組測序分析內(nèi)容1、物種與功能注釋物種分類學(xué)注釋COG功能注釋KEGG功能注釋碳水化合物活性酶注釋抗生素抗性基因注釋毒力因子注釋PHI病原與宿主互作注釋COG功能注釋KEGG

Pathway注釋物種分類注釋|知識金牌宏基因組測序分析內(nèi)容1、物種與功能注釋物種分類學(xué)注釋COG功能注釋KEGG功能注釋碳水化合物活性酶注釋抗生素抗性基因注釋毒力因子注釋PHI病原與宿主互作注釋碳水化合物活性酶的注釋 比對CAZy數(shù)據(jù)庫，適用于木質(zhì)纖維素分解、糖代謝、食草動物瘤胃等相關(guān)研究。毒力因子注釋 毒力因子(virulentfactor)：構(gòu)成毒力的物質(zhì)，主要為侵襲力和毒素。比對VFDB數(shù)據(jù)庫，適用于人類疾病、動植物病害等方面的研究?？股乜剐曰虻淖⑨尡葘RDB/CARD數(shù)據(jù)庫，適用于抗生素、抗菌劑、環(huán)境治理等方面的研究。解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長解

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長知識金牌宏基因組測序分析內(nèi)容1、物種與功能注釋PHI病原與宿主互作注釋MvirDB

病原體生物攻防因子注釋TCDB

轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分類注釋群體感應(yīng)（QS）分析Pfam

結(jié)構(gòu)域分析分泌蛋白預(yù)測T3SS效應(yīng)蛋白預(yù)測次級代謝物基因簇預(yù)測PHI病原與宿主互作注釋TCDB

轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分類注釋群體感應(yīng)（QS）分析分泌蛋白預(yù)測MvirDB病原體生物攻防因子注釋|

陪伴醫(yī)生科研成長知識金牌宏基因組測序分析內(nèi)容2、物種與功能組成分析Venn圖Heatmap圖豐度分布Bubble圖Circos樣本與物種（功能）關(guān)系圖Circos樣本與物種(功能)關(guān)系圖Venn圖Heatmap圖解螺旋知識金牌宏基因組測序分析內(nèi)容3、樣本比較分析樣本層次聚類樹PCA主成分分析PCoA主坐標(biāo)分析NMDS非度量多維尺度分析樣本層次聚類樹ANOSIM相似性分析PERMANOVA分析MRPP多響應(yīng)置換過程分析菌群分型分析PERMANOVAPCoAANOSIM菌型分析解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長知識金牌宏基因組測序分析內(nèi)容LEfSe分析代謝通路圖組間差異分析iPath整合分析4、物種與功能差異分析LEFSE組間差異判別分析Wilcoxon秩和檢驗(yàn)分析STAMP差異分析Ternary

三元相圖MetagenomeSeq分析代謝通路圖組間差異分析iPath整合分析STAMP差異分析解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長知識金牌宏基因組測序分析內(nèi)容隨機(jī)森林10-fold交叉驗(yàn)證/ROC5、關(guān)聯(lián)與模型預(yù)測分析(層級)相關(guān)性Heatmap圖RDA/CCA典型相關(guān)分析Mantel

Test分析共線性關(guān)系圖Network網(wǎng)絡(luò)分析隨機(jī)森林分析ROC曲線CAG/MGS分析物種與功能回歸分析環(huán)境因子排序回歸分析SourceTracker分析Procrustes分析VPA方差分解分析物種與功能貢獻(xiàn)度分析物種與功能回歸分析物種與功能貢獻(xiàn)度分析解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長解

螺

旋

| 陪

伴

醫(yī)

生

科

研

成

長知識金牌宏基因組測序分析內(nèi)容5、關(guān)聯(lián)與模型預(yù)測分析(層級)相關(guān)性Heatmap圖RDA/CCA典型相關(guān)分析Mantel

Test分析共線性關(guān)系圖Network網(wǎng)絡(luò)分析隨機(jī)森林分析ROC曲線CAG/MGS分析物種與功能回歸分析環(huán)境因子排序回歸分析SourceTracker分析Procrustes分析7、基于reads的注釋SSUrRNA物種注釋HUMAnN代謝功能注釋6、進(jìn)化分析系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化樹相關(guān)性Heatmap圖物種與功能分布網(wǎng)絡(luò)圖(抗性基因class水平)CAG/MGS分析物種與功能相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖紅色：正相關(guān)綠色：負(fù)相關(guān)研究思路與案例分享03針對疾病的分析方向<1>與疾病相關(guān)的微生物菌群結(jié)構(gòu)分析（多樣性，宏基因組，宏轉(zhuǎn)錄組）篩選病人與健康人的特征性微生物標(biāo)記鑒定導(dǎo)致相關(guān)疾病的致病菌分析致病菌與病人臨床指標(biāo)的相關(guān)性構(gòu)建疾病的菌群預(yù)測模型膳食調(diào)理、菌群移植、益生菌治療，探索開發(fā)靶向微生物的新療法<2>與疾病相關(guān)的微生物編碼基因分析（宏基因組，宏轉(zhuǎn)錄組）構(gòu)建與疾病相關(guān)的腸道菌群基因集篩選病人與健康人的特征性微生物編碼基因病人與健康人腸道菌群差異基因的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系分析比較不同疾病人群的基因集組成<3>與疾病相關(guān)的微生物代謝功能分析（宏基因組，宏轉(zhuǎn)錄組）病人與健康人腸道菌群差異代謝途徑篩選菌群代謝功能與疾病程度相關(guān)性分析解析疾病發(fā)生的分子機(jī)制，如免疫機(jī)制探索開發(fā)新藥物、新治療方法，靶向調(diào)控菌群代謝功能Doi:10.1038/nrmicro3451研究思路IF：23.574研究思路DOI：10.1038/nrmicro.2016.83IF：24.727醫(yī)口方案設(shè)計(jì)-簡化方案方案設(shè)計(jì)醫(yī)口方案設(shè)計(jì)-完整方案方案設(shè)計(jì)IBS患者和精神類疾病患者有類似的菌群信號研究人群：IBS患者（根據(jù)Rome

III

criteria評估）抑郁癥患者（根據(jù)Mini-International

NeuropsychiatricInterview[MINI]DSM-IV評估）樣本：糞便樣本(n=45+15+25+20)檢測方法：16S多樣性DOI:

10.1016/j.cgh.2016.05.033IF：7.68文獻(xiàn)案例3臨床癥狀和恒壓器測試數(shù)據(jù)分析腹部癥狀，包括腹部疼痛、腫脹和排便數(shù)量在IBS-D和COMO組中出現(xiàn)頻率顯著高于對照組；經(jīng)直腸恒壓器檢查發(fā)現(xiàn)IBS-D患者緊迫性和最大耐受性閾值最低，顯著低于對照組；IBS-D、抑郁癥和COMO患者SDS分值顯著高于對照組；抑郁癥患者的MINI

secondary

items要高于COMO患者；DOI:

10.1016/j.cgh.2016.05.033腹部癥狀評估內(nèi)臟敏感性的檢測心理癥狀評估MINI評估文獻(xiàn)案例3IBS-D、抑郁癥、COMO患者和健康人群群腸道菌群特征門水平分析發(fā)現(xiàn)IBD、抑郁癥和COMO組擬桿菌門豐度增高，厚壁菌門豐度降低；IBD、抑郁癥和COMO組菌群多樣性顯著低于對照組；IBD和抑郁癥有類似的菌群組成和多樣性變化，而COMO組相對前面2組變化幅度較??；Heatmap圖分析也獲得類似的結(jié)果，相比對照組，IBD和抑郁癥組中一些低豐度菌群明顯降低；文獻(xiàn)案例3擬桿菌和普氏菌分型分析100個樣本腸道菌群可分為3種類型，I型（41個樣本），II型（17個樣本）和III型（42個樣本）；Heatmap圖分析發(fā)現(xiàn)同一腸型樣本更相似，不同腸型樣本差異明顯；I型和II型Shannon指數(shù)顯著低于III型；100個樣本不同腸型的菌群組成也有差異,I型和II型主要的菌屬分別為擬桿菌（I型）和普氏菌（II型）；文獻(xiàn)案例3IBS-D、抑郁癥和COMO患者腸型差異分析IBS-D、抑郁癥和COMO患者樣本明顯區(qū)分于對照組，60%IBS-D患者歸屬于I型，25%歸屬于腸型II，而95%健康人歸屬于III型，5%歸屬于I型；抑郁癥患者腸型分布于IBS-D類似，60%歸屬于I型，20%歸屬于II型；COMO組和對照組有明顯區(qū)分；60%IBS-D25%IBS-D95%健康人60%抑郁癥20%抑郁癥文獻(xiàn)案例3結(jié)腸粘膜炎癥與菌群信號（腸型）相關(guān)性分析疫組化分析乙狀結(jié)腸粘膜樣本（24個I型、14個II型和23個III型樣本，包括33位IBS-D、3位抑郁癥、18位COMO患者和7位健康個體）MCP-1

MIP-α、肥大細(xì)胞類胰蛋白酶和CD3+T細(xì)胞組織化學(xué)分析發(fā)現(xiàn)不同腸型均源于IBS-D患者，MCP-1、MIP-α、大量肥大細(xì)胞和CD3+T細(xì)胞在I型和II型中的數(shù)量高于III型；MCP-1、MIP-α過表達(dá)與IBS-D和抑郁癥患者臨床特征關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)MCP-1與腹部疼痛值、腫脹以及疼痛頻率和

IBS-SSS顯著相關(guān)；文獻(xiàn)案例3案例分析內(nèi)容美吉客戶文章仁濟(jì)醫(yī)院馬雄團(tuán)隊(duì)IF=

16.658原發(fā)性膽汁性膽管炎患者腸道菌群改變并可以在UDCA治療后部分恢復(fù)測序項(xiàng)目：多樣性測序平臺：Illumina

MiSeq

PE300樣本類型：糞便樣本數(shù)量：193分組設(shè)置：實(shí)驗(yàn)組、對照組、驗(yàn)證組測序量：平均每個樣本34,661

clean

reads/10.1136/gutjnl-2016-313332文獻(xiàn)案例4PBC初治患者腸道菌群失調(diào)與健康人相比，PBC初治患者腸道菌群豐度降低；PBC初治患者與健康人腸道菌群能夠明顯分離出來；物種豐度可以解釋菌群在PC1軸上的差異。PERMANOVA，p=0.001文獻(xiàn)案例4利用12種PBC相關(guān)的屬作為標(biāo)記微生物區(qū)別疾病狀態(tài)AUC=0.86AUC=0.84實(shí)驗(yàn)組驗(yàn)證組腸道菌群診斷模型能夠準(zhǔn)確區(qū)分PBC患者和健康人健康人富集PBC患者富集文獻(xiàn)案例4UDCA治療使得PBC腸道菌群失調(diào)部分改善PBC

富集的屬

Haemophilus,

Streptococcus

和Pseudomonas在UDCA治療后顯著降低；健康人中富集的四種屬，有三種屬（Bacteroidetes,Sutterella和Oscillospira）在治療后的患者中增加；雖然治療后Veillonella

在患者腸道內(nèi)并未降低，但其相對豐度在療效欠佳的患者中顯著高于療

效好的患者。文獻(xiàn)案例4PBC患者菌群功能改變16S功能預(yù)測分析PBC富集的通路：細(xì)菌侵入上皮細(xì)胞，過氧化物酶增殖激活受體信號通路和己內(nèi)酰胺退化；健康人富集的通路：參與新陳代謝、氨基酸生物合成（如丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸）以及ɑ亞麻油酸新陳代謝的蛋白過表達(dá)。文獻(xiàn)案例4案例分析內(nèi)容樣本來源：196位中國人群（健康人、HTN、pHTN）對照組：41位健康人（年齡32-75）pHTN組：56位高血壓前期患者（年齡28-70）HTN組：99位高血壓患者（年齡28-69）樣本類型：糞便、血液宏基因組：n=196，Illumina,PE125，6.18

±1.43(s.d.)

million

reads/per

sample代謝組：多樣性：n=124，LC/MSn=12，Illumina,

Hiseq

16SV4DOI：10.1186/s40168-016-0222-x腸道菌群失衡促進(jìn)高血壓的發(fā)展糞菌移植對照組pHTN組HTN組糞便宏基因組血液代謝組對照組HTN組小鼠糞便16S臨床指標(biāo)文獻(xiàn)案例5文獻(xiàn)案例51、pHTN和HTN患者Gut

Microbiota（GM）多樣性和腸型分析GM多樣性分析：疾病組GM基因和菌群多樣性低于對照組腸型分析：腸型分型：1型（普氏腸型）2型（擬桿菌腸型）1型：pHTN48.21%HTN

45.45%2型：健康組73.17%文獻(xiàn)案例52、pHTN和HTN患者相關(guān)菌群Wilcoxon

rank

sum

test：44種差異菌屬在3組中富集普氏菌和克雷伯氏菌在pHTN和HTN組中明顯升高對照組中雙歧桿菌等豐度較高文獻(xiàn)案例53、pHTN和HTN

co-abundancegroup（CAG）相關(guān)性分析對照組：厚壁菌和羅氏菌富集pHTN：腸球菌和克雷伯氏菌富集HTN：普氏菌和梭菌富集CAGcluster

threshold：

0.7number：50文獻(xiàn)案例54、pHTN和HTN患者腸道菌群功能變化KEGG

PCA分析：與對照組相比，

p

HTN和HTN

GM功能差異顯著

(Wilcoxon

rank

sum

test，p<0.001)與對照組相比，pHTN和HTNGM某 些功能(KEGG

modules

and

CAZy families)缺失，比如支鏈氨基酸合成 和轉(zhuǎn)運(yùn)、酮體合成等KEGG

moduleCAZy文獻(xiàn)案例55、pHTN和HTN

腸道菌群代謝表達(dá)文獻(xiàn)案例55、pHTN和HTN

腸道菌群代謝表達(dá)菌群與代謝物相關(guān)性分析對照組中葡萄糖苷與雙歧桿菌和AKK呈正相關(guān)，但與普氏菌呈負(fù)相關(guān)HTN組中硬脂酸和普氏菌呈正相關(guān)，硬脂酸與雙歧桿菌和羅氏菌呈負(fù)相關(guān)，可以作為HTN中一種重要的代謝物HTNcontrol文獻(xiàn)案例56、pHTN和HTN

分類模型構(gòu)建CAG+代謝物區(qū)分對照組與pHTN/HTN組AUC值最高隨機(jī)森林分析：explanatory

variables：CAG+代謝物（展示TOP

50CAG）文獻(xiàn)案例57、糞菌移植--血壓升高移植HTN患者糞便小鼠血壓高于移植健康人群糞便小鼠血壓文獻(xiàn)案例5研究亮點(diǎn)宏基因組+代謝組+16S糞便移植，證明了腸道微生物群對宿主高血壓的直接影響疾病預(yù)測模型建立----預(yù)測指標(biāo)：CAGs+代謝物建立基于菌群并能相比對照組準(zhǔn)確區(qū)分高血壓前期和高血壓個體的分類器案例分析內(nèi)容疾病相關(guān)菌微生物相關(guān)疾病Bacteroidaceae

sp.痛風(fēng)Bacteroides痛風(fēng)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、全身性紅斑狼瘡、糖尿病Clostridium（梭菌）T2D、痛風(fēng)Porphyromonadaceae（紫單胞菌科）腸道中機(jī)會致病菌（痛風(fēng)、強(qiáng)直性脊柱炎、克羅恩?。㏑hodococcus（紅球菌屬）痛風(fēng)、克羅恩病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）Erysipelatoclost