動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模離體培養(yǎng)技術(shù)

動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模離體培養(yǎng)技術(shù)引言動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方法、工藝及控制動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)反應(yīng)器及改進(jìn)動(dòng)物細(xì)胞的高密度培養(yǎng)引言基本概念發(fā)展簡(jiǎn)史微生物與動(dòng)物細(xì)胞的差異動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的應(yīng)用引言動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)（large-scaleculturetechnology）

人工條件下，動(dòng)物細(xì)胞在反應(yīng)器中進(jìn)行大量地、高密度培養(yǎng)，以生產(chǎn)珍貴生物制品的技術(shù)。pH溫度溶氧發(fā)酵工藝等條件發(fā)展簡(jiǎn)史1907Harrison創(chuàng)立了體外組織培養(yǎng)技術(shù)；

1951Earle開發(fā)動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)合成培養(yǎng)基；1957Graff應(yīng)用灌注技術(shù)，培養(yǎng)密度達(dá)1010個(gè)/L；1962Capstick成功實(shí)現(xiàn)小鼠腎細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)，標(biāo)志著動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的開始；1967VanWezel成功地以DEAE-SephadexA50為載體，實(shí)現(xiàn)動(dòng)物細(xì)胞的載體培養(yǎng)；1975Kohler和Milstein成功建立單克隆抗體技術(shù)；1975Sato用激素代替血清使垂體細(xì)胞株在無(wú)血清介質(zhì)中生長(zhǎng)成功，預(yù)示無(wú)血清培養(yǎng)的誘人前景；1986DemeBiotech公司首次成功地用微囊化技術(shù)大規(guī)模培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)單克隆抗體；1989Konstantinovti首次提出大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的生理狀態(tài)控制技術(shù)，更新培養(yǎng)工藝的優(yōu)化控制理論。發(fā)展簡(jiǎn)史微生物與動(dòng)物細(xì)胞差異細(xì)胞壁生長(zhǎng)速率0.1-0.5h-10.01-0.05h-1需氧量CO2需求營(yíng)養(yǎng)要求環(huán)境影響生長(zhǎng)濃度109－1010/ml106/ml大小100－2000nm10－100um動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用疫苗生產(chǎn)上的應(yīng)用已實(shí)現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)的產(chǎn)品有口蹄疫苗、狂犬病毒疫苗、骨髓灰質(zhì)炎病毒疫苗、牛白血病疫苗干擾素生產(chǎn)上的應(yīng)用自1957年發(fā)現(xiàn)干擾素以來(lái)，經(jīng)歷了自然干擾素、基因重組干擾素和蛋白質(zhì)工程干擾素等3個(gè)發(fā)展階段。英國(guó)Wellcome公司為了滿足臨床實(shí)驗(yàn)的需要，采用8000LNamalwa細(xì)胞生產(chǎn)α干擾素。DMEM培養(yǎng)基胎牛血清其他成分錐形瓶逐級(jí)放大培養(yǎng)加堿（碳酸氫鈉）加糖（葡萄糖）灌注培養(yǎng)液微載體5L種子罐培養(yǎng)培養(yǎng)液50L生物反應(yīng)器接種狂犬病毒出液口收獲病毒Vero細(xì)胞和狂犬病毒的培養(yǎng)工藝單克隆抗體生產(chǎn)上的應(yīng)用應(yīng)用動(dòng)植物細(xì)胞生產(chǎn)單克隆抗體是一條經(jīng)濟(jì)、可靠的途徑。英國(guó)Celltech公司采用無(wú)血清培養(yǎng)液在10000L氣升式生物反應(yīng)器中培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)單克隆抗體；國(guó)內(nèi)也已成功地應(yīng)用中空纖維培養(yǎng)系統(tǒng)和微載體培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)單克隆抗體作為血型定型試劑。其他基因重組產(chǎn)品生產(chǎn)上的應(yīng)用細(xì)胞能精確地轉(zhuǎn)錄、翻譯和加工較大或更復(fù)雜的克隆蛋白質(zhì)；可以簡(jiǎn)化蛋白質(zhì)的分離提純；美國(guó)Endotronic公司用中空纖維生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)出免疫球蛋白G、A和M，尿激酶，人生長(zhǎng)激素等。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方法工藝及其控制環(huán)境系統(tǒng)培養(yǎng)系統(tǒng)反應(yīng)器提取系統(tǒng)①溫度細(xì)胞體外生存的基本條件之一；不同源細(xì)胞，最適生長(zhǎng)溫度不盡相同，昆蟲細(xì)胞25℃-28℃，哺乳動(dòng)物細(xì)胞37℃；低溫耐受力強(qiáng)于高溫；動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的溫度允許波動(dòng)的范圍在±0.25℃。1、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)條件②pH合適的pH是細(xì)胞生存的必要條件之一。開始培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)液的理想pH為7.4，隨著培養(yǎng)的進(jìn)行，pH會(huì)因細(xì)胞代謝所釋放的CO2而下降，但必須控制在7.0以上。大規(guī)模培養(yǎng)時(shí)，影響培養(yǎng)液的pH穩(wěn)定性的主要因素有三種：緩沖液的緩沖能力及種類；對(duì)流空間大?。黄咸烟菨舛?。

磷酸對(duì)動(dòng)物細(xì)胞有毒害作用，常用的緩沖系統(tǒng)是NaHCO3/CO2。調(diào)節(jié)培養(yǎng)液pH的方法：A、添加NaHCO3緩沖劑及通入含CO2的空氣進(jìn)行調(diào)節(jié)；

B、用0.1mol/LNaOH或0.1mol/LHCl進(jìn)行調(diào)節(jié)。

利用酸堿直接調(diào)節(jié)會(huì)發(fā)生局部過(guò)酸或過(guò)堿的現(xiàn)象，從而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用。2、營(yíng)養(yǎng)成分細(xì)胞的生長(zhǎng)、繁殖以及產(chǎn)物的合成都必須從環(huán)境中攝取各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以合成細(xì)胞物質(zhì)及在新陳代謝中起調(diào)節(jié)作用。這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)包括碳源、氮源、氨基酸、無(wú)機(jī)鹽、微量元素、生長(zhǎng)因子，等。3、溶解氧氧氣是細(xì)胞代謝所必需的。一般在培養(yǎng)初期要求較低的溶氧水平，而在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期或培養(yǎng)后期，當(dāng)細(xì)胞增多時(shí)溶氧的水平代謝將受到阻礙；而溶氧濃度過(guò)高又對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，使細(xì)胞的代謝受到抑制。影響溶解氧的因素：①通風(fēng)與攪拌②罐壓③培養(yǎng)液的理化性質(zhì)④反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)及空氣分布器⑤傳遞推動(dòng)力4、滲透壓等其他因素滲透壓、血清、剪切力等動(dòng)物細(xì)胞有很大的影響。動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)用培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基是使用最早、最為有效的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基，它主要取自動(dòng)物體液或從動(dòng)物組織分離提取而得；類型①血清優(yōu)質(zhì)的血清外觀應(yīng)為透明、無(wú)溶血、淡黃色、無(wú)沉淀物。②血漿容易發(fā)生液化，目前已很少單獨(dú)使用，一般是禽類血漿。③組織浸出液常用的是胚胎浸出液（如雞胚浸出液），有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。④水解乳蛋白由乳白蛋白經(jīng)水解而制得，氨基酸的含量較高。優(yōu)點(diǎn)是營(yíng)養(yǎng)成分豐富、培養(yǎng)效果良好；缺點(diǎn)是成分復(fù)雜、個(gè)體差異大、來(lái)源有限。合成培養(yǎng)基既能提供一個(gè)近擬于體內(nèi)的生存環(huán)境，又便于控制和提供標(biāo)準(zhǔn)化體外生存環(huán)境。

合成培養(yǎng)基種類很多，但一般都含有氨基酸、維生素、糖類、無(wú)機(jī)離子和一些輔助性成分。根據(jù)天然培養(yǎng)基的成分，用化學(xué)物質(zhì)對(duì)細(xì)胞體生存環(huán)境中各種已知物質(zhì)在體外人工條件的模擬，經(jīng)過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)篩選、強(qiáng)化和重新組合后形成的培養(yǎng)基。主要營(yíng)養(yǎng)成份①氨基酸合成培養(yǎng)基的主要成分，以必需氨基酸為主，一般細(xì)胞僅能利用氨基酸的L－型同分異構(gòu)體。幾乎所有的細(xì)胞對(duì)谷氨酰胺都有較高的要求，細(xì)胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質(zhì)。②維生素維持細(xì)胞生長(zhǎng)的一種生物活性物質(zhì)，它們?cè)诩?xì)胞中大多形成酶的輔基或輔酶，對(duì)細(xì)胞的代謝有重大的影響。③糖類主要是葡萄糖，通過(guò)糖酵解形成丙酮酸，并可轉(zhuǎn)化乳酸或乙酰乙酸進(jìn)入檸檬酸循環(huán)形成CO2。對(duì)胚胎細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞，乳酪在培養(yǎng)基中的積累特別明顯。④無(wú)機(jī)離子⑤其他成分代謝的中間產(chǎn)物氧化還原劑三磷酸腺苷輔酶A等成分。細(xì)胞的重要組成部分之一，參與細(xì)胞的代謝活動(dòng)。培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)離子除K＋、Na＋等外，還含有Fe2+、Zn2＋、Cu2＋等微量離子。常用的合成培養(yǎng)基較為常用的有199培養(yǎng)液、Eagle（MEM、DMEM）、RPM1640、HAM培養(yǎng)液等。隨著細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用范圍的擴(kuò)大，對(duì)各種培養(yǎng)的要求也越來(lái)越嚴(yán)格，多數(shù)人工合成的培養(yǎng)基都要加入不同濃度的血清才能培養(yǎng)細(xì)胞。無(wú)血清培養(yǎng)基血清的成分非常復(fù)雜，對(duì)一些要求較高的基礎(chǔ)性研究的結(jié)果影響較大；血清中也含有一定的毒性物質(zhì)和抑制物質(zhì)，對(duì)細(xì)胞有去分化作用，影響某些細(xì)胞功能的表達(dá)；無(wú)血清培養(yǎng)基一般由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和替代血清的補(bǔ)充因子組成。動(dòng)物細(xì)胞發(fā)酵工藝分批式流加式半連續(xù)式連續(xù)式灌注式細(xì)胞接種后進(jìn)行培養(yǎng)，一方面新鮮培養(yǎng)基不斷地加入反應(yīng)器內(nèi)，另一方面又將培養(yǎng)液連續(xù)不斷地取出，但細(xì)胞留在反應(yīng)器內(nèi)，使細(xì)胞處于不斷的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)中。不同培養(yǎng)工藝對(duì)tPA（人組織型纖維蛋白溶酶原激活劑）的產(chǎn)量和活性的影響培養(yǎng)工藝分批培養(yǎng)半連續(xù)式培養(yǎng)灌注培養(yǎng)純化利率%82165純化物質(zhì)的相對(duì)產(chǎn)量11.337.74比活性（IU/mgtPA）114.4391.3392.6動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)反應(yīng)器及改進(jìn)一動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)用生物反應(yīng)器滿足：低剪切力、良好的混合狀態(tài)、合適氧濃度、等。20世紀(jì)70年代以來(lái)，動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)用生物反應(yīng)器有了很大的發(fā)展，種類越來(lái)越多，規(guī)模越來(lái)越大。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)用生物反應(yīng)器類型懸浮培養(yǎng)反應(yīng)器貼壁培養(yǎng)反應(yīng)器包埋培養(yǎng)反應(yīng)器攪拌反應(yīng)器攪拌反應(yīng)器（微載體培養(yǎng)）流化床反應(yīng)器氣升式反應(yīng)器玻璃珠床反應(yīng)器固定床反應(yīng)器中空纖維反應(yīng)器中空纖維反應(yīng)器

陶質(zhì)矩形通道蜂窩狀反應(yīng)器陶質(zhì)矩形通道蜂窩狀反應(yīng)器

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器1、攪拌罐式生物反應(yīng)器與傳統(tǒng)的微生物反應(yīng)器相類似，只是根據(jù)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的特性，作適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。要求攪拌器轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)產(chǎn)生的剪切力小，混合性能好，同時(shí)通氣培養(yǎng)過(guò)程中盡量減小操作對(duì)細(xì)胞的損傷程度而又能達(dá)到充足供氧的目的。2、氣升式生物反應(yīng)器自1979年Katinger等首次用氣升式生物反應(yīng)器成功地進(jìn)行了動(dòng)物細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)以來(lái)，氣升式生物反應(yīng)器在動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)中的應(yīng)用一直是生物工程學(xué)家關(guān)注和熱衷的焦點(diǎn)。3、中空纖維生物反應(yīng)器中空纖維生物反應(yīng)器是個(gè)特制的圓筒，圓筒里面封裝著數(shù)千根中空纖維。纖維是一種細(xì)微的管狀結(jié)構(gòu)，類似于動(dòng)物組織內(nèi)的毛細(xì)血管，中空纖維的外徑一般為100－500um，管壁厚度約50－75um，管壁是極薄的半透膜，似海綿，富含毛細(xì)管。在中空纖維生物反應(yīng)器中就形成了兩個(gè)空間：一是“內(nèi)室”，即纖維管內(nèi)空間，可灌流無(wú)血清培養(yǎng)液供細(xì)胞生長(zhǎng)；二是“外室”，即纖維管與管之間的間隙；細(xì)胞接種到外室，細(xì)胞貼附在外室的管壁上，并迅速吸取從內(nèi)室滲透出來(lái)的養(yǎng)分，迅速生長(zhǎng)繁殖。中空纖維反應(yīng)器具有無(wú)剪切力和高傳質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)。中空纖維生物反應(yīng)器的總體發(fā)展趨勢(shì)是讓細(xì)胞在管束外空間生長(zhǎng)，以達(dá)到更高的培養(yǎng)細(xì)胞密度。中空纖維材質(zhì)可以是纖維素、改性纖維素、醋酸纖維、聚丙烯、聚砜、銅氨人造纖維、聚甲基丙烯酸甲酯及其他聚合物。大規(guī)模HEK293細(xì)胞發(fā)酵培養(yǎng)

重組腺病毒的純化

實(shí)時(shí)HPLC質(zhì)量監(jiān)測(cè)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)罐式攪拌反應(yīng)器的改進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)的攪拌動(dòng)物細(xì)胞微載體培養(yǎng)技術(shù)1、細(xì)胞培養(yǎng)的攪拌普通葉輪水平剪切力很高，對(duì)動(dòng)物細(xì)胞損害較大。海輪或傾斜葉片產(chǎn)生的混合剪切力，能產(chǎn)生水平和垂直混合速度，對(duì)動(dòng)物細(xì)胞的損害比較小。一般培養(yǎng)過(guò)程攪拌轉(zhuǎn)速控制在40－50rpm。2、動(dòng)物細(xì)胞微載體培養(yǎng)技術(shù)直徑在60-250um微粒，適用于貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)的微珠。微載體培養(yǎng)具有以下優(yōu)點(diǎn)：①表面積/體積大，單位體積培養(yǎng)液的細(xì)胞產(chǎn)率高；②兼有懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)兩種培養(yǎng)方式的優(yōu)點(diǎn)；③可用簡(jiǎn)單的顯微鏡觀察細(xì)胞在微珠表面上生長(zhǎng)情況；④培養(yǎng)基利用率高，勞動(dòng)強(qiáng)度??；⑤細(xì)胞的收獲過(guò)程簡(jiǎn)單。1）動(dòng)物細(xì)胞在微載體表面的貼壁生長(zhǎng)機(jī)制增殖經(jīng)歷：黏附、貼壁、生長(zhǎng)和擴(kuò)展成單層。

作用力：靜電引力和范德華力。表面黏附取決于：細(xì)胞與微載體的接觸幾率、相融性。細(xì)胞與微載體的相融性與載體表面的物理化學(xué)性質(zhì)有關(guān)。2）微載體的主要特性①微載體的大小微載體的顆粒直徑應(yīng)盡可能小，但微載體顆粒太小時(shí)，接種密度較高，就會(huì)對(duì)高密度細(xì)胞培養(yǎng)不利。通常微載體顆粒直徑控制在100－200um之間。②微載體的密度攪拌轉(zhuǎn)速40－50rpm時(shí)，一般在1.03－1.05g/cm3。③微載體的表面電荷

電荷的性質(zhì)并不是控制細(xì)胞黏附和貼壁的決定因素，電荷密度才是關(guān)鍵問(wèn)題，電荷密度太低，細(xì)胞貼附不充分；如果電荷密度太高，將會(huì)出現(xiàn)“毒性”作用而限制細(xì)胞的生長(zhǎng)。3）微載體的種類①以交聯(lián)葡聚糖為基質(zhì)的微載體最廣泛的一類微載體。主要有DEAE－交聯(lián)葡聚糖、Cytodex2微載體、Dormacell微載體、Cytodex3微載體（迄今公認(rèn)的最優(yōu)秀的一種微載體）。②以塑料為基質(zhì)的微載體主要有聚苯乙烯微載體、聚丙烯酰胺微載體等。③明膠/變性膠原微載體④以玻璃為基質(zhì)的微載體⑤以纖維素為基質(zhì)的微載體⑥液膜微載體⑦大孔微載體動(dòng)物細(xì)胞的高密度培養(yǎng)一控制方法1、通氣傳統(tǒng)的細(xì)胞供氧方法會(huì)使一些動(dòng)物細(xì)胞破壞，為了避免，通常采用頂部和表面通風(fēng)，但通常會(huì)引起氧氣的供應(yīng)不足。表面積大的容器更有利于氧氣的傳遞。工業(yè)上通常的做法是采用純氧來(lái)代替空氣，需要連接一個(gè)氧氣放大器來(lái)進(jìn)行控制。2、pH值常用的控制方法空氣和二氧化碳分別由兩根帶閥的螺旋管噴射進(jìn)入培養(yǎng)基，通過(guò)調(diào)節(jié)閥門來(lái)控制pH；用二次流量控制器將二氧化碳與空氣相混合，然后再一起進(jìn)入培養(yǎng)基，混入空氣的二氧化碳總量由此來(lái)決定，從而使pH改變不明顯；通過(guò)增加空氣和減少二氧化碳的量可以降低培養(yǎng)基的pH。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的低攪拌速率和低混合度，易導(dǎo)致局部酸性或堿性過(guò)高的現(xiàn)象，可采用在液面以下滴加酸堿的方法解決。3、溫度控制最有效的溫控方法是通過(guò)在帶夾套的容器中通入一定溫度的水，水在一個(gè)裝有