DB37T 2037-2012 牛白細(xì)胞黏附缺陷癥(BLAD)基因分子檢測(cè)技術(shù)規(guī)程　

DB37DB37/T2037—2012牛白細(xì)胞黏附缺陷癥（BLAD）基因分子檢測(cè)技術(shù)規(guī)程TechnicalSpecificationofMolecularDetectionforBovineLeukocyteAdhesionDeficiency(BLAD)Gene2012-02-09發(fā)布2012-03-01實(shí)施山東省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I1SN/T1917-2007牛地方流行性白牛BLAD發(fā)病原因是由于CD18亞單位編碼區(qū)的383位堿基由A突變?yōu)镚引起的。基于該2用酚-氯仿抽提法從抗凝血或者血凝塊中提取基因組DNA。抗凝血和血凝塊的預(yù)處理按照SN/T1917-2007的規(guī)定執(zhí)行。DNA的提取按照NY/T1672-2008中的規(guī)定執(zhí)行。也可用商業(yè)化DNA提取試劑盒從細(xì)管中取出精液放入1.5mL離心管中，然后，加入500μL生理鹽水，混勻，除去卵黃稀釋液及精輕輕混勻，12000rpm離心10min；吸取上清液，轉(zhuǎn)至1.5mL離心管中，加入150μL酚和150μL氯仿，輕輕混勻5min；吸取上清液，加入500μL無(wú)水乙醇（4℃保存），輕輕顛倒混合；用滅菌槍頭將白色沉淀挑25μL反應(yīng)體系：10×Buffer2.5μL、50mmol/LMgCl21.2μL、10mmol/LdNTP0.6μL、TaqDNA聚合酶2U、10μmol/L引物各1.0μL、模板DNA50～100ng，加雙蒸水至總體積25μL。94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，59℃退火30s，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min，4℃保37.5.3將混合液緩慢倒入制膠板中，排除氣泡，插入多齒梳子。待凝PCR擴(kuò)增的CD18基因片段測(cè)序結(jié)果見(jiàn)附錄C。如圖2所示，將PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果利用DNAstar軟件進(jìn)行表述為正常牛；第501位堿基為A或G時(shí)，且測(cè)序峰圖為套峰，表明是基因型AG，屬于雜合子，該個(gè)體表45主要試劑配制A.210%SDS(十二烷基硫酸鈉)：100A.40.5mol/LNaCl（A.9TE緩沖液取1mol/LTris.HCl（pH8.0）10mL，0.5m1mol/LTris-HCl(pH=8.0)1mL，0.56在10mL水中加入100mg的溴化乙錠（EB），溶解后分裝成7主要儀器設(shè)備2μL，10μL，20μL，100μL，8使用溫度范圍45-135℃,最高使用壓力0.255Mpa。溫控范圍50-300℃,箱內(nèi)尺寸350*350*450mm。91TTACAAGTGCAGGTGGTGATTAAGATGACGAGGAAGTGGGGGGGGGTGTCCCAGGATGGCCACTTAGCAGCTGGTGGTAGAGAAGGCCTTACAACAGTGTGATAACATGACACTCTATATCTCTGTATCTATGTCAGAACGTGTGCTTGCCTGAAATGCACCAGCATAAGAGAATGGGGAGAGTCCTGTGCCCATGAACCCCCCCCACCCCCAGACCAGTGGCAGGTCAGGCAGTTGCGTTCAACGTGACAGCTGGGGGGTGACCTGCTCCGGGCCCTCAATGGCAGGCAGCTACTCCATCTTCCCCTGAAACCCCAAGCCTGCACCCCAAGGGCAGGGCGCCAGGCCCCCTGGTAAGAGGCT