丙型肝炎病毒(HCV)核酸定量檢測標準操作規(guī)程(PCR-熒光探針法)

丙型肝炎病毒（HCV）核酸定量檢測標準操作規(guī)程（PCR-熒光探針法）1.目的：規(guī)范HCV-RNA（PCR）檢測操作流程，保證檢測結果的準確性。2.應用范圍：HCV-RNA熒光定量檢測。3.職責:3.1文件編寫：實驗室技術員。3.2文件審核：實驗室主管。3.3文件審批：實驗室主任。3.4執(zhí)行：PCR實驗室所有工作人員。4.參考文獻：4.1中山大學達安基因股份有限公司丙型肝炎病毒核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）說明書。4.2中山大學達安基因股份有限公司核酸擴增熒光檢測系統(tǒng)DA7600型使用說明書。5.內容：5.1檢測方法：PCR-熒光探針法5.2實驗原理：用一對丙型肝炎病毒特異性引物和一條丙型肝炎病毒特異性熒光探針，配以逆轉錄液、逆轉錄酶、PCR反應液、耐熱DNA聚合酶（Taq酶）、四種核苷酸單體（dNTPs）等成分，先將RNA逆轉錄成cDNA，再通過PCR體外擴增法，即高溫變性、低溫退火、適溫延伸進行DNA擴增，并對PCR全過程進行實時監(jiān)測,從而檢測丙型肝炎病毒RNA。主要用于HCV病毒感染的輔助診斷及其療效監(jiān)測的標準。5.3性能參數：5.3.1精密度：檢測下限為1.0x103copies/ml。5.3.2線性范圍：1.0x103～1.0x108copies/ml。5.4標本采集：5.4.1使用標本類型：血清。5.4.2標本采集：由合作單位按照以下要求進行采集，采集后及時分離出血清在2～8℃條件下保存。用一次性無菌注射器抽取受檢者靜脈血2ml，注入無菌的干燥玻璃管，室溫（22～25℃）放置30～60min，全血標本可自發(fā)完全凝集析出血清，或直接使用水平離心機，1500rpm離心5min；吸取上層血清，轉移至1.5ml滅菌離心管。5.4.3標本保存和運送：分離后的血清在2～8℃條件下保存應不超過72小時，-20℃可保存1個月，要長期保存的需分裝后儲存于-70℃。應避免反復凍融。標本運送采用0℃冰壺。5.4.4標本拒收標準：污染、嚴重溶血、脂血類或肝素抗凝劑標本。5.5設備和試劑：5.5.1設備：DA7600熒光定量PCR儀、低速水平離心機、生物安全柜、臺式高速離心機、移液器、混勻器、干式恒溫器、冰箱（4℃、-20℃）、移動/固定紫外燈、冷凍離心機。5.5.2試劑：5.5.2.1試劑品牌：中山大學達安基因股份有限公司丙型肝炎病毒核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）5.5.2.2試劑批準文號：國藥準字2014第3400033號。5.5.2.3試劑組成：組分名稱規(guī)格數量主要成分核酸提取試劑RNA提取液A200μL/管1二氧化硅、DEPC水RNA提取液B5mL/管2GuSCN、Tris-HCL、EDTA、Triton-100DEPCH2O3ml/瓶1DEPCPCR擴增試劑HCV內標溶液100μL/管1含內標片段的病毒樣顆粒及穩(wěn)定劑HCV反應液A270μL/管1引物、探針、Tris鹽酸BufferHCV反應液B30μL/管1Taq酶、逆轉錄酶、RNasin質控品陰性質控品200μL/管1陰性血漿HCV強陽性質控品200μL/管1HCV陽性血漿HCV臨界陽性質控品200μL/管1HCV陽性血漿5.5.2.4試劑保存和有效期：保存于-20±5℃；有效期9個月。5.5.2.6配套提取試劑盒組成：組分名稱規(guī)格數量離心柱20個/包1收集管80個/包1裂解液4.4ml/瓶1抑制物去除液（濃縮液）7ml/瓶1去離子液（濃縮液）4.4ml/瓶1洗脫液3ml/瓶1蛋白酶K（干粉）22mg/瓶1CarrierRNA（干粉）155ug/管15.5.2.7自備試劑：無水乙醇5.6操作過程：待測樣本、陽性質控品、陰性質控品同步處理。5.6.1實驗前準備：5.6.1.1抑制物去除液（濃縮液）中加入4.3ml的無水乙醇，并在管蓋及管壁上打勾。室溫保存。5.6.1.2去離子液（濃縮液）中加入17.6ml的無水乙醇，并在管蓋及管壁上打勾。室溫保存。5.6.1.3蛋白酶K（干粉）中加入1.1ml的洗脫液，充分混勻，溶解。-20℃保存。5.6.1.4CarrierRNA（干粉）中加入110ul的洗脫液或內標溶液（PCR試劑盒中成分），充分混勻，溶解。-20℃保存。5.6.1.5配制CarrierRNA-裂解工作液（現配現用）1人份20人份裂解液200ul4mlCarrierRNA4ul80ul5.6.2RNA提?。?.6.2.1在1.5ml的無菌離心管中加入50ul的蛋白酶K；5.6.2.2取200ul樣本加入離心管中；5.6.2.3再加入200ul的裂解工作液（即已含CarrierRNA的裂解液），蓋緊管蓋，漩渦震蕩15秒以充分混勻，高速離心10秒（防止溫育是產生氣泡），72℃10分鐘；同時將洗脫液置于72℃預熱。5.6.2.4加入250ul無水乙醇，蓋緊管蓋。漩渦震蕩15秒。5.6.2.5將混合液全部吸至離心柱，室溫下12000g離心1分鐘，將離心柱轉至新的收集管；5.6.2.6將500ul的抑制物去除液加入離心柱，室溫下12000g離心1分鐘，將離心柱轉至新的收集管；5.6.2.7將500ul的去離子液加入離心柱，室溫下12000g離心1分鐘，將離心柱轉至新的收集管；5.6.2.8重復上一步操作一次；5.6.2.9將離心柱-收集管于室溫下14000g離心3分鐘以除去殘留的乙醇；5.6.2.10將離心柱取出，放入新的1.5ml離心管。打開離心柱蓋子，72℃放置2分鐘(使用干式恒溫器，不能使用水浴鍋)；5.6.2.11在離心柱的膜上方小心加入72℃預熱的洗脫液50ul，蓋緊管蓋，室溫靜置1分鐘后，14000g離心1分鐘。離心管內即為核酸溶液，立即使用或放于-20℃?zhèn)溆谩?.6.3排版：根據樣本數量編寫《PCR實驗室DA－7600取試劑、加樣、擴增對照圖面版表》，注意添加陰性質控，陽性質控。5.6.4加樣：5.6.4.1配制HCV單人份擴增體系：取N個（N=待檢樣本個數+陰性質控平+陽性質控品）PCR反應管，按下表進行配制：組分HCV反應液AHCV反應液B總體積用量27ul3ul30ul將各組分充分混勻，混合好后進行短時離心將管壁上的液體全部離心至管底，之后將30ul擴增體系分裝到PCR反應管管中。5.6.4.2根據排版，往上述PCR反應管中加入對應的樣本核酸各20ul。蓋緊管蓋，瞬時離心后上機進行擴增。5.6.5DA7600的設置及結果分析：參見《達安7600熒光定量PCR儀操作、校準及保養(yǎng)規(guī)程》及《基因擴增檢測及結果分析規(guī)程》。5.6.6記錄實驗數據。5.6.7取出結束后擴增儀內擴增產物需用一次性手套包好、封口后，丟入醫(yī)療廢物垃圾桶內，以防止擴增管破裂而導致污染。5.6.8關閉擴增儀電源和計算機電源。5.7注意事項：5.7.1PCR熒光檢測法比較容易受污染，所以實驗過程中應避免反復開蓋，所用耗材均需高壓滅菌。5.7.2RNA提取步驟建議冰上操作。吸取血清時注意勿帶入紅細胞。5.7.3試劑使用前要完全解凍，但應避免反復凍融。5.7.4RNA提取液A必須充分混勻后吸取，RNA提取液B需溶解混勻后使用。5.7.5逆轉錄成cDNA后，需馬上進行下一步實驗，否則須轉移上清至滅菌離心管，保存于-20℃待用。5.8安全防護措施：5.8.1試劑處理：5.8.1.1使用或更換試劑時，務必戴手套；不要用身體直接接觸試劑，以免損傷皮膚。5.8.1.2如果皮膚接觸了試劑，立即用大量清水沖洗并消毒。5.8.1.3如果眼睛接觸了試劑，立即用噴淋器沖洗，并緊急就醫(yī)。5.8.2儀器使用：5.8.2.1儀器運轉中不要觸摸加樣機構、試劑分注機構、攪拌機構、反應容器清洗機構等可動部分。5.8.2.2儀器通電時不能打開儀器上面、背面、側面的蓋板，不能觸摸光源燈的玻璃面。5.8.3生物安全防護：參見《生物安全防護手冊》6.相關記錄表格:6.1LAB-SOP-PCR-005-T01-001《PCR實驗室實驗、交接班記錄表》6.2LAB-SOP-PCR-015-T01-001《PCR實驗室遲發(fā)報告登記表》6.3LAB-SOP-PCR-014-T01-001《PCR實驗室不合格標本登記表》6.4LAB-SOP-PCR-025-T01-001《PCR實驗室DA－7600取試劑、加樣、擴增對照圖面版表》本SOP文件頒發(fā)部門:質管部本SO