植物工廠化育苗教學(xué)課件 7繼代培養(yǎng)

繼代培養(yǎng)——植物工廠化育苗

繼代培養(yǎng)（一）繼代培養(yǎng)繼代培養(yǎng)是繼初代培養(yǎng)之后的連續(xù)數(shù)代的擴(kuò)繁培養(yǎng)過程。目的：繁殖出相當(dāng)數(shù)量的無根苗，最后能達(dá)到邊繁邊生根的目的。繼代培養(yǎng)的后代是按幾何級數(shù)增加的過程。

繼代培養(yǎng)中擴(kuò)繁的方法：①切割莖段：常用于有伸長的莖梢、莖節(jié)較明顯的培養(yǎng)物。這種方法簡便易行，能保持母種特性。②分離芽叢：適于由愈傷組織生出的芽叢。③分離胚狀體：胚狀體是愈傷組織在一定的培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)形成的，類似胚的結(jié)構(gòu)，具有胚芽和胚根，在合適的條件下可發(fā)育成為新的植株。④分離原球莖。

繼代培養(yǎng)增殖方式1、定芽（包括頂芽，腋芽）發(fā)生型：

選取具有頂芽和腋芽的短枝無菌培養(yǎng)，誘導(dǎo)芽萌發(fā)成苗或增殖產(chǎn)生許多不定芽發(fā)育成苗，將新萌生的枝條再轉(zhuǎn)接繼代，重復(fù)芽到苗的增殖過程，最后使其生根形成植株的方式。將莖尖或者帶有腋芽側(cè)芽的莖段在培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)，使定芽，腋芽不斷萌發(fā)，生長再生芽，再生成莖段最后形成叢生芽叢生莖段然后將叢生芽再進(jìn)行分割，繼續(xù)接種在繼代培養(yǎng)基中，以此形式達(dá)到增殖效果。2、不定芽發(fā)生型：

除了葉腋和頂芽以外，從植物體上任何部位或組織產(chǎn)生的芽都稱之為不定芽。植物許多器官都可以作為誘導(dǎo)不定芽產(chǎn)生的外植體，比如莖段，葉，葉柄花瓣等。繁殖方式與定芽發(fā)生型一樣不斷萌發(fā)生長，最后形成叢生無根植株，繼續(xù)分割繼代培養(yǎng)增殖，或者生根繁殖。與定芽發(fā)生型的區(qū)別就是新的幼苗植株產(chǎn)生的位置不同，上面產(chǎn)生在頂芽側(cè)芽，這個(gè)產(chǎn)生的位置在其他部位。3、通過愈傷組織發(fā)生：

誘導(dǎo)器官外植體產(chǎn)生愈傷組織，經(jīng)分化培養(yǎng)形成芽、根再生成植株的方式。

離體組培過程中植物材料通過激素誘導(dǎo)，已分化的組織經(jīng)過脫分化,產(chǎn)生無序的分生狀態(tài)的組織細(xì)胞團(tuán)(愈傷組織)再經(jīng)過培養(yǎng)再分化形成不同器官最后形成完整植株。

胚狀體發(fā)生型：

指植物器官、組織和細(xì)胞外植體經(jīng)培養(yǎng)脫分化形成胚狀體再成苗的方式。

胚狀體是組培苗的體細(xì)胞經(jīng)過激素誘導(dǎo)脫分化形成的，胚狀體與種子胚發(fā)育過程相似，通過球形、心形，子葉形的胚胎發(fā)育期，最后形成完整的小植株。胚狀體可以從愈傷組織表面形成或者懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞上得到。胚狀體發(fā)育出的再生小植株與其他增殖方式發(fā)育出的小植株有兩個(gè)顯著不同的差異，一個(gè)是定芽，不定芽苗發(fā)育要先經(jīng)過器官發(fā)生，在芽處發(fā)生單極性的枝條或無根苗，然后經(jīng)過一個(gè)或一個(gè)以上培養(yǎng)階段進(jìn)行生根形成完整植物。

胚狀體發(fā)育型特點(diǎn)：有明顯的根端及莖段，具兩極分化。而定芽不定芽是單極性的只是向上長枝條無根苗發(fā)育成的小植株。與周圍愈傷組織或母體組織沒有結(jié)構(gòu)上的聯(lián)系，小植株是獨(dú)立形成的。易于與其它部分分離，不需要誘導(dǎo)生根階段。定芽不定芽發(fā)育型由分生細(xì)胞團(tuán)形成單極性生長點(diǎn)，發(fā)育成芽，隨后轉(zhuǎn)移到誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)成為完整植株。原球莖途徑：即外植體經(jīng)培養(yǎng)產(chǎn)生原球莖，再直接長成植株。

原球莖是蘭花種子發(fā)芽過程中的一種形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)，種子萌發(fā)初期不像其他植物出現(xiàn)胚根，只是胚逐漸膨大，以后種皮一斷破裂，脹大的胚成圓錐形稱為原球莖。他是蘭科植物特有的一種再生方式。

蘭花組培中，常從莖尖或側(cè)芽培養(yǎng)中產(chǎn)生原球莖，他本身增殖，一個(gè)芽周圍能產(chǎn)生幾個(gè)很多個(gè)原球莖，培養(yǎng)一段時(shí)間后，原球莖轉(zhuǎn)綠，這時(shí)可長出毛狀假根，可轉(zhuǎn)移培養(yǎng)生根，形成完整植株。

如果是擴(kuò)大繁殖，應(yīng)該在轉(zhuǎn)綠之前將其切割成小塊或給予針刺等損傷，轉(zhuǎn)移到新鮮增殖培養(yǎng)基上，可以增殖很多原球莖可以想增殖多少就繁殖多少。蘭花最初每個(gè)莖尖或側(cè)芽大約2個(gè)月左右產(chǎn)生3-5個(gè)原球莖，然后每個(gè)再切成4-6塊，每一塊在1個(gè)月內(nèi)可產(chǎn)生3-5個(gè)原球莖。

培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件選擇

1、選擇培養(yǎng)基或條件時(shí)首先查找文獻(xiàn)，參考近緣品種的培養(yǎng)基配方成分及培養(yǎng)條件的要求。

2、在此基礎(chǔ)上可用單因子試驗(yàn)或多因子試驗(yàn)。比如ms﹢NAA0.1-0.2﹢BA1-3

第一組：1-1ms﹢NAA0.1-0.2﹢BA11-2ms﹢NAA0.1-0.2﹢BA21-3ms﹢NAA0.1-0.2﹢BA3第二組2-1ms﹢BA1﹢NAA0.052-2ms﹢BA1﹢NAA0.1

6-BAmg/L）00.52.5510NAA012345(mg/L)0.56789102.5111213141551617181920102122232425

對培養(yǎng)基中兩個(gè)或兩個(gè)以上因素進(jìn)行研究的試驗(yàn)稱為多因子實(shí)驗(yàn)，各個(gè)因子的每個(gè)水平都相互搭配，構(gòu)成了所有可能的處理組合，如研究NAA和6—BA的最佳濃度組合，每個(gè)因子各設(shè)5個(gè)濃度水平(0，0.5，2.5，5，10mg／L)，這兩種因子各種濃度的所有組合，就構(gòu)成了一個(gè)具有25項(xiàng)處理的試驗(yàn)。二、多因子試驗(yàn)2種激素5種濃度的實(shí)驗(yàn)組合在快速繁殖中初代培養(yǎng)只是一個(gè)必經(jīng)的過程，繼代培養(yǎng)達(dá)到相當(dāng)?shù)臄?shù)量之后，則應(yīng)考慮使其中一部分轉(zhuǎn)入生根階段。繼代增殖只是貯備母株，而生根是增殖材料的分流，生產(chǎn)出成品。1、馴化，在植物組織培養(yǎng)的研究中，發(fā)現(xiàn)一些植物的組織經(jīng)長期繼代培養(yǎng)，發(fā)生一些變化，在開始的繼代培養(yǎng)中需要生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的植物材料，其后加入少量或不加入生長調(diào)節(jié)物質(zhì)就可以生長，此現(xiàn)象就叫作“馴化”。芽又細(xì)又弱

2、不同的植物其保持再生能力的時(shí)間是不同的，而且差異很大，在以腋芽或不定芽增殖繼代的植物中，在培養(yǎng)許多代之后仍然保持著旺盛的增殖能力，有的則出現(xiàn)再生能力喪失問題。注意;一般能達(dá)到每月繼代增殖3倍—10倍，即可用于大量繁殖，盲目追求過高增殖倍數(shù)，一是所產(chǎn)生的苗小而弱，給生根、移栽帶來很大困難；二是可能會引起遺傳性不穩(wěn)定，造成災(zāi)難性后果。試管苗繼代培養(yǎng)幾種現(xiàn)象影響繼代培養(yǎng)的一些因素（1）植物材料的影響（2）培養(yǎng)基及培養(yǎng)件（3）繼代培養(yǎng)時(shí)間長短（4）季節(jié)的影響（1）植物材料的影響

不同種類植物，同種植物不同品種，同一植物不同器官和不同部位繼代繁殖能力也不相同。一草本＞木本；被子植物＞裸子植物；年幼材料＞老年材料；剛分離組織＞已繼代的組織；胚＞營養(yǎng)體組織；芽＞胚狀體＞愈傷組織。（2）培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件適當(dāng)與否，對能否繼代培養(yǎng)影響頗大。如：在水仙鱗片基部再生子球的繼代培養(yǎng)中，加活性炭的培養(yǎng)基中再生子球比不加活性炭的要高出一至幾倍。（3）繼代培養(yǎng)時(shí)間長短

長期繼代可保持原來的再生能力和增殖率，如：葡萄、月季和倒掛金鐘等。有的經(jīng)過一定時(shí)間繼代培養(yǎng)后才有分化再生能力。如：潘景麗等進(jìn)行沙棗愈傷組織繼代培養(yǎng)6次后，才分化苗，保持二年，仍具有分化能力。有的隨繼代時(shí)間加長而分化再生繁殖能力降低，

如：杜鵑莖尖外植體，通過連續(xù)繼代培養(yǎng)，產(chǎn)生小枝數(shù)量開始增加，但在第四或第五代則下降，雖可用光照處理或在培養(yǎng)基中提高生長素濃度，以減慢下降，但無法阻止，因此必須進(jìn)行材料的更換。（4）季節(jié)的影響

有些植物材料能否繼代與季節(jié)有關(guān)。

如：水仙取6、7月份的鱗莖，因夏季休眠，生長變慢，8月休眠后，生長速度又加快。百合鱗片分化能力的高低表現(xiàn)為春季＞秋季＞夏季＞冬季。球根類植物組織培養(yǎng)繁殖和胚培養(yǎng)時(shí)，就要注意繼代培養(yǎng)不能增殖，是因其進(jìn)入休眠，可通過加入激素和低溫處理來克服。唐菖蒲在MS培養(yǎng)基上得到的球莖，移植于MS培養(yǎng)基中，無機(jī)鹽和糖濃度減半，并增加萘乙酸用量，可以防止繼代中的休眠。繼代培養(yǎng)步驟（1）超凈工作臺滅菌：接通電源，打開紫外燈，同時(shí)打開風(fēng)機(jī)，滅菌20min；（2）人員準(zhǔn)備：洗凈雙手，穿上實(shí)驗(yàn)服進(jìn)入接種室。在超凈臺內(nèi)用酒精棉球（或新潔爾滅稀釋液）擦拭雙手，臺面及接種工具、種苗瓶表面。（3）種苗瓶準(zhǔn)備：要選擇生長勢好，苗高在3cm以上種苗瓶，每人取10瓶的裝有繼代培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶放入超凈臺內(nèi)；（4）轉(zhuǎn)接前準(zhǔn)備：將酒精燈放在距超凈臺邊緣30cm，正對身體正前方處。將種苗瓶放在燈前偏左處，繼代培養(yǎng)瓶放在燈前處，消毒瓶放在燈右處，以利方便操作；

（5）轉(zhuǎn)接：打開原種瓶，將瓶口過火一次，置于一定位置。剪刀和鑷子灼燒滅菌后，左手水平持種苗瓶，右手持鑷子，使種苗瓶瓶口與右手所持的鑷子在同一水平線上，將芽叢從瓶中取出，放在無菌濾紙上，用手術(shù)刀和鑷子配合對芽叢進(jìn)行分割，并把每個(gè)小枝條切割成1-1.5cm的莖段，每個(gè)莖段上至少應(yīng)帶有一個(gè)腋芽。打開盛有繼代培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶，瓶口過火一次，用過火、冷卻的鑷子夾住分割的莖段并迅速轉(zhuǎn)接在瓶中，每瓶轉(zhuǎn)接5～6個(gè)莖段，接完后瓶口過火封口。以后重復(fù)上述動作，每人接10瓶。（6）每接5瓶后，再用酒精棉球擦拭雙手一次，以防交叉感染；（7）每接完10瓶后，寫明接種日期、品種編號、培養(yǎng)基編號和姓名等，移出超凈臺，置于臺頂，再接下一批；（8）轉(zhuǎn)接結(jié)束