2010年微生物限度檢查法修訂課件

2010年微生物限度檢查法修訂2010年版微生物限度檢查法

增修訂內(nèi)容簡(jiǎn)介——以《中國藥典》一部為例2010年微生物限度檢查法修訂一、增加的內(nèi)容1、增加了貼劑的微生物檢查方法檢查方法：取規(guī)定量供試品，去掉貼劑的保護(hù)層，放置在無菌玻璃或塑料片上，粘貼面朝上。用適宜的無菌多孔材料（如無菌紗布）覆蓋貼劑的粘貼面以避免貼劑粘貼在一起。然后將其置于適宜體積并含有滅活劑（如聚山梨酯80或卵磷脂）的稀釋劑中，用力振蕩至少30分鐘，或以其他方法制備成供試液。貼膏劑應(yīng)采用薄膜過濾法進(jìn)行細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)。2010年微生物限度檢查法修訂2、增加了計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的適用性檢查細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)用的培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基的適用性檢查，包括成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按培養(yǎng)基處方配制的培養(yǎng)基均應(yīng)檢查。2010年微生物限度檢查法修訂2、增加了計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的適用性檢查適用性檢查：取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌各50～100cfu，分別注入無菌平皿中，立即傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，混勻，凝固，置30～35℃培養(yǎng)48hr，計(jì)數(shù)；取白色念珠菌、黑曲霉各50～100cfu，分別注入無菌平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，混勻，凝固，置20～25℃培養(yǎng)72hr，計(jì)數(shù)；取白色念珠菌50～100cfu，注入無菌平皿中，立即傾注酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，平行制備2個(gè)平皿，混勻，凝固，置20～25℃培養(yǎng)72hr，計(jì)數(shù)。同時(shí)，用對(duì)應(yīng)的對(duì)照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進(jìn)行上述試驗(yàn)。2010年微生物限度檢查法修訂2、增加了計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的適用性檢查結(jié)果判定：被檢培養(yǎng)基的菌落數(shù)與對(duì)照培養(yǎng)基菌落數(shù)相比大于70%，且菌落形態(tài)大小應(yīng)與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落一致。判該培養(yǎng)基的適用性檢查符合規(guī)定。2010年微生物限度檢查法修訂3、增加了菌液使用時(shí)間的有關(guān)規(guī)定菌懸液制備后應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)使用，若保存在2～8℃的菌懸液可以在24小時(shí)內(nèi)使用。黑曲霉也可制成穩(wěn)定的孢子懸液保存在2～8℃，在驗(yàn)證過的貯存期內(nèi)替代對(duì)應(yīng)量的新鮮孢子懸液使用。2010年微生物限度檢查法修訂4、刪除了離心沉淀集菌法原因：由三個(gè)所組成的課題組進(jìn)行了離心沉淀集菌法的標(biāo)準(zhǔn)化研究，結(jié)果表明：離心沉淀集菌法對(duì)試驗(yàn)菌的損傷較大。2010年微生物限度檢查法修訂5、增加了常見干擾物的中和劑或滅活方法微生物限度檢查法.pdf2010年微生物限度檢查法修訂6、增加了沒有辦法消除供試品中的抑菌作用的情況及相關(guān)規(guī)定若沒有適宜的方法消除供試品中的抑菌作用，那么驗(yàn)證試驗(yàn)中微生物回收的失敗可看成是因供試品的抗菌活性引起的，同時(shí)表明該供試品不能被試驗(yàn)菌污染。然而，供試品也可能僅對(duì)試驗(yàn)用菌株具有抑制作用，而對(duì)其他菌株沒有抑制作用。因此，根據(jù)供試品須符合的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)和菌數(shù)報(bào)告規(guī)則，在不影響檢驗(yàn)結(jié)果判斷的前提下，應(yīng)采用能使微生物生長的更高稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行方法驗(yàn)證試驗(yàn)。若驗(yàn)證試驗(yàn)符合要求，應(yīng)以該稀釋級(jí)供試液作為最低稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行供試品檢驗(yàn)。2010年微生物限度檢查法修訂6、增加了沒有辦法消除供試品中的抑菌作用的情況及相關(guān)規(guī)定計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證時(shí)，若采用上述計(jì)數(shù)方法總存在一株或多株試驗(yàn)菌的回收率達(dá)不到要求，那么選擇回收情況最接近要求的方法和試驗(yàn)條件進(jìn)行供試品的檢測(cè)。2010年微生物限度檢查法修訂7、細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)檢查

增加了陽性對(duì)照陽性對(duì)照除另有規(guī)定外，抗真菌供試品以白色念珠菌為對(duì)照菌，其它供試品以金黃色葡萄球菌為對(duì)照菌，按供試品的細(xì)菌（霉菌和酵母菌）計(jì)數(shù)方法，測(cè)定試驗(yàn)菌在該供試品中的回收率?；厥章蕬?yīng)不小于70％。否則實(shí)驗(yàn)結(jié)果無效，應(yīng)重新確定計(jì)數(shù)方法。2010年微生物限度檢查法修訂8、增加了薄膜過濾法每張濾膜

沖洗量的規(guī)定每張濾膜每次沖洗量不超過100ml，總沖洗量不得超過1000ml濾膜直徑一般為50mm，若采用其它直徑的濾膜，沖洗量應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。2010年微生物限度檢查法修訂9、增加了選擇濾膜材質(zhì)的原則

選擇濾膜材質(zhì)時(shí)應(yīng)保證供試品及其溶劑不影響微生物的充分被截留。濾器及濾膜使用前應(yīng)采用適宜的方法滅菌。使用時(shí)，應(yīng)保證濾膜在過濾前后的完整性。水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。油類供試品，其濾膜和過濾器在使用前應(yīng)充分干燥。為發(fā)揮濾膜的最大過濾效率，應(yīng)注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個(gè)濾膜表面。2010年微生物限度檢查法修訂10、增加了控制菌檢查用培養(yǎng)基

的適用性檢查

控制菌檢查用的培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基的適用性檢查，成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按培養(yǎng)基處方配制的培養(yǎng)基均應(yīng)檢查。檢查項(xiàng)目包括培養(yǎng)基的促生長、指示和抑制特性能力。微生物限度檢查法.pdf2010年微生物限度檢查法修訂10、增加了控制菌檢查用培養(yǎng)基

的適用性檢查增菌培養(yǎng)基促生長能力檢查：分別接種不大于100cfu的試驗(yàn)菌（見表2）于被檢培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基中，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及最短培養(yǎng)時(shí)間下培養(yǎng)。與對(duì)照培養(yǎng)基管比較，被檢培養(yǎng)基管試驗(yàn)菌應(yīng)生長良好。2010年微生物限度檢查法修訂10、增加了控制菌檢查用培養(yǎng)基

的適用性檢查固體培養(yǎng)基促生長能力檢查：取試驗(yàn)菌各0.1ml（50～100cfu）分別涂布于被檢培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基平板中，每種培養(yǎng)基平行制備2個(gè)平皿，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及最短培養(yǎng)時(shí)間下培養(yǎng)，計(jì)數(shù)。被檢培養(yǎng)基的菌落數(shù)與對(duì)照培養(yǎng)基菌落數(shù)相比應(yīng)不小于70%，且生長的菌落形態(tài)應(yīng)一致。2010年微生物限度檢查法修訂10、增加了控制菌檢查用培養(yǎng)基

的適用性檢查培養(yǎng)基抑制能力檢查：劃線接種試驗(yàn)菌（見表2）于被檢培養(yǎng)基平板上，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度和時(shí)間下培養(yǎng)，試驗(yàn)菌應(yīng)不得生長。2010年微生物限度檢查法修訂10、增加了控制菌檢查用培養(yǎng)基

的適用性檢查培養(yǎng)基指示能力檢查：分別接種少量試驗(yàn)菌（見表2）于被檢培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基平板上，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度和時(shí)間下培養(yǎng)。被檢培2010年微生物限度檢查法修訂11、增加了白色念珠菌控制菌檢查主要針對(duì)婦女陰道用藥，為保證其安全性而增加。檢查法：取供試液10ml（相當(dāng)于供試品1g、1ml、10cm2）直接或處理后接種至適量（不少于100ml）的沙氏葡萄糖肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24～48小時(shí)。取上述培養(yǎng)物劃線接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)24～48小時(shí)（必要時(shí)延長至72小時(shí)）。2010年微生物限度檢查法修訂11、增加了白色念珠菌控制菌檢查白色念珠菌在沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長的菌落呈乳白色偶見淡黃色，表面光滑有濃酵母氣味，培養(yǎng)時(shí)間稍久則菌落增大，顏色變深、質(zhì)地變硬或有皺摺。若平板上無菌落生長或生長的菌落與上述菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢出白色念珠菌。如平板上生長的菌落與上述菌落形態(tài)特征相符或疑似，應(yīng)挑選2～3個(gè)菌落分別接種至念珠菌顯色培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)24～48小時(shí)（必要時(shí)延長至72小時(shí)）。若平板上無綠色或翠綠色的菌落生長，判供試品未檢出白色念珠菌。若平板上生長的菌落為綠色或翠綠色，挑取相符或疑似的菌落接種于1%吐溫80玉米瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24～48小時(shí)。取培養(yǎng)物進(jìn)行染色，鏡檢及芽管試驗(yàn)。2010年微生物限度檢查法修訂11、增加了白色念珠菌控制菌檢查芽管試驗(yàn)挑取1%吐溫80玉米瓊脂培養(yǎng)基上的培養(yǎng)物，接種于加有一滴血清的載玻片上，蓋上蓋玻片，置濕潤的平皿內(nèi)，置35～37℃、1～3h，置顯微鏡下觀察，可見到由孢子長出短小芽管。若上述疑似菌為非革蘭陽性菌，顯微鏡未見厚膜孢子、假菌絲、芽管，判供試品未檢出白色念珠菌。2010年微生物限度檢查法修訂二、修訂內(nèi)容1、修訂了控制菌培養(yǎng)溫度控制菌培養(yǎng)溫度由35～37℃修訂為30～35℃。此項(xiàng)修訂不妥，原因：2010版控制菌增加了白色念珠菌，此菌為酵母菌，培養(yǎng)溫度為23～28℃。2010年微生物限度檢查法修訂2、刪除了控制菌檢查驗(yàn)證方法中

陰性菌對(duì)照組試驗(yàn)試驗(yàn)表明：陰性菌對(duì)照組實(shí)踐意義不大2010年微生物限度檢查法修訂3、修訂了菌數(shù)報(bào)告規(guī)則

細(xì)菌、酵母菌宜選取細(xì)菌、酵母菌平均菌落數(shù)（在30～300之間）小于300cfu、霉菌宜選取平均菌落數(shù)（在30～100之間）小于100cfu的稀釋級(jí)，作為菌數(shù)報(bào)告（取兩位有效數(shù)字）的依據(jù)。以最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報(bào)告1g、1mL或10cm2供試品中所含的菌數(shù)。微生物限度檢查法.pdf

2010年微生物限度檢查法修訂4、修訂了菌落培養(yǎng)和計(jì)數(shù)時(shí)間

培養(yǎng)和計(jì)數(shù)除另有規(guī)定外，細(xì)菌培養(yǎng)48小時(shí)3天，逐日點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)，一般以48小時(shí)3天的菌落數(shù)報(bào)告；霉菌、酵母菌培養(yǎng)72小時(shí)5天，逐日點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)，一般以72小時(shí)5天的菌落數(shù)報(bào)告；必要時(shí)，可適當(dāng)延長培養(yǎng)時(shí)間至5～7天進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)并報(bào)告。2010年微生物限度檢查法修訂5、刪除了庖肉培養(yǎng)基增加：梭菌增菌培養(yǎng)基

沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基

沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基念珠菌顯色培養(yǎng)基(CHROMAGAR)

玉米-吐溫80瓊脂培養(yǎng)基2010年微生物限度檢查法修訂6、微生物限度標(biāo)準(zhǔn)修訂內(nèi)容6.1含豆豉、神曲等發(fā)酵成分的制劑修訂為含豆豉、神曲等發(fā)酵成