T-CI 390-2024 健康人（異體）免疫細胞（CIK）的制備技術和應用規(guī)

CCSC272024-06-24發(fā)布IT/CI390－2024 Ⅲ健康人（異體）免疫細胞（CIK）的制備技術和應用規(guī)程 2規(guī)范性引用文件 3術語和定義 4儀器設備條件和細胞培養(yǎng)器材 5溶液配制和細胞培養(yǎng)技術 6CIK細胞制備規(guī)程 7質量檢測和標準 8檢驗與放行 9標注，運輸與追蹤 610CIK細胞臨床治療方案和療效評價 6 912參考文獻 11T/CI390－2024本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由澳科大生命科技集團有限公司提出。本文件由中國國際科技促進會歸口。本文件起草單位:澳科大生命科技集團有限公司、廣州市坤圣生物科技有限公司、南方醫(yī)科大學中西醫(yī)結合醫(yī)院、廣州市番禺區(qū)化龍醫(yī)院、廣州中醫(yī)藥大學金沙洲醫(yī)院、青島瑞思德生物科技有限公司、青島瑞思德醫(yī)學檢驗實驗室有限公司。本文件主要起草人員：祁巖超、張衛(wèi)東、祁秋干、紀娜、王遠東、史強、楊高遠、段紅偉、周晶、陳夢夢、張炳強。本文件是首次發(fā)布。T/CI390－2024本文件的發(fā)布機構對于該專利的真實性、有效性和范圍無任何立場。該專利持有人已向本文件的發(fā)布機構保證，他愿意同任何申請人在合理且無歧視的條款和條件下，就專利授權許可進行談判。該專利持有人的聲明已在本文件的發(fā)布機構備案。相關信息可以通過以下聯(lián)系方式獲得：專利持有人姓名：廣州市坤圣生物科技有限公司地址：廣州市黃埔區(qū)廣州國際生物島寰宇一路27號云潤大廈703室聯(lián)系人：祁巖超電話箱：ycqi@163.net請注意除上述專利外，本文件的某些內(nèi)容仍可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別這些專利的責任。1T/CI390—2024健康人（異體）免疫細胞（CIK）的制備技術和應用規(guī)程本文件規(guī)定了CIK免疫細胞的制備技術規(guī)程。本文件適用于人免疫細胞的生產(chǎn)、運輸、存放。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。YY0572-2015《血液透析及相關治療用水》YY0598-2006《血液透析及相關治療用濃縮物》T/CGCPU019—2022《免疫細胞產(chǎn)品供者材料管理要求》3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1免疫細胞產(chǎn)品immunecellproducts經(jīng)過體外分離、培養(yǎng)、擴增后制成的人源活免疫細胞3.2供者donor用于免疫細胞產(chǎn)品（3.1）采集、制備的細胞的來源是人3.3供者材料suppliermaterials從供者外周血，臍帶血獲得的用于免疫細胞產(chǎn)品生產(chǎn)的免疫細胞。3.4生物安全biosafety細胞的采集和制備處于沒有危險和不受生物因子及相關因素威脅的狀態(tài).2T/CI390—20244儀器設備條件和細胞培養(yǎng)器材4.1儀器設備條件4.1.1場地條件：（1）GMP千級凈化室（百級超凈工作單元）100-300M2，（2）普通實驗室（質量檢測）50-100M2，（3）洗涮、準備間200-500M24.1.2大型設備：（1）血細胞分離機（單采機）（2）流式細胞儀（3）酶標分析儀（4）內(nèi)毒素檢測儀（5）常速，超速離心機（6）常溫，低溫冰箱（柜）（7）圖像儀器，倒置顯微鏡4.2細胞培養(yǎng)器材4.2.1清洗與消毒玻璃器皿的清洗清水浸泡——洗衣粉刷洗——自來水沖洗——晾干，浸酸過夜——自來水沖洗10次以上——蒸餾水洗2-3次——烘干，包裝——滅菌，貯存?zhèn)溆?。培養(yǎng)板和培養(yǎng)瓶用符合國家標準規(guī)定的商售一次性使用培養(yǎng)瓶，袋物品。載玻片用一次性使用的物品。膠塞的清洗。自來水浸泡——2%NAOH煮沸10~20分鐘——自來水沖洗——1%稀HCL浸泡30分鐘——自來水沖洗——蒸餾水沖洗2~3次——晾干，備用。4.3滅菌4.3.1使用前，先檢查高壓滅菌器主體內(nèi)水位是否超過電熱管。4.3.2在加熱開始時，放氣閥垂直，使空氣隨加熱由桶內(nèi)逸出。待有較急的蒸汽噴出時，即將放氣閥撥回水平位置。4.3.3瓶皿121-126℃15MIN;器械121-126℃10MIN;橡膠121℃15MIN;溶液121-126℃20-40MIN4.3.4當壓力到達所需的范圍時，開始計算時間。124-126℃滅菌時，安全閥能使之維持恒壓；低于124℃時，則應在蒸汽壓力到達所需范圍時，適當調節(jié)開關使之維持恒壓。3T/CI390—20244.3.5滅菌完，要迅速使之干燥者，將滅菌器內(nèi)的蒸汽通過放氣閥迅速排出。等壓力為0時，再稍等1-2分鐘，然后將蓋打開，繼續(xù)加熱10-15分鐘，使物品上殘留的水蒸汽得到蒸發(fā)，隨后關掉；滅菌液體時，應將液體灌裝在玻璃瓶中，以不超過3/4體積為好，瓶口用棉花紗布塞好，并用繩子扎在瓶頸上，使瓶內(nèi)的空氣能自然泄出，而又不致使瓶塞落入瓶內(nèi)。滅菌完，先關電源，等壓力為0時，再稍等幾分鐘，打開放氣閥，排出余氣后，才能將蓋開啟。5細胞培養(yǎng)操作技術5.1洗液的配制重鉻酸鉀先溶于水中，然后，將濃硫酸緩慢加入。[強液]重鉻酸鉀63G，濃硫酸1000ML，蒸餾水200ML「常用」重鉻酸鉀63G溶于800ML蒸餾水,再緩慢加入濃硫酸1000ML.「本室」重鉻酸鉀120G：濃硫酸200ML：蒸餾水1000ML5.2細胞培養(yǎng)液5.2.1商售一次性應用的完全培養(yǎng)液：1640完全培養(yǎng)液。5.2.2配置：1640干粉（1）把干粉加入15-30℃（室溫）三蒸水中，緩慢攪拌令之溶解，并將袋中微量粉末沖下。（2）加NAHCO32.0G/L1640培養(yǎng)液或3.7G/LDMEM培養(yǎng)液。稀釋至1L。（3）用1NHCL或1NNAOH將PH調低于正常PH*7.2—7.3。（在正常情況下，培養(yǎng)液PH介于7.2-7.4間，呈桃紅色。（4）立即除菌過濾，用0.22UM除菌濾膜的濾器負壓抽濾（5）分裝，放置4℃條件下保存，備用5.3消化液的配制（0.25%胰蛋白酶）（1）將PH7.2的PBS液高壓消毒滅菌。（2）稱取胰蛋白酶粉末0.25G，先用少許消毒的鹽溶液調成糊狀，然后再補足鹽溶液，攪拌混勻，置室溫4小時或冰箱內(nèi)過夜，并不時攪拌振蕩。(3).除菌過濾，分裝入瓶，-20℃冰箱保存。5.4BSS的配制(PBS克/升）（1）準確稱量試劑。(含有水份的水化物，與不含水份者的稱量不同，應加以換算)。KCL0.2，KH2PO40.2，NACL8.0，NA2HPO4·7H2O.56。（2）依次溶解在750ML水中，待前一種試劑完全溶解后，再溶解下一種成分。（3）補足水分至1000ML。除菌過濾或高壓滅菌10MIN，分裝瓶中，4℃保存。5.5細胞培養(yǎng)操作程序5.5.1細胞計數(shù)法（1）懸液制備：取待測細胞，向培養(yǎng)瓶內(nèi)加1ML0.25%胰蛋白酶液，37℃溫箱中消化，至細胞接近脫離瓶壁前吸出消化液，加新的培養(yǎng)液5.0ML，輕輕吹打制備成細胞懸液。4T/CI390—2024（2）染色：取吸管1支，伸入培養(yǎng)瓶中，輕輕反復吹打細胞懸液使細胞重懸均勻后，立即吸細胞懸液少許，向離心管中滴入9滴，再滴入0.4%的臺盤藍染料1滴，混勻，置2-3MIN。（3）鏡檢：把計數(shù)板平放在顯微鏡臺上，從邊緣滴1-2滴已染色的細胞懸液。鏡下觀察可見細胞分散各處，健康細胞胞體完整，透明不著色，凡著色細胞均為不健康者。（4）細胞活度：每100個細胞減去著色細胞數(shù)，如有5個著色細胞，活度為95%。（5）細胞計數(shù)：細胞數(shù)/懸液=（4大格細胞總數(shù)/4）*104*毫升數(shù).（6）接種：一般接種量在105-106細胞/ML范圍.5.5.2細胞傳代（1）將瓶中的培養(yǎng)液倒出，鏡檢，離心重懸細胞，用吸管將瓶壁上的細胞吹打均勻。（2）培養(yǎng)中的細胞分瓶，并加入培養(yǎng)液8-10ML，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（3）懸浮細胞傳代時，只需吸出少量細胞轉入新瓶，并補足營養(yǎng)液即可。6CIK細胞制備規(guī)程6.1制備程序6.1.1包被培養(yǎng)瓶（1）取50ML離心管，分別移入10MLD-PBS。（2）每管加入專用試劑若干，CD3AB50ΜL，混勻后移入75CM2培養(yǎng)瓶，標記。（3）將培養(yǎng)瓶平放在4℃冰箱內(nèi)，避光過夜。6.1.2分離培養(yǎng)PBMC(1)單采機采取分離出相應數(shù)量單個核細胞。(2)取上述單核細胞液50ML，平均移入兩個50ML離心管中，加入全血體積20%（每管5ML的羥乙基淀粉，垂直靜置30-60分鐘。（一般降到1/2體積）(3)將兩管中的上層（血漿+淋巴細胞）移入新的離心管，350G/10MIN離心,(4)取上清（血漿）移入新的離心管，56℃水浴/30MIN滅活。(5)水浴滅活后的血漿，室溫800G/20MIN離心，取上清（即自體血漿）留用。(6)取10MLFICOLL移入新的50ML離心管(7)細胞沉淀用20MLD-PBS重懸，細胞懸液緩慢加入FICOLL層，室溫380G/20MIN離心,(8)吸取PBMC層，加D-PBS至40ML洗滌，室溫350G/8MIN離心(8)棄上清，細胞沉淀加培養(yǎng)基至40ML洗滌，取樣計數(shù)，室溫，300G/8MIN離心(9)計數(shù)細胞，測定細胞活度,>95%(10)取包被的培養(yǎng)瓶，棄包被液，用D-PBS和培養(yǎng)基分別洗一次(11)調制細胞懸液，分別加入培養(yǎng)瓶。接種細胞數(shù)3×107(106/ML)/30ML/瓶,(12)每瓶加入IL-230ΜL（1000U/ΜL），IFN-Γ15ΜL(1000U/ML)，自體血漿1.5ML(即血漿濃度為5%)。顯微觀察，置于5%CO2，37℃培養(yǎng),(13)顯微觀察細胞狀態(tài)，理論上，若第2天細胞狀態(tài)好，可不加血漿，并且轉袋前盡量減少移動細胞，使細胞與包被液試劑充分接觸。6.1.3細胞轉移至培養(yǎng)袋5T/CI390—2024（1）在接種的4天，用巴氏吸管吹打貼附在培養(yǎng)瓶上的細胞，細胞懸液轉移至50ML離心管中，取樣計數(shù)。（2）吹打后，顯微鏡下觀察貼壁細胞情況，如仍較多，每培養(yǎng)瓶加入5—10ML培養(yǎng)液繼續(xù)吹打。（此時細胞一般不用酶來消化，以免損傷細胞）。（3）計數(shù)細胞，檢測細胞活度，殺傷活性，流式細胞儀測定等。（4）分離細胞通過注射器套筒轉移至培養(yǎng)袋，培養(yǎng)液調至200ML（1×105/ML添加IL-2100ΜL，自體血漿6MLIL-2為500U/ML，補救措施為將血漿含量提高到3%，細胞濃度一般不可低于0.4×105/ML）。（5）每天顯微觀察細胞狀態(tài)。（6）隔天等量添加培養(yǎng)液并取樣計數(shù)細胞等。同時添加IL-2,500U/ML，自體血漿1%及8萬U/2ML慶大霉素一支所加培養(yǎng)液已加入白蛋白，含量為0.3%，即1000ML培養(yǎng)液加入20%白蛋白15ML）。6.2回收細胞（1）在培養(yǎng)袋三次加液后（分離接種細胞的第12天），袋中培養(yǎng)液體積為1200-1800ML(初轉袋時150或200ML),收集細胞，（2）用50ML離心管分離細胞，D-PBS洗滌2次，取樣進行質量檢測。7質量檢測和標準7.1顯微觀察細胞狀態(tài)，取樣計數(shù)（1）肉眼觀察，培養(yǎng)袋或培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液清澈，無混濁。（2）顯微觀察細胞狀態(tài)良好，大小基本均勻，反光度好，如有集落形成，證明生長良好。取樣計數(shù)備用。7.2細胞活度：“臺盼蘭拒染細胞活度鑒定法”，細胞活度達90%以上為合格。7.3殺傷活性：效應細胞為CIK細胞，靶細胞為K562細胞。效：靶=20:1,殺傷活性達80%以上為合格。7.4流式細胞儀檢測CIK細胞表型：CD3CD56雙陽性細胞達20%或以上為合格。CD3CD4/CD8雙陽性細胞在50%以上。具體方法見：流式細胞儀檢測CIK細胞表型具體方法介紹。7.5安全檢測：熱源，病毒,支原體，細菌（霉菌）檢測合格。7.5.1熱源檢測-定性檢測法：取CIK細胞培養(yǎng)上清液用鱟試劑凝膠法檢測：結果陰性（-）為合格。注：原理:熱源又叫內(nèi)毒素，是革蘭氏陰性細菌的細胞壁組成部分。醫(yī)學工業(yè)普遍接受的觀點---控制內(nèi)毒素污染，就等于控制了熱源（細菌）污染。鱟試劑內(nèi)含有被微量內(nèi)毒素激活的凝固酶可和鱟試劑產(chǎn)生凝集反應形成凝膠。據(jù)此可判斷熱源（細菌）污染與否。7.5.2熱源檢測-定量檢測法：檢測流程儀器及軟件準備：試驗前開啟動態(tài)試管檢測儀，溫度在37OC.(1)樣品陽性對照液制備，每個樣品取已制備的樣品溶液0.4ML加入到細菌內(nèi)毒素工作標準品中，放置漩渦混合器上混合1MIN,得到樣品陽性對照液。(2)樣品溶液制備：用配套的采樣瓶采集樣品，每種樣品分別取0.1ML加入到0.9ML樣品稀釋瓶里，混勻，即得樣品溶液。,6T/CI390—2024(3).鱟試劑復溶:開啟鱟試劑和試劑復溶液，取0.25ML試劑復溶液加入鱟試劑瓶中，搖勻，放置1MIN,得鱟試劑溶液，取若干反應試管，每管加0.05ML鱟試劑。(4)加樣及反應：陰性對照項：取0.1ML樣品稀釋瓶中的溶液加入到0.05ML鱟試劑溶液的反應試管，平行兩管，輕輕混勻立即插入動態(tài)試管儀中反應。(5)陽性對照項：取0.1ML陽性對照液加入到0.05ML鱟試劑溶液的反應試管，平行兩管，輕輕混勻立即插入動態(tài)試管儀中反應。(6)樣品檢測項及樣品陽性對照項：每個樣品取0.1ML樣品溶液及樣品陽性對照溶液加入到0.05ML鱟試劑溶液的反應試管，各平行兩管，輕輕混勻后立即插入動態(tài)試管儀中反應。結果分析：(1)試驗有效性條件：陰性對照項檢測值應小于標準曲線最低點的檢測值。(2)試驗準確性判斷：陽性對照項回收率應在50－200%之間。(3)樣品無干擾的判斷：樣品陽性對照項的回收率應在50－200%之間。(4)檢測結果判斷標準：細胞培養(yǎng)液等，細菌內(nèi)毒素不大于0.5EU/ML，執(zhí)行標準《中國藥典》;(5)病毒檢測：HIV、HBV、HCV、TP檢測全部合格---全部陰性：方法按檢測試劑盒說明書進行。8檢驗與放行細胞制品達到：（1）無微生物，無內(nèi)毒素；（2）細胞活性>90%；（3）細胞表型達到本標準的要求；有專職的質量控制員和技術長聯(lián)合簽名發(fā)放。9標注，運輸與追蹤9.1發(fā)放的細胞產(chǎn)品留樣（5ML）深低溫活細胞保存3年，必備用復查。9.2外發(fā)的細胞制品：（1）有細胞名稱，數(shù)量，外觀項目，發(fā)放人簽名標注。（2）按規(guī)定進行一次性密封，密封口有簽名的一次性密封條加封。（3）放置帶有溫度記錄的血液保存-輸送箱中，外加封條。（4）24小時內(nèi)簽收。9.3追蹤制備方必須向應用方進行常規(guī)進行細胞治療追蹤和記錄。10CIK細胞臨床治療方案和療效評價10.1臨床治療方案10.1.1病例選擇病例入選標準：①經(jīng)病理證實、診斷明確的各種惡性腫瘤。②患者年齡、性別不限。③手術、放療和化療后病情穩(wěn)定或有復發(fā)轉移的患者。7T/CI390—2024.病例排除標準1）有嚴重過敏體質的病人。（2）嚴重心，肝，腎功能衰竭的病人。（3）臨床醫(yī)生認為不適應的病人。10.1.2治療方案參照2021年2月國家藥品監(jiān)督管理局藥品評審中心公布的《細胞治療產(chǎn)品臨床試驗技術指導原則（試行）》中的“劑量探索和劑量遞增”原則，每例患者至少二個療程；每療程輸注6次，CIK細胞總數(shù)為150-300X108個。采用輸血器靜脈輸注細胞，可考慮采用藥物，如地塞米松5MG，于CIK輸注前靜推，預防不良反應，常規(guī)情況下可不用，有過敏史者，應提前預防。靜脈輸注：每次30-50×108細胞懸于150-200ML生理鹽水中，每分鐘60滴左右滴注。每天或隔天一次。6次一療程：第一年以2-3個療程，第二年半年重復一療程，以后每年做一療程，五年后視情況再定。肝動脈灌注：每周一次，每次10-20×108細胞懸于50-60ML生理鹽水中，3次一療程。不良反應及其處理本研究采用的健康人CIK細胞是異體免疫細胞，因專利技術處理，治療相當安全。有部分病人（3-5%）在細胞回輸后2-10小時內(nèi)出現(xiàn)體溫升高。中度發(fā)熱（38.50C以下）一般2-6小時內(nèi)可自行緩解。超過390C者可用藥物或物理療法對癥處理。10.2臨床療效評價10.2.1一般臨床癥狀治療前后變化：包括：精神狀況、睡眠情況、體重、食欲、痛疼等（詳見觀察表格）10.2.2實驗室檢查指標：癌標記物原發(fā)性肝癌治療前后查AFP，CA19-9等非小細胞肺癌治療前后查CEA和CA125等結直腸癌治療前后查CEACA724等具體各種癌癥病人治療前后均查AFP、CEA、CA125、CEA。收集資料可綜合分析不同癌標記物在不同腫瘤中的臨床意義。.患者自身外周血淋巴細胞亞群測定治療前、后分別采取病人靜脈全血1ML通過流式細胞儀（FCM）測定其細胞亞群、T,B淋巴細胞、NK細胞的絕對數(shù)量變化。（見附表）患者自身免疫能力（NK活性）測定治療前、后分別采取病人外靜脈血10ML，檢測患者自身外周血免疫細胞對K562細胞的殺傷活性，即NK活性。臨床影像學指標療效評價標準參照1979年WHO確定的實體瘤療效評價標準擬訂：完全緩解(COMPLETEREMISSION,CR)：所有病灶完全消失，至少維持4周；部分緩解(PARTIALREMISSON,PR)：雙徑可測病灶，各病灶最大徑乘積之和縮小50％以上，至少維持4周；單徑可測病灶，各病灶最大徑之和減少50%,8T/CI390—2024至少維持4周。穩(wěn)定(STABLEDISEASE,SD)：雙徑可測病灶，各病灶最大徑乘積之和縮小不足50％,或增大不超過25％,至少維持4周。進展(PROGRESSIVEDISEASE,PD):一個或多個病灶增大超過包括：CT、B超、PET等，同時參照【實體腫瘤應答評估方案】。完全緩解（CR）所有病變完全消失并維持4周以上部分緩解（PR）腫瘤最大橫徑與最大垂直徑的乘積減少50%以上，并維持4周以上好轉（MP）腫瘤病灶二徑乘積縮小25%以上，不足50%，無新病灶出現(xiàn)維持4周以上。穩(wěn)定（SD）腫瘤病灶二徑乘積縮小或增大均<25%，4周無新病灶出現(xiàn)。進展（PD）腫瘤病灶乘積增大25%以上，并有新病灶出現(xiàn)。有效率（%）=（CR+PR）例數(shù)/治療總例數(shù)×100%存活時間病人的帶瘤生存和無瘤生存時間應是療效評估的重要指標。本研究擬采用1、2、3、5年生存時間作為CIK療效評價標準。時間：從病人確診之日計起，至去世之日止。治療組：用CIK生物治療5個療程以上的病例。對照組：和臨床應用單位同時期內(nèi)，只用三大常規(guī)療法，不用CIK生物治療的同種病例相比較。9T/CI390—2024一CIK（NK）活性檢測表1.制備效靶細胞時分抽靜脈血ML，時分得PBMC取PBMCML（/ML）加稀釋液ML，調濃度為/ML，共ML取K562ML（/ML）加稀釋液ML，調濃