腫瘤細(xì)胞與分化、凋亡-三課件

細(xì)胞凋亡的生物學(xué)意義

胚胎發(fā)育和形態(tài)發(fā)生細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和免疫機(jī)制衰老腫瘤發(fā)生及化學(xué)治療

腫瘤細(xì)胞與分化、凋亡-三細(xì)胞凋亡和惡性腫瘤1Bcl－2和惡性腫瘤2P53和惡性腫瘤3Bcr-abl和惡性腫瘤4PML-RARα蛋白和惡性腫瘤腫瘤細(xì)胞與分化、凋亡-三細(xì)胞凋亡干預(yù)和腫瘤治療1野生型P53基因介導(dǎo)的腫瘤治療2Bcl－2基因介導(dǎo)的腫瘤治療3泛素－蛋白酶體降解途徑介導(dǎo)的腫瘤治療4三氧化二砷介導(dǎo)的血液系統(tǒng)惡性腫瘤治療5DADS誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡腫瘤細(xì)胞與分化、凋亡-三細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法1臺(tái)肦藍(lán)（trypanblue)染色法原理：trypanblue是一種細(xì)胞膜非通透性染料。壞死細(xì)胞因細(xì)胞膜受損而被臺(tái)肦藍(lán)著色染色。因此，該法能區(qū)分細(xì)胞的生存狀態(tài)，簡(jiǎn)單、便捷、常規(guī)用于細(xì)胞死亡的初步評(píng)價(jià)和細(xì)胞存活率評(píng)價(jià)。注意事項(xiàng)：該法不能區(qū)別繼發(fā)性壞死和真正意義上的壞死細(xì)胞；也容易低估細(xì)胞死亡程度。（因?yàn)樵缙诘蛲黾?xì)胞具有完整的細(xì)胞膜而被誤當(dāng)作活細(xì)胞）腫瘤細(xì)胞與分化、凋亡-三2.丫啶橙染色（acridineorange,

AO)和溴化乙啶(ethidiumbromide,

EB)雙染法

原理：AO和EB都是結(jié)合DNA的熒光染料，分別產(chǎn)生藍(lán)色和橙色熒光。其中，AO能透過完整的細(xì)胞膜，而EB則只能染色胞膜受損的細(xì)胞。因此，AO/EB雙染法能借助熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀區(qū)分活細(xì)胞或早期凋亡細(xì)胞和壞死或繼發(fā)性壞死細(xì)胞。

注意事項(xiàng)：應(yīng)用單一形態(tài)學(xué)計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)（凋亡指數(shù)，apoptosisindex)常受到主觀因素的干擾，其個(gè)體間甚至同一主體的重復(fù)性較差。

腫瘤細(xì)胞與分化、凋亡-三熒光顯微鏡觀察

圖9A未處理的HL-60細(xì)胞圖9BDADS處理的HL-60細(xì)胞吖啶橙×40吖啶橙×40腫瘤細(xì)胞與分化、凋亡-三3電子顯微鏡觀察法

電鏡下超微結(jié)構(gòu)觀察雖可顯示凋亡細(xì)胞的許多特點(diǎn)，如膜發(fā)泡和某些結(jié)構(gòu)如微纖毛的丟失、染色質(zhì)固縮和線粒體超濃縮等，但由于樣本制備復(fù)雜、耗時(shí)，該項(xiàng)技術(shù)主要用于獲取細(xì)胞凋亡的定性檢測(cè)。腫瘤細(xì)胞與分化、凋亡-三腫瘤細(xì)胞與分化、凋亡-三3透射電鏡觀察

圖8A未處理的HL-60細(xì)胞圖8BDADS處理的HL-60細(xì)胞透射電鏡×6000透射電鏡×6000腫瘤細(xì)胞與分化、凋亡-三4DNA斷片法或稱瓊脂糖凝膠電泳“梯形條帶”圖譜法

原理：凋亡細(xì)胞的基因組DNA常首先被剪切為200-300kb和30-50kb的片斷（“結(jié)構(gòu)域式”剪切），再進(jìn)一步降解產(chǎn)生大小相當(dāng)于核小體(160-200bp)的倍數(shù)的寡核小體片斷（“裂解”/“梯子式”剪切）。因此，在瓊脂糖凝膠電泳圖譜上凋亡細(xì)胞表現(xiàn)為特征性“梯子”樣外觀。注意事項(xiàng)：梯狀DNA(DNAladder)現(xiàn)象常被看作是細(xì)胞凋亡的重要生物化學(xué)標(biāo)志。但是，日益增多的資料顯示并不是所有表現(xiàn)凋亡形態(tài)學(xué)特征的細(xì)胞都是呈現(xiàn)這種梯子樣外觀。因此，缺乏梯狀DNA并不能排除細(xì)胞凋亡的存在。據(jù)報(bào)道，某些細(xì)胞系如K562細(xì)胞凋亡常發(fā)生單鏈而不是雙鏈DNA降解，故不能形成“DNAladder”。另外，一般凋亡率要在15%以上才能呈現(xiàn)典型“DNAladder”。故有DNAladder可以肯定凋亡存在，沒有DNA

ladder不能排除凋亡的存在。腫瘤細(xì)胞與分化、凋亡-三圖5不同濃度DADS作用HL-60細(xì)胞24h后DNA梯狀條帶的形成圖660μmol·L-1

DADS作用HL-60細(xì)胞不同時(shí)間后DNA梯狀條帶的形成腫瘤細(xì)胞與分化、凋亡-三５.TUNEL法（末端DNA轉(zhuǎn)移酶dUTP缺口末端標(biāo)記法）

原理：DNA聚合酶能夠填補(bǔ)雙鏈DNA中的單鏈缺失部分，應(yīng)用放射性同位素、生物素和熒光素等標(biāo)記的三磷酸核苷酸形成新的DNA。TUNEL法是在含標(biāo)記dUTP的反應(yīng)體系中，加以末端DNA轉(zhuǎn)移酶。故又稱為TdT(terminaldeoxy-transferase)法。該法是應(yīng)用無需模板的DNA聚合酶，延伸核苷酸的堿基序列與DNA底物無關(guān)。注意事項(xiàng)：該法只能了解DNA是否斷裂和發(fā)生DNA斷裂的細(xì)胞數(shù)量，雖然在理論上對(duì)這種方法的特異性尚有爭(zhēng)議，但操作簡(jiǎn)便，并且可大量應(yīng)用于回顧性研究，從而成為目前較為流行的細(xì)胞凋亡評(píng)價(jià)方法。腫瘤細(xì)胞與分化、凋亡-三TUNEL檢測(cè)結(jié)果

圖10A未處理的HL-60細(xì)胞圖10BDADS處理的HL-60細(xì)胞

TUNEL×20TUNEL×20腫瘤細(xì)胞與分化、凋亡-三6PI染色流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定凋亡率

原理：實(shí)驗(yàn)證明凋亡細(xì)胞在固定和清洗過程中降解的小分子量DNA外漏，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)DNA含量減少。因此，應(yīng)用DNA特異熒光染料（如碘化丙啶，propidiumiodide,PI）染色后，在FCM進(jìn)行的細(xì)胞周期分析中，凋亡細(xì)胞常以亞二聚體形式出現(xiàn)。亞二倍體細(xì)胞群被稱為亞G1期（sub-G1)細(xì)胞。它的出現(xiàn)被認(rèn)為是凋亡細(xì)胞的重要標(biāo)志。注意事項(xiàng)：識(shí)別亞G1期細(xì)胞的同時(shí)，必須將它和細(xì)胞碎片區(qū)分開來，因?yàn)榧?xì)胞碎片的DNA含量也明顯低于G1期細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞與分化、凋亡-三2.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率

control5mg·L-1DADS7.5mg·L-1DADS10mg·L-1DADS15mg·L-1DADS20mg·L-1DADS10mg·L-1DADS+PD10mg·L-1DADS+SB腫瘤細(xì)胞與分化、凋亡-三圖7PI/AnnexinV雙染色檢測(cè)DADS作用HL-60細(xì)胞12h后凋亡率的變化腫瘤細(xì)胞與分化、凋亡-三3.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率

腫瘤細(xì)胞與分化、凋亡-三圖12PI/Anexin-V雙染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)DADS作用K562細(xì)胞12h后凋亡率的改變腫瘤細(xì)胞與分化、凋亡-三EFGH圖13流式細(xì)胞儀檢測(cè)DADS作用K562細(xì)胞24h、48h后的凋亡率改變腫瘤細(xì)胞與分化、凋亡-三細(xì)胞凋亡死亡受體相關(guān)信號(hào)途徑

腫瘤細(xì)胞與分化、凋亡-三細(xì)胞凋亡死亡受體相關(guān)信號(hào)途徑

表3caspase家族主要成員序號(hào)原名功能底物特異性Caspase-1ICE輔助炎癥WEHDCaspase-2ICH-1凋亡反應(yīng)DEXDCaspase-3CPP32,Yama,apopain凋亡反應(yīng)DEXDCaspase-4ICErel-Ⅱ,TX,ICH-2輔助促炎癥WEHDCaspase-5ICErel-Ⅲ,TY輔助促炎癥WEHDCaspase-6Mch-3凋亡反應(yīng)(I/L/V)EXDCaspase-7Mch-3,ICE-LAP3,CMH-1凋亡反應(yīng)DEXDCaspase-8FLICE,MACH,Mch-5凋亡反應(yīng)(I/L/V)EXDCaspase-9ICE-LAP6.Mch6凋亡反應(yīng)(I/L/V)EXDCaspase-10Mch4凋亡反應(yīng)Caspase-11ICH-3Caspase-12Caspase-13ERICHCaspase-14MICE(Mini-ICE)腫瘤細(xì)胞與分化、凋亡-三Pro-caspase3Pro-caspase9Cyt-cGAPDHHL-60

Time(h)01

24824圖30DADS作用HL-60細(xì)胞后caspase3的表達(dá)變化腫瘤細(xì)胞與分化、凋亡-三Pro-caspase3Pro-caspase9Cyt-cGAPDHK562

Time(h)0

1

24

8

24圖31DADS作用K562細(xì)胞后caspase3的表達(dá)變化腫瘤細(xì)胞與分化、凋亡-三Pro-caspase3Pro-caspase9Cyt-cGAPDHRaji

Time(h)01

2

48

24圖32DADS作用Raji細(xì)胞后caspase3的表達(dá)變化腫瘤細(xì)胞與分化、凋亡-三細(xì)胞凋亡線粒體相關(guān)信號(hào)途徑MMP開放線粒體外膜PBRCyclophilinDANTPorin△φm

下降A(chǔ)IFCytoC/Apaf-1/procaspase-9caspase-9-caspase-8caspase-3apoptosis腫瘤細(xì)胞與分化、凋亡-三BaxMitoTrackeroverlay

圖34

激光共聚焦檢測(cè)HL-60細(xì)胞中Bax的線粒體轉(zhuǎn)位腫瘤細(xì)胞與分化、凋亡-三overlayMitoTrackerBax

圖35激光共聚焦檢測(cè)K562細(xì)胞中Bax的線粒體轉(zhuǎn)位腫瘤細(xì)胞與分化、凋亡-三DADS通過啟動(dòng)Mcl-1/Bid/Bax/Caspase-9/Caspase-3線粒體凋亡通路誘導(dǎo)HL-60和K562細(xì)胞凋亡。腫瘤細(xì)胞與分化、凋亡-三MMP開放和caspase活化的“正反饋”環(huán)MMP開放Caspase-3活化線粒體膜屏障功能破壞線粒體腫脹CyotoC釋放Apoptosome（procaspase-9/Apaf-1/CytoC）Caspase-9活化膜間蛋白（如AIF）釋放刺激ceremide酶活化剪切MMP復(fù)合物凋亡誘導(dǎo)劑結(jié)合Apaf-1和procaspase-9腫瘤細(xì)胞與分化、凋亡-三內(nèi)源性細(xì)胞凋亡抑制物1Caspase－8（FLICE)抑制蛋白（FLIP)2SODD(silencerofdeathdomain)3IAP（inhibitorofapoptosisprotein)4Survivin5Bcl-2家族蛋白腫瘤細(xì)胞與分化、凋亡-三Bcl－2家族蛋白的結(jié)構(gòu)和功能Bcl－2的兩大結(jié)構(gòu)域：

TMBHBcl－2家族蛋白活性調(diào)節(jié)

Bcl－2家族蛋白的效應(yīng)機(jī)制腫瘤細(xì)胞與分化、凋亡-三MCL1Bcl-2BidBaxBakGAPDHHL-60Time(h)0124824圖24DADS處理HL-60細(xì)胞后Bcl-2家族成員的表達(dá)變化腫瘤細(xì)胞與分化、凋亡-三GAPDHBakBaxBcl-2K562BidTime(h)0124824圖25DADS作用K562細(xì)胞后Bcl-2家族成員的表達(dá)變化MCL1腫瘤細(xì)胞與分化、凋亡-三Time(h)0124824MCL1Bcl-2BidBax