DB45T 2581-2022 番茄黃化曲葉病毒RT-PCR檢測方法

ICS65.020.01452022-08-25發(fā)布IDB45/T2581—2022本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結(jié)構和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。本文件由廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并宣貫。本文件由廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳歸口。本文件起草單位：廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所。本文件主要起草人：甘桂云、蔣雅琴、李韋柳、康德賢、王益奎、李文嘉、蔡健和、韋福征、黎炎、吳永官。1DB45/T2581—2022番茄黃化曲葉病毒RT-PCR檢測方法本文件界定了番茄黃化曲葉病毒RT-PRC檢測方法所涉及的術語和定義，規(guī)定了番茄黃化曲葉病雙生病毒RT-PCR檢測方法的儀器與試劑、采樣與樣品處理、病毒DNA提取與檢測、PCR擴增檢測、結(jié)果描述及判定的要求。本文件適用于廣西壯族自治區(qū)行政區(qū)域內(nèi)番茄及其近緣屬種植株番茄黃化曲葉病毒的檢測。2規(guī)范性引用文件本文件沒有規(guī)范性引用文件。3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1番茄黃化曲葉病TomatoYellowLeafCurl番茄黃化曲葉病由番茄黃化曲葉病毒（TomatoYellowLeafCurlVirus）引起，主要癥狀是植株生長緩慢，節(jié)間縮短，植株明顯矮化，葉片變小，頂端葉片發(fā)黃并且上卷，整片葉萎縮、褶皺，坐果量減少，果實變小產(chǎn)生畸形，不能正常轉(zhuǎn)色，果實產(chǎn)量和商品性大幅度降低。4儀器與試劑4.1檢測儀器包括但不限于以下內(nèi)容：——PCR儀；——電泳儀；——凝膠成像系統(tǒng)；——高速臺式冷凍離心機(最高轉(zhuǎn)速15000r/min以上)；——紫外分光光度計；——超凈工作臺；——冰箱(4℃和-80℃兩種)；——通風櫥；——配套移液器吸頭，Eppendorf離心管(1.5mL)；——研缽。2DB45/T2581—20224.2檢測試劑除特別說明外，下列試劑均為分析純。如下：a)DNA提取液：100mmol/LTris-HCl(pH8.0)，20mmol/LEDTA，1.4mol/LNaCl,2％(w/v)CTAB，4％PVP，40mmol/L巰基乙醇；b)TE緩沖液：含10mmol/LTris-HCl(pH8.0)，1mmol/LEDTA-Na2(pH8.0)；c)50×TAE電泳緩沖液：242gTris，57.1mL冰醋酸，100mL0.5mol/LEDTA(pH8.0)定容至1000mL，使用時配制成1×TAE稀釋緩沖液；d)溴化乙錠(EB，1mg/mL)：戴手套(雙層)謹慎稱取EB20mg于棕色試劑瓶中，加入20mL無菌水，溶解后用黑色袋子包好貯于4℃?zhèn)溆茫?00mL凝膠加50μLEB；e)苯酚：氯仿：異戊醇(25:24:1)；f)氯仿：異戊醇(24:1)；g)異丙醇；h)70％乙醇：用無水乙醇和雙蒸水配制；i)瓊脂糖凝膠。5采樣與樣品處理5.1采樣5.1.1檢測樣品以單個品種為單位，以1000株為單位，每1000株采10個樣，1000株以下10個樣（10株），重點采集有疑似癥狀且無其它病蟲害的葉片。對無癥狀植株采用對角線取樣法，每條對角線等距離取5個樣（5株）。5.1.2陰性對照樣陰性對照取自脫毒試管苗或種植于網(wǎng)室內(nèi)的已檢測無黃化曲葉病的單株番茄。5.1.3陽性對照樣陽性對照選取有矮化、葉片稍褪綠發(fā)黃，變小，葉片邊緣上卷，葉片增厚等癥狀的葉片。5.2標識與保存樣品統(tǒng)一使用封口袋保存，每個單株樣品各置放一個封口袋中，每個品種再統(tǒng)一放在封口袋內(nèi)。寫好標簽，注明采樣時間、地點、品種、采集人。確保樣品干燥，如能24h送至檢測地，則送檢樣品常溫保存，送至檢測地于-80℃保存；超過一個工作日，送檢樣品采后需馬上冷藏，送至檢測地于-80℃以下冰箱保存。應避免反復凍融（凍融不超過3次）。6病毒DNA提取與檢測6.1DNA提取6.1.1取0.2g葉片，放入預冷的研缽，并倒入適量液氮研磨，將研碎的葉片轉(zhuǎn)入2mL編號離心管并加入65℃預熱的提取液1mL，65℃水浴45min后12000r/min離心10min。3DB45/T2581—20226.1.2取上清液于1支干凈的1.5mL離心管中，加入等體積苯酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，搖勻后12000r/min離心10min。6.1.3取上清液于1支干凈的1.5mL離心管中，加入等體積氯仿:異戊醇(24:1)，搖勻后12000r/min離心10min。6.1.4取上清液于1支干凈的1.5mL離心管中，等體積氯仿:異戊醇(24:1)，搖勻后12000r/min離6.1.5取上清液于1支干凈的1.5mL離心管中，加入等體積預冷過的異丙醇，輕柔混勻后于-20℃下靜止1h，最后于4℃下10000r/min離心10min。6.1.6棄上清液，沉淀物用70％乙醇洗滌沉淀2～3次，在超凈臺吹干，用100μLTE溶解沉淀，保存于-20℃冰箱。6.2DNA檢測6.2.1瓊脂糖檢測1％瓊脂糖凝膠電泳(EB30μL，電壓110V)20min～30min后，觀察凝膠成像系統(tǒng)中是否有DNA譜帶。6.2.2分光光度計檢測分光光度計檢測A260/A280的比值（OD260/OD280）值在1.8～2.0時認為得到的DNA純度較高，稀釋DNA濃度至50ng/L。7PCR擴增檢測7.1PCR擴增7.1.1模板以提取的總DNA為模板，擴增反應總體積為20μL，其中包括：DNA模板2μL，10×PCRbuffer2μL，25mmol/L的MgCl22μL，10mmol/L的dNTP2μL，5μmol/L的上下游引物各2μL（TYLCV-F：5’-ACGCATGCCTCTAATCCAGTGTA-3’；TYLCV-R：5’-CCAATAAGGCGAAGCGTGTAGAC-3’），ddH2O補足至20μL。按比例配置好體系后于PCR儀中進行PCR擴增。7.1.2程序擴增程序如下：a)94℃預變性3min；b)94℃變性，30s，56℃復性，30s，72℃延伸，30s，30個循環(huán)；c)最后72℃延伸10min，4℃保存。7.1.3成像PCR產(chǎn)物用含有核酸染料的1.2％瓊脂糖在120V電壓下電泳40min，最終結(jié)果在凝膠成像系統(tǒng)上顯示。7.2PCR檢測每次檢測包含兩個陽性對照、兩個陰性對照、檢測樣品和兩個空白樣品(ddH2O)。于1.8％～2.5％瓊脂糖凝膠電泳(EB30μL，電壓130V)20min～40min，觀察是否有543bp特異目的片段擴增條帶出現(xiàn)，是否與預期的擴增產(chǎn)物片段大小相吻合。4DB45/T2581—20227.3結(jié)果分析條件判定結(jié)果中如果兩個陽性對照有特異目的片段擴增條帶出現(xiàn)，且目的片段大小與預期的擴增產(chǎn)物大小相吻合，為543bp，而兩個陰性對照樣品與兩個空白樣品(ddH2O)都沒有特異目的片段擴增條帶出現(xiàn)時，結(jié)果有效。否則，此次實驗檢測結(jié)果無效。8結(jié)果描述及判定8.1陰性沒有543bp特異目的片段擴增帶出現(xiàn)，表示樣品中無番茄黃化