(新版)新型DNA酶生物傳感技術(shù)在腫瘤液體活檢中的研究進(jìn)展

增加，使其成為人類生命的重大健康挑戰(zhàn)[1]。液體活檢通過(guò)分析體液中的生物標(biāo)志物，如循環(huán)腫瘤DNA(circulatingtumorDNA,ctDNA)、循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulatingtumorcell,CTC)和腫瘤來(lái)源細(xì)胞外囊泡(tumorextracellularvesicle,TEV)等，以跟蹤腫瘤的動(dòng)態(tài)進(jìn)展，實(shí)現(xiàn)無(wú)創(chuàng)、全面的分子分析[2],生物傳感器通過(guò)測(cè)量標(biāo)志DNA酶作為一種新興功能核酸，基于其良好的化學(xué)穩(wěn)定性、可編程性、便于表面固定和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能化等優(yōu)勢(shì)，已廣泛用于各種液體活檢策略，其中最為常見(jiàn)的為G-四鏈體DNA酶和RNA切割活性DNA酶。本綜述將系統(tǒng)總結(jié)基于DNA酶的生物傳感器在腫瘤液體活檢研究中的最新進(jìn)展，三維結(jié)構(gòu)而具備特異結(jié)合和序列識(shí)別等功能[4]。1994年，Gerald的磷酸二酯鍵的轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)?；隗w外選擇-指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化(SELEX)技術(shù)的發(fā)明[6],在過(guò)去三十年里科研人員已經(jīng)鑒定出各種具有催化活性的人工DNA序列，統(tǒng)稱為DNA酶。不同的DNA酶特方式方便地用信號(hào)標(biāo)簽或納米顆粒進(jìn)行標(biāo)記以產(chǎn)生各種類型的讀出信號(hào)，例如用于激活DNA納米機(jī)器的催化劑和用于組裝DNA納米結(jié)構(gòu)的構(gòu)建塊 [7,8]。同時(shí)，與蛋白質(zhì)酶或核酶相比，DNA酶化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，在期和回收利用能力。DNA酶具有高催化效率，速率高達(dá)1010,催化效雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(hybridizationchainreaction,HCR)和催化發(fā)夾組裝底物的催化反應(yīng)。目前在生物傳感中應(yīng)用最廣泛的是8-17DNA酶和2.8-17DNA酶：2017年，Liu等[13]報(bào)道了8-17DNA酶的三維結(jié)構(gòu)。經(jīng)典的8-17DNA酶具有14個(gè)核苷酸的催化核心，其中9個(gè)核苷酸在催化核心結(jié)構(gòu)域，5個(gè)核苷酸在單鏈結(jié)構(gòu)域。 等存在下，進(jìn)而形成2',3'-環(huán)狀磷酸和5'羥基末端的RNA片段。而是2',3'-環(huán)狀磷酸酯的水解[17]。隨后的研究表明，除催化核心以外的其他位置的核苷酸取代、添加和刪除具有良好的耐受性[18]。Mg2+濃度(10mmol/L或以上)下該DNA酶的催化常數(shù)(kcat)仍其催化核心由15個(gè)脫氧核苷酸組成，切割位點(diǎn)位于RNA分子上的2個(gè)生2'(3')-環(huán)磷酸和5'羥基末端的切割產(chǎn)物[20]。每個(gè)二核的DNA鏈通過(guò)分子內(nèi)或分子間霍氏氫鍵形成的核酸三維二級(jí)結(jié)構(gòu)[15]。G-四鏈體可以由1條、2條或4條富含G的DNA鏈組成，K+的存在可以進(jìn)一步穩(wěn)定G-鏈體的結(jié)構(gòu)[22](表1)。20世紀(jì)90年代末報(bào)告了結(jié)合氯化血紅素的G-四鏈體表現(xiàn)出過(guò)氧化物酶的濃度[25]。魯米諾和四甲基聯(lián)苯胺(tetramethylbenzidine,TMB)也通常用作G4/hemin如量子點(diǎn)、銀納米簇、銅納米顆粒、熒光染料等[26]。1.循環(huán)腫瘤核酸檢測(cè)：循環(huán)腫瘤核酸包括ctDNA和循環(huán)腫瘤RNAmRNA)、微小RNA(microRNA,miRNA)和長(zhǎng)非編碼RNA(long進(jìn)展的病理過(guò)程，并提示良性或惡性病變的存在[42]。針對(duì)ctDNAAuNPs-DNA附著提供大的比表面積。該策略檢測(cè)限為3.0×10-16mol/L。Xu等[28]報(bào)道了一種雙莖發(fā)夾探針的比色生物傳感器，放大的表面增強(qiáng)拉曼散射(surface-enhancedramanscattering,SERS)傳感器，用于測(cè)定miRNA-21,該策略在0.5fmol/L至10nmol/L范圍內(nèi)對(duì)miRNA-21的檢測(cè)具有良好的線性，檢測(cè)限為0.5fetoprotein,AFP)、前列腺特異性抗原(proPSA)等。Wei等[31]利用適配體觸發(fā)等溫?cái)U(kuò)增和DNA酶雙重信號(hào)放大構(gòu)建了新型超靈敏熒光適配體傳感器用于檢測(cè)血液中CEA,可達(dá)一種基于三重信號(hào)放大的便攜式比色生物傳感器，該儀器將DNA酶催化和分子信標(biāo)與陽(yáng)離子交換反應(yīng)相結(jié)合，可靈長(zhǎng)因子BB,濃度3.16×10-16~3.16×10-12mol/L,檢測(cè)限為0.11的電化學(xué)傳感器用于檢測(cè)CEA,線性響應(yīng)范圍為10fg/ml至200ng/ml,在檢測(cè)蛋白質(zhì)腫瘤標(biāo)志物策略中，蛋白質(zhì)信號(hào)轉(zhuǎn)3.TEV檢測(cè)：EV是一類具有磷脂雙分子層的納米級(jí)細(xì)胞外囊泡(40~160其中腫瘤來(lái)源細(xì)胞外囊泡在腫瘤免疫抑制、發(fā)揮關(guān)鍵作用[43]。在磷脂雙分子層上高表達(dá)的特異性蛋白(如簇狀膠體果胞抗原-63、表皮生長(zhǎng)因子受體、上皮細(xì)胞黏附分子)常被用作檢測(cè)癌癥相關(guān)TEV的生物標(biāo)記物。最近，人們廣泛關(guān)注并努力開(kāi)發(fā)靈敏而簡(jiǎn)單的TEV檢測(cè)方法，如表面增強(qiáng)拉曼散射、表面等離子體共振、微流控和電化學(xué)等傳感平臺(tái)[44]。DNA酶在生物傳感平臺(tái)中用作生物分子識(shí)別元件增加傳感平臺(tái)的選擇性，源性TEV的精準(zhǔn)檢測(cè)。Gao等[34]開(kāi)發(fā)了在丁醇加速條件下的piRNA-20365,對(duì)MCF-7EV的檢測(cè)限分別為3.98或2.69顆粒/μl。好的定量關(guān)系。Zhang等[35]創(chuàng)建了一種基于DNA酶誘導(dǎo)的DNA的TEV。通過(guò)雙探針識(shí)別，DNA步行器的連續(xù)運(yùn)動(dòng)實(shí)現(xiàn)大量底物鏈的裂解，從而實(shí)現(xiàn)了信號(hào)放大，電流信號(hào)檢測(cè)限可以達(dá)到3.63×104顆粒/ml。存在時(shí)，適配體球形核酸可以通過(guò)TEVs的橋接效應(yīng)附著在微板上，從而觸發(fā)HCR。這個(gè)過(guò)程伴隨著大量的G-四鏈體DNA酶的形成，使TEV能夠進(jìn)行視覺(jué)定量分析，并達(dá)到50顆粒/μl的檢測(cè)限。由于TEV尺寸僅為40~160nm左右，因此原位精確測(cè)定單個(gè)TEV內(nèi)容物是一項(xiàng)重大挑戰(zhàn)，Sun等[45]創(chuàng)新的將微囊泡膜融合技術(shù)與DNA酶技術(shù)相結(jié)合創(chuàng)建真地鑒定TEV內(nèi)容物，對(duì)TEV內(nèi)容物miRNA的檢測(cè)限可低至46.5為102~103顆粒/μl。這些技術(shù)與DNA酶技術(shù)的結(jié)合具有潛在科研前與腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程密切相關(guān)[47]。CTC攜帶了蛋白質(zhì)和核酸等關(guān)鍵 (PdRu/Pt)分層結(jié)構(gòu)，在DNA酶的輔助下檢測(cè)CTCs,該策略檢測(cè)限低至2個(gè)細(xì)胞/ml,檢測(cè)范圍寬至2~106個(gè)細(xì)胞ml。Xiong等[38]限低至1個(gè)細(xì)胞/ml,外周血中MCF-7細(xì)胞的回收率94.0%~104.5%,SERS信號(hào)與MCF-7細(xì)胞濃度之間具有良好的線性關(guān)系。通過(guò)檢測(cè)各種癌癥外周血中的CTC可以獲得大量有關(guān)原發(fā)腫瘤檢測(cè)、疾病進(jìn)展和預(yù)后跟蹤的信息。針對(duì)CTC分離檢測(cè)，目前基于DNA酶的生物傳感具有高特異度、高靈敏度和操作便捷等優(yōu)點(diǎn)，胞污染等不足。其中最具挑戰(zhàn)性的部分是不的CTC性質(zhì)各不相同，這進(jìn)一步增加了分離和鑒定過(guò)程的復(fù)雜性。驟和昂貴儀器，新型DNA酶生物傳感器沒(méi)有放射性危害、耗時(shí)和程序繁研究顯示去甲基酶的失調(diào)與多種疾病密切相關(guān)。細(xì)胞核內(nèi)調(diào)節(jié)m6A水平的脂肪量和肥胖相關(guān)蛋白(fatmassandobesityassociatedprotein,為5.96×10-16mol/L,還能準(zhǔn)確區(qū)分健康人和乳腺癌患者組織中的FTO表達(dá)水平。Yang等[40]提出了一種基于靶標(biāo)調(diào)控的DNA酶裂解的均相電化學(xué)發(fā)光測(cè)定FTO的方法，檢測(cè)限為30fmol/L,電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與FTO濃度的對(duì)數(shù)在0.0001~100nmol/L范圍呈線性相關(guān)。Shi等[41]提出了一種基于三重信號(hào)放大的比色生物傳感器，F(xiàn)TO催化的m6A籠狀DNA酶的去甲基化被設(shè)計(jì)為啟動(dòng)下游反應(yīng)的開(kāi)關(guān)，且DNA酶可以在底物裂解后回收，檢測(cè)限低至69.9fmol/L。近年來(lái)，DNA酶在檢測(cè)病毒和細(xì)菌病原體、癌癥生物標(biāo)志物和調(diào)節(jié)性疾病生物標(biāo)志物方面取得了較大進(jìn)展。未來(lái)隨著技定