DB51T 2478-2018 植物檢疫實驗室常規(guī)檢驗技術(shù) 病毒　

植物檢疫實驗室常規(guī)檢驗技術(shù)病毒2018-04-18發(fā)布2018-05-01實施四川省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I 1 1 14試劑與材料 1 26取樣及送樣 37檢測方法 38結(jié)果判定 39樣品保存 3附錄A(資料性附錄)黃瓜綠斑駁花葉病毒主要癥狀特征 4附錄B(資料性附錄)李屬壞死環(huán)斑病毒主要癥狀特征 5附錄C(資料性附錄)煙草環(huán)斑病毒主要癥狀特征 6附錄D(規(guī)范性附錄)酶聯(lián)免疫吸附測定法檢驗程序 7附錄E(規(guī)范性附錄)RT-PCR檢驗程序 9Ⅱ本標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)GB/T1.1-2009給出的規(guī)定進行編寫。本標(biāo)準(zhǔn)中附錄A、B、C為規(guī)范性附錄，附錄D、E為規(guī)范性附錄，。本標(biāo)準(zhǔn)由四川省農(nóng)業(yè)廳提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)由四川省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局批準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：四川省農(nóng)業(yè)廳植物檢疫站。本標(biāo)準(zhǔn)起草人：萬佳、寧紅、鄧亞岷、李剛、蔣輝、吳志平、郭迪金、李小松。1DB51/T2478—植物檢疫實驗室常規(guī)檢驗技術(shù)病毒本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了植物檢疫實驗室病毒檢驗的原理、試劑與材料、儀器與用具、取樣及送樣、檢測方法、結(jié)果判定和樣品保存。本標(biāo)準(zhǔn)適用于植物檢疫實驗室病毒的檢驗和鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB15569農(nóng)業(yè)植物調(diào)運檢疫規(guī)程病毒病一般根據(jù)病害癥狀很難確定病毒種類，采用免疫學(xué)和分子生物學(xué)方法，可快速根據(jù)有關(guān)判斷標(biāo)準(zhǔn)進行檢驗鑒定。4試劑與材料4.1DAS-ELISA血清學(xué)檢驗試劑除非另有說明，在本標(biāo)準(zhǔn)中僅使用確認(rèn)的分析純試劑和蒸餾水或去離子水或相當(dāng)純度的水。a)包被抗體：病毒抗體稀釋度按市售產(chǎn)品要求進行。貯藏于4℃?zhèn)溆茫籦)酶標(biāo)抗體：用堿性磷酸酶標(biāo)記的病毒免疫球蛋白抗體。按市售產(chǎn)品要求進行稀釋，貯藏于4℃冰箱保存?zhèn)溆茫籧)包被緩沖液：取2.93g碳酸氫鈉(NaHCO3)、1.59g碳酸鈉(Na2C03),用1000ml蒸餾水溶解，pH值為9.6,貯藏于4℃冰箱保存?zhèn)溆?；d)PBST洗滌液：取1.15g無水磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、0.2g氯化鉀(KC1)、0.2g無水磷酸二氫鉀(KH2PO4)、8.0g氯化鈉(NaCl)、0.5ml吐溫-20,用1000ml蒸餾水溶解，pH值為7.2;e)樣品提取緩沖液：取20g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、2.0g蛋清蛋白、1.3g無水亞硫酸鈉(Na2SO3)、0.2g疊氮化鈉(NaN3)、0.5ml吐溫-20、8g氯化鈉、0.2g磷酸二氫鈉、1.15g磷酸氫二鈉、0.2g氯化鉀，用1000ml蒸餾水溶解，貯藏于4℃冰箱保存?zhèn)溆?；。f)共軛物緩沖液：取0.2g牛血清白蛋白，用100mlPBST緩沖液溶解，貯藏于4℃冰箱保存?zhèn)鋑)底物：對硝基苯磷酸二鈉；h)底物緩沖液：取0.1g氯化鎂(MgCl2)、90.39g二己醇胺(CH2CH2OH)、19.82g二己醇胺-HCl(CH2CH2OH-HCl),用1000ml蒸餾水溶解，pH值為9.8,貯藏于4℃冰箱保存?zhèn)溆茫?i)終止液：12g氫氧化鈉(NaOH)溶于100ml蒸餾水。4.2RT-PCR檢驗試劑a)莫洛尼鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶：100U/μl;b)1×TAE緩沖液：40mMTris-HCl,20mMNaAc,2mMEDTA(用冰醋酸調(diào)pH至8.0)。d)10×PCR緩沖液：100mMTris-HCl(pH8.3),500mMKCl;f)RNA酶抑制劑：10U/μl;h)無水乙醇(CH3CH2OH);j)去蛋白液；k)Taq酶2.5U/μl;n)2-巰基乙醇(C2H60S);p)相應(yīng)病毒引物；r)溴酚藍(lán)(C19H1OBr405S);s)瓊脂糖凝膠：稱取1.5g瓊脂糖緩緩倒入250ml三角瓶內(nèi)，加入100ml1×TAE,在微波爐中加熱1min溶解后，再加入5μlGoldview的生物染料，倒入調(diào)平并安放適當(dāng)梳齒的制膠a)聚乙烯微量滴定板根據(jù)樣品數(shù)量選用48孔和96孔兩種規(guī)格。c)電子天平1/100g,1/1000g。d)恒溫培養(yǎng)箱。f)酶聯(lián)免疫檢測儀。i)PCR擴增儀。j)研缽內(nèi)徑60mm~80mm。k)冰箱、超低溫冰箱。3調(diào)運檢疫樣品按照GB15569中附錄D和附錄E相關(guān)規(guī)定進行取樣，產(chǎn)地檢疫樣品按照相應(yīng)的檢疫性有害生物產(chǎn)地檢疫技術(shù)規(guī)程規(guī)定的取樣要求進行取樣，疫情監(jiān)測樣品按照相應(yīng)的檢疫性有害生物監(jiān)測防控技術(shù)取樣要求進行取樣。在調(diào)運檢疫、產(chǎn)地檢疫及疫情監(jiān)測過程中，采集具有可疑癥狀的葉片、枝條、果實、種子等材料，用紙袋包裝，并注明采樣地點、品種、GPS、采樣人、采樣時間等，在保證不腐爛的前提下及時送檢。7.1癥狀觀察觀察樣品有無異樣，初步判斷是否具有病毒的表現(xiàn)特征(見附錄A、B、C)。7.2DAS-ELISA血清學(xué)檢驗檢驗方法見附錄D。如采用認(rèn)可的試劑盒，按說明操作。檢驗方法見附錄E。如采用認(rèn)可的試劑盒，按說明操作。在陰性對照OD值≤0.1,且陽性對照OD值大于陰性對照OD值2倍的前提下，樣品孔OD值大于陰性對照OD值2倍時，判定為陽性反應(yīng)，即樣品帶相應(yīng)的被檢病毒；否則判定為陰性反應(yīng)，即樣品不帶相應(yīng)的被檢病毒。在陰性對照、空白對照無擴增條帶，且陽性對照出現(xiàn)被檢病毒目標(biāo)條帶的前提下，樣品RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果與被檢病毒目標(biāo)條帶長度一致，判定為陽性反應(yīng)，即樣品帶被檢病毒；否則判定為陰性反應(yīng)，即樣品不帶被檢病毒。經(jīng)檢疫鑒定后的樣品，應(yīng)在-80℃~-20℃冰箱保存三個月，以備復(fù)驗、談判和仲裁，保存期滿后，需進行滅活處理。4(資料性附錄)黃瓜綠斑駁花葉病毒主要癥狀特征A.1危害與癥狀該病毒主要危害黃瓜、西瓜、南瓜和甜瓜等葫蘆科作物。一般造成減產(chǎn)20%以上，嚴(yán)重的甚至絕收。在西瓜葉片只產(chǎn)生輕微的斑紋和矮化，但在果實中卻造成嚴(yán)重的變色或使果實內(nèi)部造成腐爛，在黃瓜葉片上出現(xiàn)色斑，水泡及變形，植株矮化，病株開花遲、少花，不結(jié)果或果畸形。A.2傳播途徑該病主要通過種子進行傳播，也可通過土壤、水、介體、農(nóng)事操作和機械接觸傳播。A.3檢疫措施種植經(jīng)檢疫合格的健康種子，嚴(yán)禁發(fā)生區(qū)內(nèi)的種苗外調(diào)；及時挖除發(fā)病植株，就地集中曬干焚燒；播種前用3~10%亞磷酸三鈉浸種10分鐘，發(fā)病田土壤和農(nóng)具用100倍福爾馬林處理后覆膜封閉5-7天；發(fā)病田改種非葫蘆科作物兩年以上。5(資料性附錄)李屬壞死環(huán)斑病毒主要癥狀特征B.1危害及癥狀該病毒幾乎可侵染所有的李屬植物，引起壞死、皺縮、花葉、環(huán)斑、穿孔、枯死等，特別在苗期發(fā)生會造成嚴(yán)重?fù)p失。典型癥狀是新葉上出現(xiàn)壞死環(huán)斑或黃條斑，壞死斑中心脫落，出現(xiàn)孔洞，重者只剩下花葉狀葉架。B.2傳播途徑該病毒主要通過種子和苗木傳播，嫁接及農(nóng)事操作也可傳播。B.3檢疫措施種苗調(diào)運時實施檢疫；建立無毒種苗繁育基地，發(fā)展無疫病優(yōu)質(zhì)果樹生產(chǎn)區(qū)；選擇抗病毒藥劑進行化學(xué)防治，重點進行藥劑灌根和主干環(huán)剝涂藥。6(資料性附錄)煙草環(huán)斑病毒主要癥狀特征C.1危害及癥狀該病毒主要為害煙草、番茄、馬鈴薯、大豆、西瓜、黃瓜等作物，可導(dǎo)致減產(chǎn)和產(chǎn)品質(zhì)量下降。在煙草葉片上產(chǎn)生環(huán)斑，病斑常由斷續(xù)的壞死線局限起來，呈粉白色或棕色單環(huán)或雙環(huán)，直徑約5～8mm,與病斑相鄰組織褪綠，有時形成一個暈圈。為害大豆，引起植株頂芽彎曲變褐枯死，其他側(cè)芽變褐色，莖和復(fù)葉葉柄產(chǎn)生褐色條紋，豆莢發(fā)育不良。C.2傳播途徑該病毒主要通過種子傳播，在田間主要靠汁液摩擦接觸傳播，病毒多通過葉片和根部傷口進入，昆蟲、線蟲可造成植株傷口，并傳播病毒。C.3檢疫措施實施嚴(yán)格的檢疫制度，對寄主繁殖材料實施檢疫；珍貴寄主材料，可進行莖尖脫毒處理；藥劑防治傳毒昆蟲及線蟲，可以減少病毒株間的傳播；與非寄主作物輪作；利用基因調(diào)控在遺傳育種上獲得抗病7(規(guī)范性附錄)酶聯(lián)免疫吸附測定法檢驗程序D.1包被抗體D.1.1包被用包被緩沖液稀釋病毒包被抗體，在所需反應(yīng)孔中加入100μL。將酶聯(lián)反應(yīng)板置于保濕容器中，37向每個反應(yīng)孔中加入200μLPBST洗滌液，迅速倒出，重復(fù)2次。洗板完成后將酶聯(lián)反應(yīng)板在紙巾上D.2.1樣品制備將待測樣品剪碎混勻后取其中1g置于研缽中，加入10ml樣品提取液充分研磨后，以一層薄棉布(或類似細(xì)棉紗)過濾樣品。在樣品制備過程中應(yīng)注意防止樣品的交叉污染。用移液器將制備好的樣品按每孔100μL加入酶聯(lián)反應(yīng)板孔內(nèi)，每個樣品重復(fù)一次，設(shè)置陽性對照、陰性對照和包被緩沖液空白對照。加樣完成后將酶聯(lián)反應(yīng)板置于保濕容器中，4℃冰箱孵育過夜(至少16h)。剩余樣品于-20℃冰箱保存?zhèn)洳椤Ｔ诿總€反應(yīng)孔加滿PBST洗滌液，迅速倒出，重復(fù)2次。洗板完成后將酶聯(lián)反應(yīng)板在紙巾上拍干。D.3結(jié)合酶標(biāo)抗體D.3.1加酶標(biāo)抗體向酶聯(lián)反應(yīng)板每孔加入100μL用共軛物緩沖液按比例稀釋的酶標(biāo)抗體溶液。置于保濕容器中37℃同D.2.3,重復(fù)4次。8每孔加入100μL底物溶液。25℃避光孵育1h,至陽性對照顯色。D.5終止反應(yīng)9DB51/T2478—(規(guī)范性附錄)RT-PCR檢驗程序E.1病毒模板RNA的制備采用TIANGENRNAprepPlantKit試劑盒(給出該試劑盒信息是為了方便標(biāo)準(zhǔn)使用者，如果等效產(chǎn)品具有相同效果，則可使用這些等效產(chǎn)品)提取病毒RNA。稱取50mg~100mg的葉片、莖桿或種子，在液氮中迅速研磨成粉末狀，轉(zhuǎn)移粉末至預(yù)冷的1.5ml的EP管中，加入500μL的RL裂解液(使用前按RL裂解液1ml加入2-巰基乙醇10μL),渦旋劇烈震蕩5min使其混勻。將勻漿液轉(zhuǎn)移至CS過濾柱上，12000rpm離心2min~5min,小心吸取上清液至無RNA酶(RNase-free)的離心管中，吸頭盡量避免接觸收集管中的細(xì)胞碎片沉淀。緩慢加入上清液0.5倍體積無水乙醇，混勻，得到的溶液和沉淀一起轉(zhuǎn)入CR吸附柱中，12000rpm離心1min,棄掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中。向吸附柱CR中加入700μL去蛋白液RW1,12000rpm離心1min,棄廢液，將吸附柱放回收集管中。向吸附柱CR中加入500μL漂洗液RW,12000rpm離心1min,棄廢液，將吸附柱放回收集管中，重復(fù)漂洗一次。漂洗完后，將吸附柱在12000rpm離心2min,,去除殘余液體，并在室溫下放置片刻。將吸附柱放入一個新的RNase-free離心管中，向膜中央加入50μL～100μL無RNA酶的雙蒸水，室溫放置2min,12000rpm離心2min,得到RNAE.2.1反轉(zhuǎn)錄E.2.1.1反應(yīng)體系RT反應(yīng)體系見表E.1。表E.1病毒RT反應(yīng)體系物加入量(μL)41E.2.1.2程序反轉(zhuǎn)錄程序為：42℃,50min;94℃,5min;4℃保存。E.2.2.1反應(yīng)體系E.2.2.2反應(yīng)程序反應(yīng)程序為：94℃3min;94℃30sec,59℃30sec,72℃30