蛋白酶活性測定

1、華南農(nóng)業(yè)大學綜合實驗報告實驗項目名稱：酶活力測定實驗項目性質(zhì)：綜合實驗計 劃 學 時 ：所屬課程名稱：食品與發(fā)酵工業(yè)分析實驗完成時間：2013.05.10糖化酶活力測定（直接滴定法）1、原理采用可溶性淀粉為底物，在一定的pH值與溫度下，使之水解為葡萄糖 (還原糖)，以直接滴定法測定。2、試劑及儀器（1）甲液：稱取15.693g硫酸銅(CuSO1000mL；242乙液：稱取50g亞鐵氰化鉀，用水溶解并稀釋定容至1000mL（2） 0.1%標準葡萄糖溶液：準確稱取1g無水葡萄糖（預先在100-1050C5mL濃鹽酸，用水定容至1000mL。（3） pH4.6乙酸-乙酸鈉緩沖溶液：0.2mol/L乙

2、酸溶液：量取11.8mL冰乙酸，用水稀釋至1000mL；0.2mol/L 乙酸鈉溶液：稱取27.2g乙酸鈉（CHCOONa3H321000mL；pH4.6乙酸-乙酸鈉緩沖液：取0.2mol/L的乙酸溶液和0.2mol/L的乙酸鈉溶液等體積混合。（4）0.1mol/L4g1000mL。（5） 2%可溶性淀粉溶液：準確稱取2g可溶性淀粉（預先于10-105 0C烘 80mL 沸水中，繼續(xù)煮沸至透明，冷卻后用水定容至100mL。（6） 固體曲（7） 滴定管、電子天平、燒杯、恒溫水浴鍋、脫脂棉、容量瓶、移液管、三角瓶3、測定步驟（1）5%固體曲浸出液制備：稱取5.0g250mL燒杯中，加90mL水和1

3、0mL pH4.6乙酸乙酸鈉緩沖溶液，攪勻，于30水浴中保溫浸1小時，每隔15min攪拌一次。用脫脂棉過濾，濾液為5固體曲浸出液。（2）固體曲糖化液的制備：吸取25mL 2可溶性淀粉溶液，置于50mL容量瓶中，于30水浴預熱10min。準確加入5mL5固體曲浸出液，搖勻，立即記下時間。于30水浴準確保溫糖化1小時。迅速加入15mL 0.1mol/L氫氧化鈉溶液，終止酶解反應。冷卻至室溫，用水定容至刻度。同時作一空白液：吸取25mL2可溶性淀粉溶液，置于50mL容量瓶中，先加入15mL 0.1mol/L氫氧化鈉溶液，然后準確加入5mL 定容至刻度。（3）定糖空白液測定：吸取堿性酒石酸銅甲、乙液各

4、5mL，置于150mL三角瓶中，準確加入5mL空白液，并用滴定管預先加入適量的0.1%標準葡萄糖溶液，使滴定時消耗的0.1%標準葡萄糖溶液在1mL以內(nèi)，搖勻。于電爐上加熱至沸騰，立即用0.1%標準葡萄糖溶液滴定至藍色消失，此滴定操作需在1min內(nèi)完成。糖化液測定：準確吸取5mL糖化液代替5mL空白液，其余操作同上。4 實驗現(xiàn)象和數(shù)據(jù)記錄表1定糖消耗的標準葡萄糖體積標準葡萄糖溶液消耗體積ml 9.26.7（稀釋了10倍）稀釋了10倍后再做糖化液的定糖實驗）5 計算與結(jié)果絕干固體曲，在小時內(nèi)水解可溶性淀粉為葡萄糖的毫克數(shù)。V50 100 1 10005 W糖化酶活力（ )c V10506.750

5、100 1 1000341.2mg5 5即 糖化酶活力9.2- 0.1% 105所以，實驗測得的糖化酶的活力為341.2mg。式中：V5mL空白液消耗0.1%標準葡萄糖溶液的體積（mL）0V5mL糖化液消耗0.1%標準葡萄糖溶液的體積（mL）C標準葡萄糖溶液濃度（g/mL）50/55mL 糖化液換算成 50mL 糖化液中的糖量（g）100/55mL 浸出液換算成 100mL 浸出液中的糖量（g）W絕干曲稱取量（5.0g）1000g 換算成 mg6 分析與討論 3 白液滴定是用原液，而糖化液是用 10 倍稀釋的，所以也會是結(jié)果不那么精確，改進放法：應把空白液也作 10 被稀釋比較好。蛋白酶活性的

6、測定（福林酚法）1 原理蛋白酶在一定的溫度 pH 條件下，水解酪蛋白底物，產(chǎn)生含酚基的氨基酸在堿性條件下，將福林還原，生成鉬藍和鎢藍，在 680nm 處測吸光度。2 儀器與試劑2.1 儀器紫外分光光度計 恒溫水浴鍋2.2 試劑TCA 酪蛋白溶液 碳酸鈉溶液 福林試劑3 實驗步驟比色管 1ml 于大試管中于 40 C 水浴 2min，再加TCA2ml 于 40 Coo水浴 10min，加酪蛋白溶液 1ml，搖勻，靜置 10min，過濾取濾液 1ml 于比色管中，加入碳酸鈉溶液5ml，加入福林試劑1ml，于40 C 水浴 20min，再測吸光度。o比色管 B: 加酶液 1ml 于大試管中于 40

7、C 水浴 40 Coo水浴 10min，再加TCA2ml，搖勻，靜置10min,過濾取濾液1ml，加入碳酸鈉溶液5ml，加入福林試劑 1ml，于 40 C 水浴 20min，再測吸光度。o4 實驗數(shù)據(jù)記錄4.1 標準曲線的制作表 2 不同濃度酪氨酸對應的 OD 值測定記錄標準濃度（ug/ml）OD 值0010203040500.120.2350.3520.4590.545圖 1 酪氨酸的標準曲線表 3 樣品 OD 值測定組別空白樣品A680nm 吸光值00.7345 實驗結(jié)果由標準曲線可知酪氨酸含量與 OD 值的關系為：y 0.0110 x0.0095將樣品的 OD=0.734 帶入上式可得：

8、0.7340.0110 x0.0095所以 65.86（u/ml)， 此x即是下式中的A1x1V141 1x311065.865041 1所以x3 1317.2(u/g)101也就是：樣品酶活力為131.72(u/g)式中：x3:樣品酶活力u/gA1：由標準曲線得出的樣品最終稀釋液的活力u/mlV1:50ml容量瓶體積4:反應試劑的總體積，單位為毫升（ml)m1:1g樣品質(zhì)量n1:1倍樣品稀釋倍數(shù)1/10:反應時間10min,以1min計6 分析與討論所以忽略儀器誤差，試劑誤差，該實驗結(jié)果可靠，結(jié)果正常。實驗的改進：因為我們小組的實驗組只測了一次OD值，誤差可能會大一些，所以應該將實驗組的樣品

9、測3個OD值，再取平均值，這樣可以減少相對誤差。是實驗結(jié)果更加可靠。7 注意事項 配制酪蛋白溶液時,在溶解過程中,應不斷攪拌,以便酪蛋白顆粒均勻,若顆粒大小不均勻或有大塊片狀物存在,則影響酶分子與底物分子的碰撞頻率,從而影響活力測定的準確性。 蛋白酶在水溶液狀態(tài)下很不穩(wěn)定,酶溶液必須在配制后立即測定。 比色管B40C中水浴10min，時間的延長和縮短都會對實驗結(jié)果造成較大的誤差。 使用的比色皿必須潔凈，并注意配對使用。手指應拿毛玻璃面的兩側(cè)，裝盛樣品量以2/3為度。透光面要用擦鏡紙擦拭干凈。 比色皿使用前應用試樣潤洗，使用后應立即用自來水沖洗干凈，倒置晾干。 吸光值在測定前應用空白溶液校正調(diào)零

10、，再進行測定。淀粉酶活力的測定1 原理-淀粉酶制劑能將淀粉分子鏈中的-1，4-葡萄糖苷鍵隨機切斷成長短不一的斷鏈糊精、少量麥芽糖和葡萄糖，而使淀粉對碘呈藍紫色的特性反應逐漸消失，呈現(xiàn)紅棕色，其顏色逐漸消失的速度與酶活有關，據(jù)此計算酶活力。2 儀器和試劑2.1 試劑原碘液 稀碘液 2%可溶性淀粉 0.02mol/L 磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液（pH=6.0) 待測酶液2.2 儀器白瓷板 移液管等3 實驗步驟于白瓷板空穴中滴入1.5ml稀碘液。取2%可溶性淀粉20ml和磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液5ml于25試管中，于60C恒溫水浴中預熱4-5min,隨后加入預先稀釋o好的酶液0.5ml搖勻2min后用吸管吸反應液0.5ml滴入預先滴有稀碘液的瓷板穴內(nèi)，當穴內(nèi)由紫色變?yōu)榧t棕色，即為反應終點，記錄時間。4 實驗結(jié)果不出結(jié)果。5 實驗結(jié)果的分析與討論由于全班的實驗都沒有得出結(jié)果，所以也即實驗失敗。那么失敗的原