《虎耳草多酚的抗氧化能力實證研究》14000字（論文）

虎耳草多酚的抗氧化能力實證研究摘要虎耳草多酚類物質(zhì)含量豐富，生長地區(qū)廣泛，易于栽培，具有極高的藥用與食用價值。用虎耳草為原料，經(jīng)過閃氏提取器打碎后，使用乙醇溶液為溶劑進行虎耳草多酚物質(zhì)的提取，提取產(chǎn)物經(jīng)過大孔吸附樹脂進行純化后進行高效液相色譜分析。通過實驗可知虎耳草的閃氏提取最優(yōu)方案為料液比1:30、體積分數(shù)40%、提取電壓80V、提取時間90s，在此實驗條件下多酚提取率為2.50%。多酚抗氧化性實驗表明虎耳草多酚具有良好的抗氧化能力且抗氧化能力在一定濃度范圍內(nèi)有線性關(guān)系，虎耳草多酚對超氧自由基具有良好的清除效果，對羥基自由基的清除能力略差，對DPPH清除率最低。關(guān)鍵詞虎耳草；多酚提?。患兓?；抗氧化性=目錄摘要 I1緒論 11.1虎耳草概述 11.2虎耳草功效 11.2.1強心作用 11.2.2利尿作用 11.3植物多酚概述 11.3.1植物多酚種類 2類黃酮類 2酚酸類 2木酚素 2單寧酸 2姜黃素 21.3.2多酚類物質(zhì)生理功能 3抗癌作用 3消炎、抑制細菌的作用 3降低血脂的作用 31.4提取方法 31.4.1溶劑提取法 31.4.2微波輔助提取 41.4.3離子沉淀法 41.4.4超臨界流體萃取 41.4.5生物酶解提取 41.4.6閃氏提取法 51.5多酚的檢測方法 51.5.1紫外-可見分光光度法 51.5.2高效液相色譜法 51.6虎耳草多酚的抗氧化性測定 51.6.1清除ABTS自由基法[32] 51.6.2對DPPH的清除能力 61.6.3羥基自由基的清除能力 61.6.4超氧自由基清除實驗 61.7研究意義 62材料及方法 72.1設(shè)備及所用試劑 72.1.1主要儀器設(shè)備 72.1.2試劑 72.1.3材料 72.2多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 82.3虎耳草多酚物質(zhì)的閃氏提取過程 82.3.1虎耳草閃氏提取的單因素實驗 8閃氏提取所用乙醇溶液體積分數(shù)的確定 8提取料液比的確定 8提取電壓的選擇 9提取時間的選擇 92.3.2提取率公式 92.4大孔吸附樹脂對虎耳草多酚類物質(zhì)的純化 92.4.1大孔吸附樹脂的預(yù)處理方法 92.4.2大孔吸附樹脂上柱 102.5高效液相色譜分析 102.5.1HPLC實驗準(zhǔn)備 102.5.2HPLC操作流程 102.6虎耳草多酚抗氧化性分析 102.6.1測定虎耳草多酚對DPPH自由基清除率 102.6.2測定虎耳草多酚對羥基自由基清除率 112.6.3測定虎耳草多酚對超氧自由基清除率 113結(jié)果及分析 123.1多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定 123.2閃氏提取法提取虎耳草多酚 123.2.1最佳乙醇體積分數(shù)的選擇 123.2.2最佳料液比的選擇 133.2.3最佳提取電壓的選擇 143.2.3最佳提取時間的選擇 143.3閃氏提取的正交試驗 153.6樣品的高效液相結(jié)果 163.7虎耳草多酚的抗氧化性測定 173.7.1對DPPH自由基的清除結(jié)果 173.7.2對羥基自由基的清除結(jié)果 183.7.3對超氧自由基的清除結(jié)果 183.7.4對ABTS自由基的清除結(jié)果 19結(jié)論 20致謝 21參考文獻 221緒論1.1虎耳草概述虎耳草（SaxifragastoloniferaCurt）也被稱為金絲荷葉，耳朵紅，為\o"虎耳草科"虎耳草科\o"虎耳草屬"虎耳草屬下的一個種，分布于中國、朝鮮和日本。綠色草本植物，整株植物上生有細毛。紫紅色細長的根莖，繁殖方式為枝莖著地即可產(chǎn)生新的植株。葉片形狀為橢圓形或不規(guī)則圓形，叢生于莖基部，葉片邊緣生有不規(guī)則的鋸齒，兩面顏色分別為綠色和紫紅色。6～7月開花，花梗自葉叢中抽出，著生紅紫色長毛，有五片白色的花瓣，其果實的形狀為卵圓形。始載于我國南宋醫(yī)藥學(xué)家王介著的《履巉巖本草》。具有清熱解毒、消炎鎮(zhèn)痛、去除濕熱的作用。在我國民間大多用于治療風(fēng)疹濕疹、感染性中耳炎、外皮擦傷、肺熱咳喘、肺癰、癤腫慢性支氣管炎等疾病[1]我國中草藥資源豐富，分布廣泛產(chǎn)小五臺山（位于河北?。?、陜西、甘肅、江蘇、及浙江等地。此外，將中草藥當(dāng)做飼料添和加劑應(yīng)用于畜牧養(yǎng)殖行業(yè)的時侯還具有促進動物成長、提高動物機體的免疫力、減緩應(yīng)激反應(yīng)、改善動物制品的品質(zhì)等優(yōu)點[2]虎耳草的枝葉中含巖白菜素，槲皮素，沒食子酸，原兒茶酸和甲基延胡索酸。莖含兒茶酚。而且從虎耳草中還可以提取到熊果酚甙，槲皮素-5-O-葡萄糖甙，氨基酸，硝酸鉀及氯化鉀等物質(zhì)。其內(nèi)部所含的酚酶能把咖啡酸氧化成相應(yīng)的鄰位醌，發(fā)生自然氧化而生成馬栗樹皮素，使虎耳草在醫(yī)學(xué)上具有很高的研究價值。1.2虎耳草功效1.2.1強心作用取虎耳草新鮮汁液或其乙醇提取液作用于離體蛙心，實驗結(jié)果表明兩種溶液都對蛙心有一定的強心作用。若將溶液中鈣離子出去后，實驗結(jié)果表明仍然對離體蛙心產(chǎn)生強心作用，只是效果不如去鈣離子之前。1.2.2利尿作用使用虎耳草乙醇提取液對犬類和兔類動物進行活體靜脈注射，實驗結(jié)果表明虎耳草乙醇溶液具有一定利尿作用，若將虎耳草提取液中的甙類物質(zhì)破壞或除去之后，結(jié)果仍然顯示一定的利尿作用。1.3虎耳草提取物的研究進展1.3.1虎耳草素的生理功能研究根據(jù)雷瑾[3]等人對相關(guān)文獻的查閱整理發(fā)現(xiàn)虎耳草素具有良好的止痛和護肝作用，并且對一些炎癥特別是HIV病毒存在抑制作用，其中異虎耳草在治療咳嗽方面功效顯著，通過動物實驗證明一定劑量的虎耳草素能使動物的免疫力獲得一定程度的增強，同時虎耳草素對農(nóng)作物上常見病菌具有較強的抑制作用，在抑制農(nóng)害方面應(yīng)用前景較為廣闊。1.3.2虎耳草精油的研究進展張之俠[4]以虎耳草為原料，對其中的虎耳草精油進行提取并對其成分和抑菌活性進行分析得出結(jié)論虎耳草精油中所含的化學(xué)成分大部分為十五烷酸還有極少數(shù)烴類醇類等物質(zhì)。抑菌活性的實驗表明虎耳草精油對小麥病毒具有極強的抗菌作用并且對其他病菌的抑菌效果良好，但是虎耳草精油中的具體抑菌成分尚不明確，需要進一步實驗來證明和驗證。1.3植物多酚概述植物多酚(plantpolyphenol)是一類廣泛存在于各種植物的皮、根、葉、果中的具有酚類組成結(jié)構(gòu)的次級代謝產(chǎn)物。一般認為植物多酚是相對分子質(zhì)量在500-3000之間的單寧或鞣質(zhì),還可以是以花青素、櫟精、沒食子酸熊果嘧啶為代表的相對分子上質(zhì)量較小的酚類化合物。通常認為植物多酚分為2類:水解單寧和縮合單寧。水解單寧在結(jié)構(gòu)組成上和縮合單寧有較大差異,導(dǎo)致兩種物質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)和反應(yīng)機理也不相同，例如水解南寧的酸堿穩(wěn)定性較差易發(fā)生水解，而縮合單寧的酸堿穩(wěn)定性略強，在pH較高的條件下生成沉淀。但是兩種物質(zhì)所共有的多酚結(jié)構(gòu)使它們在一些化合反應(yīng)上具有共同特性。1.3.1植物多酚種類植物多酚物質(zhì)種類繁多，分布廣泛，在蔬菜和水果等植物中含量較高，并呈現(xiàn)出不同的顏色，主要以共軛形式出現(xiàn)，通常作為營養(yǎng)強化劑添加在保健食品中，具有多種保健作用，目前發(fā)現(xiàn)的多酚類物質(zhì)已經(jīng)有8000多種[5]類黃酮類黃酮類化合物廣泛存在與植物和水果中，進一步分類有黃酮醇、花色素等[6]，功效眾多具有良好的抗氧化作用，對人體健康起到保健作用，如降低膽固醇阻止肥胖的發(fā)生[7-8]且在動物飼料中也有應(yīng)用，在動物飼料中添加黃酮類化合物可減少動物的發(fā)病率，使動物肉制品的口感肉和品質(zhì)得到提高[9]。酚酸類一種非類黃酮物質(zhì)在植物中通常以游離態(tài)和結(jié)合態(tài)兩種形式存其衍生物大多屬于苯甲酸和肉桂酸類[10]具有良好的殺菌和清除自由基作用可用于化妝品中具有使肌膚美白的功效。木酚素木酚素是一種的植物雌激素，多以二聚體形式存在，在亞麻籽中的含量較多。在治療血管疾病和抑制癌細胞方面功效顯著對更年期癥狀有一定的緩解作用具有抗氧化、降低血糖、抗腫瘤等功效[11]。單寧酸單寧是屬于植物多酚中的一種天然化合物，以水解單寧和縮合單寧兩種形式存在于植物中具有良好的抑菌消炎，清除人和動物體內(nèi)自由基的作用[12]也可用于動物飼料中的食品添加劑提高動物制品的品質(zhì)和口感。姜黃素姜黃素是一種多酚類化合物，通常來源于姜科植物的根莖中，化學(xué)式為C21H20O6。能夠維護體細胞組織，能防衰老，抗抑郁，對脂肪組織也是有緩沖作用，對減肥有一定的好處醫(yī)學(xué)研究證明，姜黃素具有良好的消炎抑菌，對癌細胞有一定的抑制效果并且能夠提高人體免疫力維護人體健康的優(yōu)良生理作用[13]。1.3.2多酚類物質(zhì)生理功能抗癌作用醫(yī)學(xué)研究表明水果和蔬菜中的多酚類物質(zhì)具有阻止癌細胞和腫瘤生長的作用，能夠抑制多種癌細胞的生長和繁殖且具有良好的抗氧化性，改善細胞周期，促進癌細胞凋零對正常細胞有一定的保護能力。左麗麗[14]等人以東北野生獼猴桃為原料研究獼猴桃多酚的抗癌活性實驗表明，獼猴桃中含有的多酚物質(zhì)具有良好的抗癌活性，但是抗癌機理目前尚不明確。消炎、抑制細菌的作用有實驗結(jié)果顯示多酚類的物質(zhì)可以有效抑制大腸桿菌[15]、銅綠熒光假單孢芽胞菌、金黃色熒光葡萄球菌等多種致病菌的生長。劉曉艷等研究者對荷葉葡萄中的黃酮進行了提取,并對其進行了抑菌優(yōu)化試驗,發(fā)現(xiàn)其中的物質(zhì)可以有效抑制土壤中的銅綠假熒光單孢菌、酵母菌、熒光假單孢菌等的生長,并通過優(yōu)化的抑菌實驗得到了黃酮抑菌的最低作用濃度。李鳳英[16]等研究者利用荷葉葡萄中提取的多酚類黃酮物質(zhì)對荷葉枯草中的銅綠芽孢桿菌、傷寒沙門氏菌、普通變形桿菌等進行了多種抑菌優(yōu)化實驗,實驗結(jié)果表明,葡萄球菌中所含有的的多酚黃酮類物質(zhì)對以上的大腸桿菌，沙門氏菌等細菌都具有一定的殺菌作用。降低血脂的作用隨著小康社會的全面建成，人們的生活條件越來越好，日常飲食習(xí)慣也在逐漸改變，導(dǎo)致高血脂患者日益增多，逐漸成為現(xiàn)代社會危害健康的主要疾病之一，而多酚類物質(zhì)具有明顯改善高血脂，預(yù)防血管疾病的作用而越來越受到人們的重視。熊何建[17]等人的實驗結(jié)果表明葡萄籽多酚具有抑制血脂升高，促進脂質(zhì)分解的作用，說明多酚類物質(zhì)具有良好的降脂作用，并且對肝臟有一定的保護作用。1.3.3多酚的研究進展多酚對腸道菌群的影響研究根據(jù)任彩君，吳黎明[18]等人研究多酚物質(zhì)對人體腸道菌群作用的研究結(jié)果表明，膳食多酚對人體腸道健康的作用巨大，主要表現(xiàn)在影響腸道內(nèi)的菌類組成和改善腸道內(nèi)各種生物酶的活性，調(diào)節(jié)腸道菌群失調(diào)，維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)免受有害細菌的破壞，同時又能起到預(yù)防糖尿病和心血管疾病，增強人體免疫力，為多酚在調(diào)節(jié)人體內(nèi)環(huán)境和預(yù)防多種疾病方面提供了新的參考方向。多酚在水產(chǎn)品保鮮方面的研究進展藍蔚青[19]等人以茶多酚研究對象探究茶多酚對水產(chǎn)品保鮮的功能，發(fā)現(xiàn)茶多酚能夠有效抑制水產(chǎn)品蛋白質(zhì)的氧化阻止魚肉發(fā)生腐敗變質(zhì)并延長保存時間。尤其甲酯化處理后的改性茶多酚不僅具有良好的抗氧化性，而且其脂溶效果也得到了巨大提升，茶多酚作為保鮮劑與傳統(tǒng)的化學(xué)保鮮劑相比具有天然無毒、使用安全、制備成本低、保鮮效果好等明顯優(yōu)勢，使茶多酚在水產(chǎn)品保鮮領(lǐng)域有巨大潛力。1.4提取方法植物多酚的提取方法繁多，現(xiàn)在普遍使用的多酚提取方法有:超臨界流體萃取法；生物酶解法；微波輔助提取；離子沉淀法提取。提取所用的溶劑通常以丙酮-水反應(yīng)體系為主[20-24],還有的使用甲醇和甲醇-水的有機混合物為溶劑進行多酚提取[25-27],乙酸乙酯可以用來溶解一些水解單寧和縮合單寧，小分子多元酚類物質(zhì)可以用硫酸進行溶解。1.4.1溶劑提取法溶劑提取法是根據(jù)相似相溶的原理，將所要提取的物質(zhì)從物料中選擇性分離出來并且溶解于其他溶劑中的方法，如果所提取的物質(zhì)為脂溶性，則選取親脂性溶劑進行提取，如石油醚、乙醚等，若物質(zhì)為水溶性，則選取親水性溶劑進行提取，如乙醇、丙酮等。溶劑提取法提取的效果容易受物料的顆粒大小，提取溫度，提取時間等因素的影響，如一些物質(zhì)在高溫下易分解，則溫度控制會顯著影響實驗提取的效果。使用部分有機溶劑進行提取過程中，溶劑會造成污染，對健康產(chǎn)生影響，在后期提純過程中易存在溶劑分離不完全的情況，引發(fā)食品安全問題1.4.2微波輔助提取微波射線可以完全自由地通過對于微波透明的溶劑,從而直接到于植物原料的內(nèi)部,使得細胞內(nèi)的溫度急劇上漲和增加,較高的溫度使原料的細胞壁內(nèi)壓力不斷增大而導(dǎo)致細胞發(fā)生破裂，從而使所要提取的化學(xué)物質(zhì)溶解于溶劑中。由于不同化學(xué)物質(zhì)的理化性質(zhì)不同，其對微波射線的吸收和反射能力，產(chǎn)熱和放熱能力也不盡相同，而使被提取的物質(zhì)從多種物質(zhì)混合的體系中分離出來，溶解于對微波吸收能力較差的溶劑中。微波輔助提取[28]不但效率高、它還具有選擇性高、能源消耗低、運營成本低、符合環(huán)境質(zhì)量要求等特點,被廣泛應(yīng)用在化學(xué)成分主要包括生物堿、黃酮類、有機酸、皂苷、皂甙、皂素類、多糖類的分離與純化。1.4.3離子沉淀法多酚類物質(zhì)可以在液體中與某些金屬離子發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)生成沉淀而將多酚從原料中分離出來，然后經(jīng)特定溶劑進行溶解萃取可得到多酚物質(zhì)。使用該方法進行多酚的提取得到的產(chǎn)品品質(zhì)較好但是多酚的提取率較低，提取過程中損失較大易造成多酚的氧化而使產(chǎn)率將低，并且提取所用的沉淀劑可能對人體健康有一定的影響，實驗整體成本較高，并不是一種滿意的多酚類物質(zhì)提取方法1.4.4超臨界流體萃取超臨界萃取法就是將超臨界的液體作為主要溶劑進行萃取。超臨界的液體主要指溫度和壓力都比臨界值大的一種液體,超臨界流體主要兼具氣體和液體兩種化學(xué)特征的優(yōu)點具有良好的溶解性和傳質(zhì)穩(wěn)定性，且表面張力值為零，它可以與提取物迅速地達到傳質(zhì)均勻,將物質(zhì)進行有效地分離。通過超臨界流體與物料充分接觸，由于物料中不同物質(zhì)的理化性質(zhì)不同而選擇性的溶解物料中需要被提取的物質(zhì)，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)而將超臨界流體與被提取的物質(zhì)分離從而達到分離純化的目的，將萃取分離兩種工藝融合為一體。1.4.5生物酶解提取生物酶解技術(shù)的原理是利用酶促反應(yīng)的專一性選擇合適的酶類物質(zhì)對原料的細胞結(jié)構(gòu)進行分解和破壞，從而使所提取的多酚從原料中釋放出來并溶解在特定的溶劑中而達到多酚提取的目的。該方法提取多酚的作用條件較為溫和，采用非有機溶劑，得到的產(chǎn)品純度更高且無毒無污染，可以用作少量多酚的提取方法。劉海軍等人采用生物酶解技術(shù)以低檔綠茶為原料使用特定酶類進行茶多酚的提取實驗[29]，得出茶多酚的最佳提取條件為酶用量為0.20%、提取溫度為60°C、提取時間為80min、pH值為4.6時茶多酚的提取率高達13%1.4.6閃氏提取法組織破碎提取法又稱閃式提取法，利用刀頭的高速旋轉(zhuǎn)在較短時間內(nèi)將植物的根、莖、葉、花、果材料研磨成細小顆粒，使細胞內(nèi)有效成分充分釋放，快速溶解于溶劑中，通過過濾達到提取目的。閃氏提取不會對植物內(nèi)部活性成分造成破壞和分解，提取時間短，工作效率高，且操作方法簡單方便，能夠節(jié)約大量成本，適合多種化學(xué)成分的提取分離，是提取虎耳草多酚物質(zhì)的絕佳方法。組織破碎提取技術(shù)適用于植物的各個部位有效成分的提取，在黃酮類、皂苷類、單寧類、多酚類等成分的提取有廣泛的應(yīng)用，可以單品種提取，也可以從多種混合品種中提取。張云等人[30]采用閃氏提取法提取枇杷葉總多酚。結(jié)果表明，在相同條件下，閃速提取比回流提取和超聲提取的提取率高。1.5多酚的檢測方法1.5.1紫外-可見分光光度法紫外-可見分光光度法可以測量物料在190nm到800nm波長范圍內(nèi)的吸光度，如果所檢測物質(zhì)對光不存在吸收作用，可以通過添加特定顯色劑的方法使之產(chǎn)生顏色，而對光產(chǎn)生吸收作用。根據(jù)朗博比爾定律而對物料進行定性和定量分析適合用作多酚物質(zhì)的檢測。1.5.2高效液相色譜法高效液相色譜法通常用來檢測混合物中各組分的存在以及含量，用高壓將待測液體注入色譜柱，混合液體中各種成分在流動相與固定相的分配系數(shù)不同導(dǎo)致每種成分的運動速度不同而分別從色譜柱內(nèi)流出。根據(jù)流出的先后順序不同將各組分區(qū)分開來并經(jīng)檢測區(qū)接收轉(zhuǎn)化為電信號由記錄器和電腦轉(zhuǎn)化為圖譜。高效液相色譜技術(shù)廣泛應(yīng)用于食品和生物等研究如食品中化學(xué)添加劑的檢測等[31-33]。1.6虎耳草多酚的抗氧化性測定1.6.1清除ABTS自由基法[34] ABTS中文名稱為2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽，ABTS自由基清除的實驗原理為2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽與過硫酸鉀反應(yīng)生成綠色ABTS。通過檢測740nm下原料與ABTS溶液反應(yīng)后的吸光度與反應(yīng)前ABTS溶液的吸光度進行對比，如果在740nm吸光度下降則說明原料對ABTS自由基有一定的清除作用，該方法可以用來測定實驗所用物質(zhì)對ABTS自由基的清除能力，并且能與VC作對照來得出其抗氧化能力的大小，目前該方法已被廣泛使用1.6.2對DPPH的清除能力DPPH中文名1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，可通過實驗原料對DPPH自由基的清除能力來檢測物質(zhì)的抗氧化活性。實驗原理為DPPH與清除劑反應(yīng)后在517nm處的吸光值會比DPPH在517nm處的吸光值有所減小，說明DPPH自由基有一部分被清除而導(dǎo)致吸光值減小從而判斷清除劑是否具有抗氧化能力，同時可以用相同濃度VC溶液作對照來評價該清除劑對DPPH自由基的清除能力及抗氧化性，若清除劑的抗氧化性強于VC說明該清除劑具有相當(dāng)強的抗氧化性。1.6.3羥基自由基的清除能力過氧化氫與硫酸亞鐵溶液中亞鐵離子生成羥自由基，羥自由基又能與水楊酸生成紫色化合物，通過測定該化合物在510nm處的吸光值可以反映出羥自由基的量，通過該方法比較加入清除劑前后的510nm處吸光值來體現(xiàn)清除劑對羥自由基的清除能力，若加入清除劑后在510nm處的吸光值比加入清除劑要低則能夠說明該清除劑對羥自由基具有清除能力。同時可用VC作對照來評價該清除劑的抗氧化能力。1.6.4超氧自由基清除實驗本實驗采用鄰苯三酚法測定清除劑對超氧自由基的清除能力，鄰苯三酚可以在堿性條件下自身發(fā)生氧化生成超氧自由基，通過比較堿性環(huán)境中鄰苯三酚與清除劑反應(yīng)前后所生成的超氧自由基的量，評價清除劑對超氧自由基生成的抑制能力，從而判斷清除劑對超氧自由基是否具有清除作用。超氧自由基在320nm具有吸收峰可通過測量反應(yīng)前后吸光度確定超氧自由基的量，該方法簡單易行被廣泛運用。1.7研究意義隨著人們生活水平的不斷提高和社會的之間發(fā)展。人們對植物多酚的保健作用越來越重視，虎耳草活性成分中多酚類物質(zhì)含量豐富，對人體健康有極大益處，但是目前醫(yī)學(xué)上對虎耳草的成分研究技術(shù)并不成熟，活性物質(zhì)不能充分提取和利用，所，可以從提取方法、純化方法、檢驗方法、保存方法等方面對虎耳草中多酚類物質(zhì)進行理化性質(zhì)分析和分離純化從而使有效成分得到充分利用。我國虎耳草種植地區(qū)分布廣泛，物產(chǎn)資源豐富，有利于對虎耳草活性物質(zhì)進行深度研究和開發(fā)利用。

2材料及方法2.1設(shè)備及所用試劑2.1.1主要儀器設(shè)備KQ-300B型超聲波清洗機蘇州超聲儀器有限公司EL204電子天平梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋國華電器有限公司101型電熱鼓風(fēng)干燥箱光正醫(yī)療儀器廠ZHBE-50T閃式提取器麥科儀科技有限公司R206B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀申生科技公司 SHZ-D(III)循環(huán)水式真空泵上海東璽制冷儀器設(shè)備有限公司雙功能數(shù)顯恒溫振蕩器上海梅香儀器有限公司TU-1810PC紫外分光光度計欣茂儀器有限公司Agilent1100高效液相色譜儀美國安捷倫科技有限公司2.1.2試劑無水乙醇分析醇國藥集團化學(xué)試劑有限公司福林酚源葉生物公司焦性沒食子酸天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司無水碳酸鈉天津福晨化學(xué)試劑廠氫氧化鈉江蘇徐州騰獅化工廠鹽酸上海凌峰化學(xué)試劑有限公司Tris水楊酸Feso4過氧化氫DPPH抗壞血酸2.1.3材料X-5型大孔吸附樹脂虎耳草將新鮮虎耳草葉在烘箱中進行烘干處理然后放入粉碎機中進行粉碎，將打碎的虎耳草過90目篩，取過篩后的虎耳草粉末加入一定體積分數(shù)乙醇后用保鮮膜包裹防止污染和提取時液體飛濺造成損失然后進行閃式提取，將提取液用離心機在4000轉(zhuǎn)離心10min，在760nm波長處測定其吸光值，根據(jù)多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品中多酚物質(zhì)的準(zhǔn)確含量；將閃氏提取后的粗多酚溶液用X-5型大孔吸附樹脂純化，分三次收集純化后濾液備用。將純化后的虎耳草多酚提取濾液進行高效液相色譜分析，與多酚標(biāo)準(zhǔn)品對照判斷樣品中所含多酚類物質(zhì)的種類及含量。2.2多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制用電子天平準(zhǔn)確稱取5mg沒食子酸粉用少量純水將其完全溶解、定容至100mL容量瓶，取6只25mL容量瓶進行標(biāo)號，按標(biāo)號分別加入0mL、0.5mL、1mL、1.5mL、2mL、2.5mL溶液加入1mL福林酚試劑，濃度15%碳酸鈉溶液1.5mL加入蒸餾水定容，在避光觸反應(yīng)1h于760nm處通過紫外分光光度計檢測吸光值，根據(jù)吸光值和濃度繪制多酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.3虎耳草多酚物質(zhì)的閃氏提取過程在燒杯中準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的虎耳草粉末，加入一定量適當(dāng)濃度的酒精溶液充分浸提，適當(dāng)攪拌后用保鮮膜將燒杯口進行包裹防止閃氏提取過程中液體飛濺造成物料損失。將閃氏提取器刀頭浸入液體但不觸碰燒杯底部，閃氏提取器的工作時間控制在40s到160s，工作電壓低于150v，避免閃氏提取器長時間高電壓工作的情況下機器過熱而使設(shè)備受損壞。提取完成后，將刀頭上升并進行清洗。閃氏提取所得到虎耳草多酚的粗提取液用離心機在4000轉(zhuǎn)進行離心10min后循環(huán)水式真空泵抽濾后得到虎耳草多酚物質(zhì)提取液樣品備用。2.3.1虎耳草閃氏提取的單因素實驗為得出虎耳草多酚物質(zhì)提取的最優(yōu)提取方案，本實驗通過控制乙醇溶液的體積分數(shù)、料液比、閃氏提取時間和閃氏提取電壓進行多組單因素試驗，分別計算出固形物的提取率和多酚物質(zhì)的提取率來確定最優(yōu)的多酚物質(zhì)提取方案。閃氏提取所用乙醇溶液體積分數(shù)的確定分別量取150mL30%、40%、50%、60%、70%體積分數(shù)的乙醇溶液各加入5g虎耳草樣品，攪拌后經(jīng)保鮮膜密封后閃氏提取，將閃氏提取后粗多酚液經(jīng)離心機離心后用進行抽濾，取少量樣液在760nm處用紫外分光光度計測出吸光值，分別計算出不同體積分數(shù)的乙醇溶液條件下的多酚提取率以及固形物提取率得出最優(yōu)結(jié)論。提取料液比的確定分別配制體積為75mL、100mL、125mL、150mL、200mL乙醇溶液，體積分數(shù)為乙醇體積分數(shù)單因素試驗得出的最優(yōu)結(jié)果，各加入5g虎耳草樣品，攪拌后經(jīng)保鮮膜密封后閃氏提取，將閃氏提取后粗多酚液經(jīng)離心機離心后用進行抽濾，取少量樣液在760nm處用紫外分光光度計測出吸光值，分別計算出不同料液比乙醇溶液條件下的多酚提取率以及固形物提取率得出最優(yōu)結(jié)論。提取電壓的選擇將閃氏提取器的工作電壓分別設(shè)置在40V、60V、80V、90V的條件下進行虎耳草多酚物質(zhì)的閃氏提取，料液比為料液比單因素試驗得出的最優(yōu)結(jié)果，各加入5g虎耳草樣品，攪拌后經(jīng)保鮮膜密封后閃氏提取，將閃氏提取后粗多酚液經(jīng)離心機離心后用進行抽濾，取少量樣液在760nm處用紫外分光光度計測出吸光值，分別計算出不同的閃氏提取器工作電壓條件下的多酚提取率以及固形物提取率得出最優(yōu)結(jié)論。提取時間的選擇分別將閃氏提取器工作時間設(shè)定為30s、45s、60s、75s、90s、閃氏提取器的工作電壓為提取電壓單因素試驗得出的最優(yōu)結(jié)果各加入5g虎耳草樣品，攪拌后經(jīng)保鮮膜密封后閃氏提取，將閃氏提取后粗多酚液經(jīng)離心機離心后用進行抽濾，取少量樣液在760nm處用紫外分光光度計測出吸光值，分別計算出不同的閃氏提取器工作時間條件下的多酚提取率以及固形物提取率得出最優(yōu)結(jié)論。2.3.2提取率公式（1）固形物提取率其中：m1——固形物質(zhì)量+培養(yǎng)皿質(zhì)量，g；m0——培養(yǎng)皿質(zhì)量，g；v1——粗多酚抽濾后樣液體積，mL；v——粗多酚抽濾后樣液體積，mL；M——所用虎耳草的質(zhì)量，g。（2）多酚提取率公式多酚提取率（%）=C其中：C——多酚樣液濃度，μg/mL；V——多酚樣液體積，mL；W——稀釋倍數(shù)。2.4大孔吸附樹脂對虎耳草多酚類物質(zhì)的純化2.4.1大孔吸附樹脂的預(yù)處理方法大孔吸附樹脂的工作原理是樹脂本身與被吸附的物質(zhì)之間存在范德華力，大孔吸附樹脂存在多孔結(jié)構(gòu)，能夠?qū)Ρ晃降奈镔|(zhì)產(chǎn)生篩選作用，由于樹脂的比表面積較大而使物質(zhì)吸附，根據(jù)吸附篩選的原理，通過使用一定的溶劑進行洗脫而將吸附能力不同以及分子質(zhì)量不同的有機物質(zhì)進行分離純化，具有能將樣品除雜，濃縮的優(yōu)點。將新的大孔吸附樹脂在95%乙醇中浸泡一天，去除部分有機雜質(zhì)，然后不斷用純水沖洗至聞不到乙醇味。將純水沖洗之后的大孔吸附樹脂用濃度為5%的鹽酸溶液浸泡12h后再次純水沖洗，直到?jīng)_洗樹脂后的廢液用pH試紙檢測為中性為止。再將純水沖洗后的大孔吸附樹脂用濃度為5%的氫氧化鈉溶液浸泡12h后用純水沖洗至廢液用pH試紙檢測為中性為止，晾干備用。2.4.2大孔吸附樹脂上柱大孔樹脂的濕法裝柱步驟如下：（1）將玻璃柱上端的閥門打開下端閥門關(guān)閉，把玻璃柱垂直固定在桌面上，實驗過程中要保持玻璃柱的垂直狀態(tài)防止傾斜。（2）將處理后的大孔樹脂用純水沖入玻璃柱，注意沖水時動作要緩慢，避免速度過快而使玻璃柱中產(chǎn)生氣泡，大孔樹脂占玻璃柱體積約4/5即可。（3）如果在上柱過程中發(fā)現(xiàn)玻璃柱內(nèi)存在氣泡，可通過敲擊玻璃柱使氣泡上浮，如果氣泡過多不易消除，則用純水將樹脂全部沖出后重新上柱，直到上柱效果滿意為止。（4）在使用大孔吸附樹脂純化的過程中要保持濕潤，液面高度要保持在樹脂上方約3cm即可。（5）閉合上端開關(guān)，接通恒流泵即可使用。2.5高效液相色譜分析2.5.1HPLC實驗準(zhǔn)備選取合適的流動相并進行過濾防止存在微粒對設(shè)備造成損壞，保持流通池的濕潤狀態(tài)，將樣品進行過濾后裝入小瓶以便于液相色譜分析使用2.5.2HPLC操作流程（1）開機檢查設(shè)備、流路、信號連接是否完好；（2）配制相應(yīng)流動相，過濾膜；（3）配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，過濾膜；（4）儀器自檢、脫氣、清洗柱塞桿、設(shè)置流速、流動相比例、平衡柱子等。（5）將樣品放于樣品托板的對應(yīng)位置，并在計算機上對不同的樣品進行標(biāo)記處理。（6）待儀器預(yù)熱完成且基線呈現(xiàn)平穩(wěn)趨勢后，開始對進樣的粗多酚樣品進行HPLC分析。（7）進樣分析完畢，沖洗反向柱，關(guān)閉泵清洗儀器處理廢液。2.6虎耳草多酚抗氧化性分析2.6.1測定虎耳草多酚對DPPH自由基清除率用電子天平準(zhǔn)確稱取5mmol/LDPPH加入體積為1L的無水乙醇配置成濃度為5mmol/L的DPPH酒精溶液，將多酚提取液用純水分別稀釋成55、110、220、330、440μg/mL的梯度濃度稀釋液，取5只試管分別加入多酚提取液2mL、DPPH酒精溶液2mL后搖勻靜止讓其反應(yīng)0.5h，用2mL無水乙醇和蒸餾水的混合溶液作為參比溶液在517nm處用紫外分光光度計測其吸光度記為Ai用2mL多酚樣品液和無水乙醇的混合溶液作對照測其在517nm處吸光度記為Aj，用2mLDPPH酒精溶液與純水的混合溶液作為對照組在517nm處測其吸光度記為A0，重復(fù)上述方法用抗壞血酸替代多酚樣品進行試驗并測定吸光度并計算出清除率。2.6.2測定虎耳草多酚對羥基自由基清除率取5支的試管,加入9.0mmol/LFeSO4溶液1mL,9.0mmol/L水楊酸-乙醇溶液1mL,不同質(zhì)量濃度的虎耳草多酚梯度稀釋溶液1mL,最后加入8.8mmol/LH2O21mL于室溫下反應(yīng)1h,在510nm處測定樣品的吸光度Ai。以水代替多酚溶液為參比,測定對照組吸光度A0。以9.0mmol/LFeSO4,9.0mmol/L水楊酸-乙醇溶液,不同質(zhì)量濃度的虎耳草多酚梯度稀釋溶液,純水1mL混合測定吸光度Aj。用同樣的方法測定VC的吸光度。根據(jù)計算公式計算?OH自由基清除率清除率=2.6.3測定虎耳草多酚對超氧自由基清除率在5支試管中分別加入3mLTris-HCl緩沖液(pH8.2),1mL不同質(zhì)量濃度的虎耳草多酚梯度稀釋液,30℃下保溫20min,加入30℃下水浴鍋中加熱的7mmol/L的鄰苯三酚溶液0.3mL反應(yīng)5min后,加入1mL10mmol/LHCl溶液使反應(yīng)停止,在420nm處測定該溶液吸光度Ai。以水為參比代替多酚,測定對照組吸光度A0。以純水代替鄰苯三酚混合測定吸光度Aj。用同樣的方法測定VC的吸光度。平行測3次,取其平均值,計算O2_自由基清除率。

3結(jié)果及分析3.1多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定按照表3-1的試驗方法配制出不同梯度濃度的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。根據(jù)760nm處不同濃度的沒食子酸溶液的吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，具體曲線見圖3-1沒食子酸體積（mL）福林酚體積（mL）15%碳酸鈉體積（mL）沒食子酸濃度(μg/mL)760nm處吸光度A015000.751510.1661.251520.2861.751530.4062.251540.5262.751550.6453.251560.764表3-1多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線圖3-1多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線3.2閃氏提取法提取虎耳草多酚3.2.1最佳料液比的選擇按照的實驗步驟進行閃氏提取后將粗多酚液離心后用抽濾，取少量樣液在760nm處用紫外分光光度計測出吸光值，分別計算出不同料液比乙醇溶液條件下的多酚提取率具體數(shù)據(jù)為表3-2和圖3-2。表3-3料液比對虎耳草多酚提取率的影響料液比1:151:201:251:301:40多酚提取率1.43%1.59%1.77%1.91%1.85%圖3-1料液比對虎耳草多酚提取率的影響對圖3-2進行分析可知，隨著料液比的變化多酚提取率表現(xiàn)出先升高后減小的明顯趨勢，在料液比為1:30時多酚提取率達到組高點故后續(xù)實驗的料液比定為1:30。3.2.2最佳提取時間的選擇按照節(jié)的實驗步驟閃氏提取后將粗多酚液離心后進行抽濾，取少量樣液在760nm處用紫外分光光度計測出吸光值，分別計算出不同的閃氏提取器工作時間條件下的多酚提取率。表3-3和圖3-3為詳細數(shù)據(jù)。表3-3提取時間對虎耳草多酚提取率的影響提取時間50s60s70s80s90s多酚提取率1.50%1.75%2.00%2.10%1.96%圖3-3提取時間對虎耳草多酚提取率的影響對圖3-3分析可知，多酚提取率隨著提取時間的增加先呈現(xiàn)出上升趨勢而在80s后又開始下降且提取率在80s時達到最高則后續(xù)實驗將閃氏提取器工作時間設(shè)置為80s。3.2.3乙醇體積分數(shù)的選擇按照的試驗方法進行閃氏提取將提取后粗多酚液離心后用進行抽濾，取少量樣液在760nm處用紫外分光光度計測出吸光值，分別計算出不同體積分數(shù)的乙醇溶液條件下的多酚提取率具體結(jié)果見表3-4和圖3-4。表3-4不同體積分數(shù)的乙醇溶液對應(yīng)的多酚提取率乙醇體積分數(shù)30%40%50%60%70%多酚提取率0.99%1.30%1.26%1.19%1.13%圖3-4乙醇體積分數(shù)對虎耳草多酚提取率的影響根據(jù)散點圖3-4可知，乙醇體積分數(shù)在30%至70%范圍內(nèi)所對應(yīng)的多酚提取率呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，體積分數(shù)為50%時多酚提取率達到最大值，故后續(xù)實驗的乙醇體積分數(shù)定為40%。3.2.4最佳提取電壓的選擇按照節(jié)的實驗步驟閃氏提取后在將粗多酚液經(jīng)離心后進行抽濾，分別取少量樣液在760nm處用紫外分光光度計測出吸光值，分別計算出不同的閃氏提取器工作電壓條件下的多酚提取率。表3-5和圖3-5為詳細結(jié)果。表3-5提取電壓對虎耳草多酚提取率的影響提取電壓40V50V60V80V100V多酚提取率1.30%1.45%1.66%2.00%1.86%圖3-5提取電壓對虎耳草多酚提取率的影響對圖3-5分析可知，虎耳草多酚的提取率隨著閃氏提取器工作電壓的升高呈現(xiàn)出先增加后平緩最后趨近平衡的趨勢可以判斷多酚提取率在80V的工作電壓下達到最高，故后續(xù)實驗將閃氏提取器工作電壓設(shè)置為恒定80V。3.3閃氏提取的正交試驗為了得到閃氏提取虎耳草多酚的最優(yōu)試驗方法，后續(xù)實驗將在單因素實驗的基礎(chǔ)上進行一系列正交試驗確定不同的實驗變量對實驗結(jié)果影響程度的大小確定實驗變量的優(yōu)先級并根據(jù)實驗結(jié)果進行極差分析得出的多酚提取率分析出最佳實驗方案，具體實驗內(nèi)容見表3-6。表3-6閃式提取虎耳草多酚的正交實驗編號酒精體積分數(shù)料液比電壓提取時間多酚提取率（%）140%1:2080V60s1.55240%1:2590V75s1.34340%1:30100V90s1.71450%1:2090V90s1.27550%1:25100V60s1.31650%1:3080V75s1.71760%1:20100V75s1.27860%1:2580V90s1.49960%1:3090V60s1.56K14.64.094.754.42最佳組合為：A1B3C1D3K24.22K34.324.984.294.47k11.531.361.581.47k21.431.381.391.44k31.441.661.431.49R(極差)90.03根據(jù)表3-6分析可知通過極差分析法得出對閃氏提取實驗結(jié)果影響最大的因素是料液比，其次為提取電壓，再次酒精的體積分數(shù)，提取時間對多酚提取率的影響程度最小。按照得出結(jié)論進行驗證試驗發(fā)現(xiàn)當(dāng)料液比為1：30、閃氏提取電壓80V、酒精體積分數(shù)為40%、閃氏提取時間為90s時獲得2.5%的最高提取率則可以確定正交試驗得出的方案為最佳。3.6樣品的高效液相結(jié)果分別將經(jīng)過大孔吸附樹脂純化前后的虎耳草多酚樣品進行液相色譜分析圖3-9樣品純化前HPLC色譜圖圖3-10樣品純化后HPLC色譜圖由上圖可知樣品中含有沒食子酸和槲皮素。3.7虎耳草多酚的抗氧化性測定3.7.1對DPPH自由基的清除結(jié)果圖3-11虎耳草多酚和VC對DPPH自由基清除作用比較根據(jù)實驗結(jié)果繪圖可知，VC具有極強的抗氧化能力，且抗氧化能力與VC質(zhì)量濃度呈線性關(guān)系，在質(zhì)量濃度為100μg/mL時dpph清除率就達到了70%，虎耳草多酚對dpph自由基的清除作用明顯低于VC但仍具有一定的抗氧化性，隨質(zhì)量濃度的升高而緩慢上升。3.7.2虎耳草多酚羥基自由基的清除結(jié)果圖3-12虎耳草多酚對羥基自由基清除作用和VC比較由實驗結(jié)果繪圖表明，虎耳草多酚和VC對羥基自由基的清除能力都很強，清除率與樣品的濃度呈正相關(guān)趨勢，虎耳草多酚濃度為0-100μg/mL時清除能力上升顯著大于100μg/mL時緩慢升高，所以虎耳草多酚具有一定的抗氧化能力。3.7.3對超氧自由基的清除結(jié)果圖3-13虎耳草多酚和VC對超氧自由基清除作用比較由實驗結(jié)果繪圖可知，虎耳草多酚對超氧自由基的清除率與質(zhì)量濃度幾乎呈線性趨勢，在質(zhì)量濃度約為220μg/mL時對超氧自由基的清除率高達100%，與對照品VC相比較，VC對超氧自由基具有很強的清除能力質(zhì)量濃度為100μg/mL時清除率接近100%，因此虎耳草多酚具有良好的清除超氧自由基作用。3.7.4對ABTS自由基的清除結(jié)果圖3-14虎耳草多酚和VC對ABTS自由基清除作用比較由實驗結(jié)果可知虎耳草多酚與VC對ABTS自由基的清除能力較強在一定濃度范圍內(nèi)清除率與樣品濃度呈線性關(guān)系，隨樣品濃度的升高而增強。

結(jié)論1、虎耳草多酚的閃氏提取實驗的料液比1:30、體積分數(shù)40%、提取電壓80V、提取時間90s時多酚的提取率為2.50%達到最大值。2、本實驗采用X-5型大孔吸附樹脂進行虎耳草多酚物質(zhì)的純化實驗得出X-5型大孔吸附樹脂的吸附率為75.80%解析率為88.65%。3、利用高效液相色譜法對虎耳草多酚純化樣品進行分析，測得其中多酚物質(zhì)為沒食子酸和槲皮素等。4、虎耳草多酚的抗氧化實驗表明虎耳草多酚物質(zhì)具有一定的抗氧化能力，尤其是對超氧自由基和ABTS自由基有較強的抗氧化性，對DPPH自由基清除能力有限。

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