DB51T 3006-2023 水稻對(duì)南方水稻黑條矮縮病抗性鑒定技術(shù)規(guī)程　

DB51I 2 4 6 本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定1水稻對(duì)南方水稻黑條矮縮病抗性鑒定技術(shù)規(guī)程本文件適用于水稻品種（資源）對(duì)南方水稻黑條矮縮病的抗NY/T2631南方水稻黑條矮縮病測(cè)報(bào)技術(shù)規(guī)范感病對(duì)照品種TN1susceptiblec無(wú)毒白背飛虱non-toxicwhite-back4試劑與設(shè)備2可調(diào)控溫光的養(yǎng)蟲(chóng)室，溫度保持于26℃±1℃范圍內(nèi)，相對(duì)濕度80%～90%，光照每天15.1.1鑒定病圃的選擇與設(shè)置5.1.2.1分行初步篩選將不同播期TN1秧苗充分混合移栽做保護(hù)行和誘發(fā)行，每行TN1單本移栽6株，保護(hù)行或誘發(fā)行之間預(yù)留10株參試品種空間。水稻參試品種按同樣規(guī)格單本移栽于TN1保護(hù)行或誘發(fā)行之間，各品種移栽35.1.2.2小區(qū)重復(fù)鑒定在常年第一代白背飛虱遷入或發(fā)生高峰前7d～10d播種感病對(duì)照品種TN1，每隔10d再播種一次，共播種時(shí)期較當(dāng)?shù)厣a(chǎn)常規(guī)播種期晚5d～10d。種子經(jīng)浸泡、催芽、育苗移栽方式種植。育秧方式為濕潤(rùn)育秧，苗床上感病對(duì)照品種TN1撒播，參試品種分行條播，苗床首尾及每10行參試品種間隔播種一行感灌溉水與常規(guī)管理一致。秧田期較常規(guī)管理增施尿素5kg/667m2。本田管理較常規(guī)肥水管理增施尿5.1.5.1蟲(chóng)量調(diào)查35.1.5.2帶毒率調(diào)查頭以上，從中隨機(jī)選取100頭，用RT-PCR檢測(cè)（參照本附錄A）小批量白背飛虱或Dot-ELISA（參照5.1.5.3有效傳毒蟲(chóng)量計(jì)算FVS=N×PVS………………（1）FVS——田間鑒定的有效傳毒蟲(chóng)量，單位為頭每公頃（頭/hm2N——白背飛虱蟲(chóng)量，單位為頭每公頃（頭/hm25.2.1.1拔節(jié)期調(diào)查5.2.1.2抽穗黃熟期調(diào)查5.2.2.1分蘗、拔節(jié)期癥狀5.2.2.2抽穗黃熟期癥狀基部可見(jiàn)縱向皺褶；在莖稈下部節(jié)間和節(jié)上可見(jiàn)蠟白色或黑褐色瘤狀突起。以黃熟期初期植株有1個(gè)以上不孕、不實(shí)（結(jié)實(shí)粒少于全穗1/3）分蘗癥狀為感病單株判4Rif=(nif+nd)/(ntf+nd)×100%…………（2）式中:Rif——抽穗黃熟期感病株率，單位為百分率（%ntf——抽穗黃熟期存活總株數(shù)，單位為株。式中:Rr——抽穗黃熟期相對(duì)發(fā)病率，單位為百分率（%Rif——抽穗黃熟期感病株率，單位為百分率（%）；Rsf——抽穗黃熟期感病對(duì)照的感病株率，單位為百分率（%選取飼喂白背飛虱的水稻種子用水浸種24h后，紗布覆蓋，恒溫箱32℃±2℃催芽24h～48h，選取發(fā)芽良好的種子25?！?0粒均勻播于盛有自然肥力土壤的內(nèi)徑80mm～110mm塑料杯中；大約6d～7d后，待苗長(zhǎng)至1.5葉期時(shí)，將待產(chǎn)的單頭白背飛虱移入杯中產(chǎn)卵，約3d后將成蟲(chóng)移出，單獨(dú)保存，7d～10d在重病區(qū)采集表現(xiàn)南方水稻黑條矮縮病疑似癥狀的水稻5采病株葉片按照NY/T2631附錄C的規(guī)定或參考附錄A進(jìn)行檢測(cè)，確認(rèn)感染南方水稻黑條矮縮病毒則將7.2的病株種于內(nèi)徑100mm～200mm大燒杯中,土面覆蓋濾紙,將適量1齡～2齡無(wú)毒白背飛虱移入其中,并用60目防蟲(chóng)網(wǎng)封口。飼毒2d后將蟲(chóng)移入內(nèi)徑80mm～110mm，預(yù)先育有白背飛虱喜食品種如TN1參試品種，含感病對(duì)照經(jīng)5.1.3方法浸種、催芽；選取30粒左右發(fā)芽良好的種子均勻播于盛有自然IVS=N×PVS………………（4）式中:N——接種白背飛虱數(shù)量，單位為頭。當(dāng)IVS值處于1～2頭/株范圍內(nèi)，方可認(rèn)為試殺，將秧苗移出塑料杯，至15℃~30℃條件下培育，常規(guī)管理，定期觀(guān)察植株發(fā)病情況。（按照NY/T2631附錄C的規(guī)定）或RT-PCR檢測(cè)確認(rèn)（參考附若出現(xiàn)感病對(duì)照的平均感病株率小于30則重復(fù)進(jìn)行試驗(yàn)。按6Rit=nit/ntt×100%…………（5）式中:Rit——苗期感病株率，單位為百分率（%nit——苗期感病株數(shù)，單位為株；7除特別說(shuō)明以外，本文件所用試劑均為分析純，所有試劑均用無(wú)RNA酶污染的容器，可用1A.1.1液氮：可保存于液氮罐或保溫桶中。A.1.7瓊脂糖。A.1.9冰乙酸。A.1.1150×TAE配方:Tris堿242g；冰乙酸57.1ml；EDTA（0.5mol/L）100ml，定容至1000ml。A.1.14Gelred核酸染色工作液（國(guó)產(chǎn)，購(gòu)于上海李記生物科技有限公司）參照使用說(shuō)明進(jìn)行。A.2儀器設(shè)備A.2.1稱(chēng)量天平：精度等級(jí)為0.0A.2.3冰箱（2℃~8℃和-20℃兩種）。A.2.4微量可調(diào)移液器（2μL、10μL、100μL、1000μL）及配套帶濾芯吸頭。A.3檢測(cè)引物正向引物SRB-S10-F5’-CCACATCGCGTCATCTCAAACTAC-3’反向引物SRB-S10-R5’-CGGTCTTACGCAACGATGAACC-3’A.4試驗(yàn)操作A.4.1采樣工具），8A.4.2樣品采集置于裝有液氮的保溫桶內(nèi)，盡快運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室4℃條件下保存待檢，存放不能超過(guò)7d。A.4.3樣品保存新鮮樣品若需長(zhǎng)期保存應(yīng)置于-70℃以下，避免反復(fù)凍融（凍融不超A.4.4樣品處理A.4.4.2按照0.1g樣品/1mLTRIzolreagent,加入適量TRIzolreagenA.4.4.3每1mLTRIzolreagent加入0.2mL氯仿，蓋好管蓋，充分震蕩15s，室溫靜置5min；A.4.4.512000r/min，4A.4.5檢測(cè)A.4.5.1擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備A.4.5.2循環(huán)條件設(shè)置將A4.5.1中離心后的PCR管放入PCR儀內(nèi)，記錄樣本9A.5結(jié)果判定A.5.1結(jié)果分析條件設(shè)定根據(jù)成像結(jié)果，凝膠中根據(jù)DNAMarker標(biāo)識(shí)在920bp的水平位置，如果陽(yáng)性對(duì)照和檢測(cè)樣品均具有0全株所有分蘗均能正常抽穗、結(jié)實(shí)，無(wú)明顯矮化分蘗，感全株1-2個(gè)分蘗明顯矮化，頂部有小穗結(jié)實(shí)，但結(jié)實(shí)率低南方水稻黑條矮縮病品種抗性調(diào)查記載表—分蘗拔節(jié)表C.1南方水稻黑條矮縮病品種抗性調(diào)查記………南方水稻黑條矮縮病品種抗性調(diào)查記載表—分蘗拔節(jié)表C.2南方水稻黑條矮縮病品種抗性調(diào)查記………