DB51T 3015-2023 牛5種病毒性腹瀉病的診斷和防治技術(shù)規(guī)程　

DB51TechnicalspecificatiI 2 2 3 4本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。1牛5種病毒性腹瀉病的診斷和防治技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了牛病毒性腹瀉黏膜病病毒、牛冠狀病毒、牛輪狀病毒、牛紐布病毒和牛諾如病毒共5種病毒引起的牛病毒性腹瀉病診斷依據(jù)和防本文件適用于上述5種腹瀉相關(guān)病毒的檢測，牛病GB/T18637-2018牛病毒性腹瀉粘膜病診斷技術(shù)規(guī)范NY/T541-2016獸醫(yī)診斷樣本采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范牛病毒性腹瀉黏膜病bovineviraldiarrheamuco牛病毒性腹瀉黏膜病是由牛病毒性腹瀉病毒（Bovineviraldiarrheavirus,BVDV）感染一種病毒性傳染病。BVDV可引起牛呼吸道綜合征、繁殖障礙性疾病、腹瀉/黏膜病、免疫抑制和持續(xù)性牛冠狀病毒病bovinecoronavi牛冠狀病毒病是由牛冠狀病毒（Bovinecoro牛輪狀病毒病是由牛輪狀病毒（Bovinerotavirus,BRV）引起的以嘔吐、腹瀉、脫水等為2牛諾如病毒病bovinenorovi牛諾如病毒病是由牛諾如病毒（Bovinenorovirus,BNoV）引起的一種犢牛腹瀉性疾病。NoV屬于杯狀病毒科，諾如病毒屬，是單鏈的RNA病毒，基因組全長7.3kb～7.5kb。根據(jù)其基因組特征，可將NoV分為6個(gè)基因型，感染牛的主要為基因型GШ。4.2.1樣本采集與處理按照《NY/T541-2016獸醫(yī)診斷樣本采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范》采集肛門棉拭子5g～1RNA保存液，-20℃及以下保存運(yùn)輸不超過48h，立即提取并反轉(zhuǎn)錄合成cD4.2.2樣本檢測依據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)附錄A中提供的牛病毒性腹瀉粘膜病病毒、牛冠狀病毒、牛輪狀病毒、牛紐布病毒和牛諾如病毒熒光定量PCR或恒溫隔絕式熒光PCR(iiP4.3診斷結(jié)果判定4.3.1可疑4.3.2確診5.2消毒放牛進(jìn)入前用清水沖洗飼槽和牛床，待干燥后牛方可進(jìn)入。運(yùn)動(dòng)場地清除糞便和雜草后，用5%～10%的35.3加強(qiáng)飼養(yǎng)管理5.4.1.1補(bǔ)液5.4.1.3止瀉5.4.1.4防止細(xì)菌繼發(fā)感染5.5疫苗緊急免疫患病牛及其產(chǎn)品按照農(nóng)業(yè)部關(guān)于“病死及病害動(dòng)物無害化處理技術(shù)規(guī)范（農(nóng)醫(yī)發(fā)〔2014NeV-F：5'-CAGCCCGTCTGGGTGAAT-3'；NeV-R：5'-CTGGATRGTTCTGACTTCGG-3'；BNoV-F：5'-CCTYCACGGCGAGAAGTT-BNoV-R：5'-CGGWGCGATGGTACAAARAT-BCoV-F：5'-AGTAGTGTCAGTGCTAAC-BCoV-R：5'-CAAGTGCCTGTAGGTATA-BCoV-Probe：5'-FAM-ACAACTTCCATCCCGCCAAA-TAMRABVDV1-F：5'-AAGCCTCGAGATGCCACG-3'；BVDV1-R：5'-GCAGCACCCTATCAGGCTGT-BVDV1-Probe：5'-FAM-CCCACAGCACATCTTAA-MGBBRV-F：GCTAACCACTTGGTATBRV-R：GCCATCTGAGTGATTACTCBRV-Probe：FAM-TACGTATTCGCTACACAGAGTAATCA-BA.2.1NeV染料法熒光定量PCRA.2.1.1反應(yīng)體系及條件反應(yīng)體系：TBGreenPremixExTaqII10μL，上、下游引物各1.0μL，cDNA模板1.5μL，用A.2.1.2結(jié)果判定A.2.1.2.1閾值設(shè)定A.2.1.2.2質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)陰性對照無Ct值，且無典型擴(kuò)增曲線；或陰性對照Ct值>35.0，A.2.1.2.3結(jié)果描述及判定5陰陽性對照成立的前提下，樣品檢測無Ct值，且無典型的擴(kuò)擴(kuò)增曲線，但熔解曲線于88℃左右未出現(xiàn)明顯的Ct值≤35.0，出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，熔解曲線于88℃左右出現(xiàn)明顯的峰值，表A.2.2BNoV染料法熒光定量PCRA.2.2.1反應(yīng)體系及條件）：A.2.2.2結(jié)果判定A.2.2.2.1閾值設(shè)定A.2.2.2.2質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)陰性對照無Ct值，且無典型擴(kuò)增曲線；或陰性對照Ct值>35.0，陽性對照Ct值<30.0，并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，熔解曲線于88A.2.2.2.3結(jié)果描述及判定陰陽性對照成立的前提下，樣品檢測無Ct值，且無典型的擴(kuò)擴(kuò)增曲線，但熔解曲線于88℃左右未出現(xiàn)明顯的Ct值≤35.0，出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，熔解曲線于88℃左右出現(xiàn)明顯的峰值，表A.2.3BCoV探針法熒光定量PCRA.2.3.1反應(yīng)體系及條件PCR反應(yīng)體系：ProbeqPCRPremixExTaq10μL，探針0.4μL（10μmol/L上下游引物各0.8μL（10μmol/L），cDNA模板2μL，DEPCH2O補(bǔ)足到20μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃min；95℃15s，54℃20s），6A.2.3.2結(jié)果判定A.2.3.2.1閾值設(shè)定A.2.3.2.2質(zhì)量控制陰性對照和陽性對照結(jié)果要求在同一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)滿足A.2.3.2.3結(jié)果描述及判定被檢樣本檢測結(jié)果中FAM通道Ct值≤35，TAMRA通道≤35，且擴(kuò)增曲線均為典型的S曲線，報(bào)告為線均為典型的S曲線，報(bào)告為BCoV核酸陽性。被檢樣本檢測結(jié)果中FAM和TAMRA通道均無Ct值或無典型的S型擴(kuò)增曲線，報(bào)告為BCoVA.2.4.1反應(yīng)體系及條件反應(yīng)體系：Taq酶1μL，預(yù)混Buffer25μL，引物上下游各A.2.4.2結(jié)果判定A.2.4.2.1質(zhì)量控制陰性對照和陽性對照結(jié)果要求在同一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)滿足A.2.4.2.2結(jié)果判定被檢樣本檢測結(jié)果中，iiPCR儀顯示為“+”者判定為陽A.2.5.1反應(yīng)體系及條件反應(yīng)體系：Taq酶1μL，預(yù)混Buffer25μL，引物