T-QGCML 3888-2024 熟大米蠟樣芽孢桿菌檢驗規(guī)范

ICS07.100.30CCSC53SpecificationforthetestofBacilluscereusincookedriceIT/QGCML3888—2024前言 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語和定義 4設(shè)備和材料 5培養(yǎng)基及試劑 6檢驗方法 27操作步驟 28結(jié)果報告 4T/QGCML3888—2024本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由運城市市場監(jiān)管綜合行政執(zhí)法隊提出。本文件由全國城市工業(yè)品貿(mào)易中心聯(lián)合會歸口。本文件起草單位：運城市市場監(jiān)管綜合行政執(zhí)法隊、運城市綜合檢驗檢測中心、山西大學(xué)、玖零零幺質(zhì)量研究院（山西）有限公司。本文件主要起草人：竇夢璇、曹本男、韓珍珍、王彬、師娟、王彪、張錦華、李宣英。1T/QGCML3888—2024熟大米蠟樣芽孢桿菌檢驗規(guī)范本文件規(guī)定了熟大米蠟樣芽孢桿菌檢驗的術(shù)語和定義、設(shè)備和材料、培養(yǎng)基和試劑、檢驗方法、操作步驟和結(jié)果報告。本文件適用于熟大米蠟樣芽孢桿菌的檢驗。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB4789.14—2014食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗蠟樣芽孢桿菌檢驗3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4設(shè)備和材料除生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：a)顯微鏡帶照相系統(tǒng)，10倍～100倍（油鏡）；b)濁度儀；c)全自動微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)；d)生物安全柜；e)生化培養(yǎng)箱；f)蠟樣芽孢桿菌（ATCC11778或其他等效標(biāo)準(zhǔn)菌株）；g)蘇云金芽孢桿菌（ATCC10792或其他等效標(biāo)準(zhǔn)菌株）；h)蕈狀芽孢桿菌（CICC21473或其他等效標(biāo)準(zhǔn)菌株）；i)巨大芽桿菌（ATCC14581或其他等效標(biāo)準(zhǔn)菌株）；j)大腸埃希氏菌（CMCCB44102或其他等效標(biāo)準(zhǔn)菌株）。5培養(yǎng)基及試劑檢驗中使用的培養(yǎng)基及試劑如下：a)甘露醇卵黃多粘菌素（MYP）瓊脂；b)動力培養(yǎng)基；c)硫酸錳營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基；d)胰酪胨大豆羊血（TSSB）瓊脂；e)溶菌酶營養(yǎng)肉湯；f)生化鑒定試劑盒；g)革蘭氏染色液；2T/QGCML3888—2024h)BCL鑒定卡。6檢驗方法6.1按GB4789.14—2014的規(guī)定對樣品進行蠟樣芽孢桿菌檢驗。對檢出蠟樣芽孢桿菌的樣品取n=5進行檢驗，依次編號為01～05，共5組，每組做兩個平行，步驟依次為增菌、分離、鑒定和計數(shù)。6.2檢測前應(yīng)對實驗室的環(huán)境、關(guān)鍵培養(yǎng)基、菌種進行驗證，確保實驗準(zhǔn)確。7操作步驟7.1樣品處理冷凍樣品應(yīng)在45℃以下不超過15min或在（2～5）℃不超過18h解凍，若不能及時檢驗，應(yīng)放于-10℃~-20℃保存。非冷凍且易腐的樣品應(yīng)及時檢驗，若不能及時檢驗，應(yīng)置于（2～5）℃冰箱保存，24h內(nèi)檢驗。7.2樣品制備稱取樣品25g，放入盛有225mLPBS或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，用旋轉(zhuǎn)刀片式均質(zhì)器以8000r/min～10000r/min均質(zhì)1min～2min，或放入盛有225mLPBS或生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min～2min。若樣品為液態(tài)，吸取25mL樣品至盛有225mLPBS或生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內(nèi)可預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠）中，振蕩混勻，作為1:10的樣品勻液。7.3樣品的稀釋吸取7.2中1:10的樣品液1mL加到裝有9mLPBS或生理鹽水的稀釋管中充分混制成1:100的樣品勻液。根據(jù)對樣品污染狀況的估計，按上述操作，依次制成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次，應(yīng)換用1支1mL無菌吸管或吸頭。7.4樣品接種根據(jù)對樣品污染狀況的估計，選擇2個～3個適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液以0.3mL、0.3mL、0.4mL接種量分別移入三塊MYP瓊脂平板，用無菌L棒涂布整個平板，涂布時應(yīng)注意不觸及平板邊緣。使用前，如MYP瓊脂平板表面有水珠，可放在25℃~50℃的培養(yǎng)箱里干燥，直到平板表面的水珠消失。7.5分離在通常情況下，涂布后，將平板靜置10min。如樣液不易吸收，可將平板放在培養(yǎng)箱（30±1）℃培養(yǎng)1h，等樣品勻液吸收后翻轉(zhuǎn)平皿，倒置于培養(yǎng)箱30±1）℃培養(yǎng)（24±2）h。如果菌落不典型，可繼續(xù)培養(yǎng)（24±2）h再觀察。在MYP瓊脂平板上，典型菌落為微粉紅色（表示不發(fā)酵甘露醇周圍有白色至淡粉紅色沉淀環(huán)（表示產(chǎn)卵磷脂酶）。7.6純培養(yǎng)從每個平板中挑取至少5個典型落（小于5個全選），分別劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板做純培養(yǎng)，（30±1）℃培養(yǎng)（24±2）h，進行確證試驗。在營養(yǎng)瓊脂平板上，典型菌落為灰白色，偶有黃綠色，不透明，表面粗糙似毛玻璃狀或融蠟狀，邊緣常呈擴展?fàn)睿睆綖?mm～10mm。7.7鑒定3T/QGCML3888—2024分別挑取純培養(yǎng)的單個菌落，用生化鑒定試劑盒對可疑菌落進行生化鑒定，符合GB4789.14一2014中蠟樣芽孢桿菌的生化特征，同時用全自動微生物鑒定系統(tǒng)鑒定可疑菌株，兩者結(jié)果均為蠟樣芽孢桿菌，判定為蠟樣芽孢桿菌。7.8計算7.8.1典型菌落計數(shù)和確認7.8.1.1選擇有典型蠟樣孢桿菌菌落的平板，且同一稀釋度3個平板所有菌落數(shù)合計在20CFU~200CFU之間的平板，計數(shù)典型菌落數(shù)。如果出現(xiàn)a)～f）現(xiàn)象按公式（1）計算，如果出現(xiàn)g）現(xiàn)象則按公式（2）計算：a)只有一個稀釋度的平板菌落數(shù)在20CFU～200CFU之間且有典型菌落，計數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落；b)2個連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)均在20CFU～200CFU之間，但只有一個稀釋度的平板有典型菌落，應(yīng)計數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落；c)所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于20CFU且有典型菌落，應(yīng)計數(shù)最低稀釋度平板上的典型菌d)某一稀釋度的平板菌落數(shù)大于200CFU且有典型菌落，但下一稀釋度平板上沒有典型菌落，應(yīng)計數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落；e)所有稀釋度的平板菌落數(shù)均大于200CFU且有典型菌落，應(yīng)計數(shù)最高稀釋度平板上的典型菌f)所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在20CFU～200CFU之間且有典型菌落，其中一部分小于20CFU或大于200CFU時，應(yīng)計數(shù)最接近20CFU或200CFU的稀釋度平板上的典型菌落；g)2個連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)均在20CFU～200CFU之間且均有典型菌落。7.8.1.2從每個平板中至少挑取5個典型菌落（小于5個全選），劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板做純培養(yǎng)30±1）℃培養(yǎng)（24±2）h。7.8.2樣品中蠟樣芽孢桿菌菌落數(shù)計算公式7.8.2.1公式（1）：式中：T——樣品中蠟樣芽孢桿菌菌落數(shù)；A——某一稀釋度蠟樣芽孢桿菌典型菌落的總數(shù)；B——鑒定結(jié)果為蠟樣芽孢桿菌的菌落數(shù)；C——用于蠟樣芽孢桿菌鑒定的菌落數(shù)；d——稀釋因子。7.8.2.2公式（2）：式中：T——樣品中蠟樣芽孢桿菌菌落數(shù)；A1——第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）蠟樣芽孢桿菌典型菌落的總數(shù)；B1——第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）鑒定結(jié)果為蠟樣芽孢桿菌的菌落數(shù)；C1——第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）用于蠟樣芽孢桿菌鑒定的菌落數(shù)；A2——第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）蠟樣芽孢桿菌典型菌落的總數(shù)；4T/QGCML3888—2024B2——第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）鑒定結(jié)果為蠟樣芽孢桿菌的菌落數(shù)；C2——第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）用于蠟樣芽孢桿菌鑒定的菌落數(shù)；1.1——計算系