T-HBIQA 0009-2024 人體血液中7種多激酶類藥物含量的測定 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

ICS01.040.11CCSC10/29T/HBIQA人體血液中7種多激酶類藥物含量的測定DeterminationofsevenpolykinasesinhumanbloodbyHPLC-MS/MS2024-08-15發(fā)布河北省檢驗(yàn)檢疫學(xué)會發(fā)布T/HBIQA0009—2024本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由河北省檢驗(yàn)檢疫學(xué)會提出并歸口。本文件起草單位：河北省藥品醫(yī)療器械檢驗(yàn)研究院、河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院。本文件主要起草人：李揮、梁艷、宋莉、李怡霖、劉亞楠。5T/HBIQA0009—2024人體血液中7種多激酶類藥物含量的測定高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法本文件規(guī)定了人體血液中7種多激酶類藥物含量的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。本文件適用于人體血液中索拉菲尼、阿西替尼、埃羅替尼、西地尼布、布立尼布、利尼伐尼、戈伐替尼含量的測定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法。3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4原理樣品經(jīng)甲醇提取、無水硫酸鎂鹽析、N-丙基乙二胺（PSA）凈化后，渦旋混勻、冷凍離心、氮吹復(fù)溶，進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定，內(nèi)標(biāo)法定量。5試劑和材料5.1試劑和材料除另有規(guī)定外，試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級水。5.1.1甲醇：色譜純。5.1.2甲酸：色譜純。5.1.3無水硫酸鎂。5.1.4N-丙基乙二胺（PSA）。6T/HBIQA0009—20245.1.5標(biāo)準(zhǔn)品：索拉菲尼（CAS號：475207-59-1），阿西替尼（CAS號：319460-85-0），埃羅替尼（CAS號：183321-74-6西地尼布（CAS號：288383-20-0布立尼布（CAS的純度均大于等于98%。5.1.6混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液的配制：分別稱取布立尼布、利尼伐尼、索拉菲尼、阿西替尼、戈伐替尼、埃羅替尼、西地尼布1mg（精確到0.01mg），置10mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，分別配制成布立尼布、利尼伐尼、索拉菲尼、阿西替尼、戈伐替尼、埃羅替尼、西地尼布的儲備溶液，于-20℃保存至分析。5.1.7內(nèi)標(biāo)儲備液的配制：稱取1mg（精確到0.01mg）多韋替尼，置10mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得到0.1mg/mL的內(nèi)標(biāo)儲備液，于-20℃保存至分析。5.1.8標(biāo)準(zhǔn)中間溶液的配制：取500μL標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（5.1.6）至50mL量瓶中，加甲醇稀釋，渦旋混勻，得到1μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，于-20℃保存?zhèn)溆谩?.1.90.1%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸水溶液：準(zhǔn)確移取甲酸1.0mL置于1L量瓶中，用水定容至刻度，混勻。6儀器設(shè)備6.1液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：配備電噴霧離子源（ESI）。6.2氮吹濃縮儀。6.3渦旋振蕩器。6.4電子分析天平（精度0.01mg)。6.5高速冷凍離心機(jī)（最高轉(zhuǎn)速22000rpm）。7試樣制備全部血液樣本充分混勻后，在4℃、3000r/min條件下離心10min，取管內(nèi)上清液分裝，-80℃儲存待測。8試驗(yàn)步驟8.1試樣預(yù)處理取200μL血液試樣（7）于5mL離心管中，準(zhǔn)確加入1.0mL甲醇、250mg無水MgSO4、7T/HBIQA0009—202435mgPSA進(jìn)行鹽析和凈化，渦旋混勻30s后，經(jīng)12000r/min，4℃冷凍離心10min。上清液全部取出，氮吹濃縮至干，用300μL含有內(nèi)標(biāo)的甲醇復(fù)溶，渦旋混勻30s，過0.22μm微孔濾膜，待測定。8.2標(biāo)準(zhǔn)曲線取相應(yīng)的空白樣品，按照7步驟進(jìn)行處理，用得到的空白樣品提取液，將混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液逐級稀釋，得到布立尼布、利尼伐尼、索拉菲尼、阿西替尼、戈伐替尼濃度為5、10、25、50、100、250、400和500ng/mL，埃羅替尼、西地尼布濃度為10、20、50、100、200、500、800、和1000ng/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（內(nèi)標(biāo)多韋替尼的濃度為100ng/mL），濃度由低到高進(jìn)行檢測，以分析物與內(nèi)標(biāo)定量離子的峰面積比值對質(zhì)量濃度作圖，做出內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。8.3儀器參考條件8.3.1液相色譜參考條件a.色譜柱：ZorbaxRRHDStablebondAq（50×2.1mm，1.8μm），或相當(dāng)者。b.流動相：A相為0.1%甲酸溶液；B相甲醇。c.柱溫：40℃。d.進(jìn)樣體積：5μL。e.流速：0.3mL/min。梯度洗脫程序見表1：表1梯度洗脫程序表時間/min流動相A/%流動相B/50307030570308.3.2質(zhì)譜參考條件a.電離方式：電噴霧電離，正離子模式。b.電噴霧電壓：3500V。c.鞘氣流速；50Arb。d.輔助氣流速：10Arb。8T/HBIQA0009—2024e.離子傳輸溫度：325℃。f..霧化溫度：350℃。e.碰撞氣：氬氣。其他質(zhì)譜條件見附錄A。8.4測定8.4.1測定步驟將試樣溶液注入液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中，得到7種多激酶抑制劑的質(zhì)譜響應(yīng)值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測液中7種多激酶抑制劑的濃度。樣品溶液中各組分的響應(yīng)值應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)，超過線性范圍則應(yīng)稀釋后再進(jìn)樣測定（內(nèi)標(biāo)物根據(jù)測定結(jié)果，添加與稀釋倍數(shù)相同倍數(shù)的內(nèi)標(biāo)量，開展前處理實(shí)驗(yàn)，稀釋后再進(jìn)樣分析）。8.4.2定性判定在相同條件測定樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液，如果樣品溶液中檢出的色譜峰的保留時間與標(biāo)準(zhǔn)溶液中的某種組分峰的保留時間一致（變化范圍在±2.5%），并且所選擇的兩對子離子的質(zhì)荷比一致，樣品溶液中定性離子相對豐度與濃度相當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中定性離子的相對豐度進(jìn)行比較時，相對偏差不超過表2規(guī)定的范圍，則可判斷樣品中存在該組分。7種多激酶抑制劑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的色譜圖參見附錄B。表2定性確定時相對離子豐度的最大允許偏差相對離子豐度>50%>20%~50%>10%~20%≤10%允許的相對偏差±20%±25%±30%±50%8.4.3數(shù)據(jù)計(jì)算血液樣本中各藥物濃度含量為：式中:Xi——試樣中待測組分含量，單位為納克每毫升(ng/mL)；ρi——由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的測試液中某種組分的質(zhì)量濃度，單位為納克每毫升(ng/mL)；V定容——定容體積，單位為毫升(mL)；9T/HBIQA0009—2024K——稀釋倍數(shù)；V試樣——試樣體積，單位為毫升(mL)。計(jì)算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。8.5空白試驗(yàn)取空白血樣，按8.1-8.4測定步驟進(jìn)行。8.6定量限和重復(fù)性8.6.1定量限本方法索拉菲尼、布立尼布、利尼伐尼、阿西替尼、戈伐替尼的定量限為5ng/mL，西地尼布、埃羅替尼的定量限為10ng/mL。8.6.2重復(fù)性在重復(fù)性實(shí)驗(yàn)條件下獲得兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果的絕對差值不得超過算數(shù)平均值的15%。T/HBIQA0009—2024（資料性附錄）質(zhì)譜參數(shù)表A.1目標(biāo)物的質(zhì)譜參數(shù)和參考保留時間名稱母離子(m/z)子離子(m/z)碎裂電壓(V)碰撞電壓(V)保留時間(min)索拉菲尼465.1252.0a/270.013633/241.50阿西替尼387.1220.9a/355.97751/20多韋替尼393.1334.0a/336.08627/29埃羅替尼394.1278.0a/336.010131/24西地尼布451.284.0a/112.07345/24布立尼布371.2