T-HBIQA 0008-2024 人體血液中卡瑞利珠藥物含量的測定 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

ICS01.040.11CCSC10/29T/HBIQADeterminationofcamrelizumabinhumanbloodbyHPLC-MS/MS2024-08-15發(fā)布河北省檢驗檢疫學(xué)會發(fā)布T/HBIQA0008—2024本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由河北省檢驗檢疫學(xué)會提出并歸口。本文件起草單位：河北省藥品醫(yī)療器械檢驗研究院、河北大學(xué)。本文件主要起草人：李揮、宋莉、李怡霖、梁艷、劉亞楠。1T/HBIQA0008—2024人體血液中卡瑞利珠藥物含量的測定高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法本文件規(guī)定了人體血液中卡瑞利珠藥物含量的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。本文件適用于人體血液中卡瑞利珠藥物含量的測定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法。3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4原理樣品經(jīng)甲醇沉淀后用100mM的碳酸氫銨溶液復(fù)溶，加入100mMDTT和200mMIAM后酶解過夜，進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定，外標(biāo)法定量。5試劑和材料5.1試劑和材料除另有規(guī)定外，試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級水。5.1.2乙腈：色譜純。5.1.3甲酸：色譜純。5.1.4100mM碳酸氫銨溶液：取158.1mg碳酸氫銨（精確到0.01mg）溶于20mL量瓶中，用水定容至刻度。2T/HBIQA0008—20245.1.5100mMDTT溶液：取DTT（MW154.3）154mg（精確到0.01mg）于10mL量瓶中，用100mM的碳酸氫銨溶液（5.1.4）定容至刻度。5.1.6200mMIAM溶液：取IAM（MW185.0）370mg（精確到0.01mg）于10mL量瓶中，用100mM的碳酸氫銨溶液（5.1.4）定容至刻度。5.1.71mg/mL胰酶溶液。5.1.8標(biāo)準(zhǔn)品：卡瑞利珠的純度大于等于98%（CAS號：1798286-48-2）。5.1.9標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液的配制：取卡瑞利珠1mg（精確到0.01mg）于1.5mL離心管中，加入500μL100mM碳酸氫銨溶液（5.1.4），配制成卡瑞利珠的儲備溶液，于-20℃保存至分析。5.1.100.1%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸水溶液：準(zhǔn)確移取甲酸1.0mL置于1L量瓶中，用水定容至刻度，混6儀器設(shè)備6.1液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：配備電噴霧離子源（ESI）。6.2恒溫水浴鍋。6.3渦旋振蕩器。6.4電子分析天平（精度0.01mg）。6.5高速冷凍離心機(jī)（最高轉(zhuǎn)速22000rpm）。7試樣制備全部血液樣本充分混勻后，在4℃、3000r/min條件下離心10min，取管內(nèi)上清液分裝，-80℃儲存待測。8試驗步驟8.1試樣預(yù)處理取100μL血液試樣（7）于1.5mL離心管中，準(zhǔn)確加入100μL甲醇沉淀血液中在17000r/min，4℃的條件下冷凍離心20min，棄去上清液后加入200μL100mM碳酸氫銨溶液（5.1.4）復(fù)溶；加100mMDTT溶液（5.1.5）適量，使終濃度為5mM，在56℃下孵育30min；室溫冷卻后加200mMIAM溶液（5.1.6）適量，使終濃度為10mM，避光靜置15min。最后加入4μL胰酶溶液，在37℃3T/HBIQA0008—2024下孵育過夜12h后加入1μL甲酸終止酶解反應(yīng)，經(jīng)17000r/min，4℃冷凍離心20min，將100μL上清轉(zhuǎn)移至潔凈干燥的液相小瓶，進(jìn)機(jī)分析。8.2標(biāo)準(zhǔn)曲線取相應(yīng)的空白樣品，按照7步驟進(jìn)行處理，用得到的空白樣品提取液，將標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液逐級稀釋以制備一系列濃度為4、10、15、20、40、80、100和160μg/mL的卡瑞利珠藥物。得到的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，濃度由低到高進(jìn)行檢測，以定量離子峰面積對質(zhì)量濃度作圖，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。8.3儀器參考條件8.3.1液相色譜參考條件a.色譜柱：AgilentPoroshell120EC-C18（2.1×100mm，1.9μm），或相當(dāng)者。b.流動相：A相為0.1%甲酸水溶液；B相為乙腈。c.柱溫：40℃。d.進(jìn)樣體積：5μL。e.流速：0.3mL/min。梯度洗脫程序見表1：表1梯度程序洗脫表時間/min流動相A/%流動相B/%1955755459257590909559558.3.2質(zhì)譜參考條件a.電離方式：電噴霧電離，正離子掃描模式。b.電噴霧電壓：5500V。c.離子源溫度：500℃。d.霧化氣：60psi。e.輔助氣：60psi。4T/HBIQA0008—2024f.氣簾氣：30psi。其他質(zhì)譜條件見附錄A。8.4測定8.4.1測定步驟將試樣溶液注入液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中，得到卡瑞利珠的質(zhì)譜響應(yīng)值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測液中卡瑞利珠藥物的濃度。樣品溶液中各組分的響應(yīng)值應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)，超過線性范圍則應(yīng)稀釋后再進(jìn)樣測定。8.4.2定性判定在相同條件測定樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液，如果樣品溶液中檢出的色譜峰的保留時間與標(biāo)準(zhǔn)溶液中的某種組分峰的保留時間一致（變化范圍在±2.5%），并且所選擇的兩對子離子的質(zhì)荷比一致，樣品溶液中定性離子相對豐度與濃度相當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中定性離子的相對豐度進(jìn)行比較時，相對偏差不超過表2規(guī)定的范圍，則可判斷樣品中存在該組分?？ㄈ鹄闃?biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的色譜圖參見附錄B。表2定性確定時相對離子豐度的最大允許偏差相對離子豐度>50%>20%~50%>10%~20%≤10%允許的相對偏差±20%±25%±30%±50%8.4.3數(shù)據(jù)計算血液樣本中藥物濃度含量為：式中:Xi——試樣中待測組分含量，單位為微克每升(μg/mL)；ρi——由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的測試液中某種組分的質(zhì)量濃度，單位為微克每升(μg/L)；V定容——定容體積，單位為毫升(mL)；K——稀釋倍數(shù)；V試樣——試樣體積，單位為毫升(mL)。5T/HBIQA0008—2024計算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。8.5空白試驗取空白血樣，均按8.1-8.4測定步驟進(jìn)行。8.6定量限和重復(fù)性本方法卡瑞利珠的定量限為4μg/mL。8.6.2重復(fù)性在重復(fù)性實驗條件下獲得兩次獨(dú)立實驗結(jié)果的絕對差值不得超過算數(shù)平均值的15%。6T/HBIQA0008—2024（資料性附錄