分子生物學研究法-上-DNA、RNA及蛋白質(zhì)課件

5分子生物學研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)5分子生物學研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)5分子生物學研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)基因操作主要包括DNA分子的切割與連接、細胞轉(zhuǎn)化、核酸序列分析以及基因人工合成、表達、定點突變和PCR擴增等，是分子生物學研究的核心技術(shù)?；蚬こ淌侵冈隗w外將核酸分子插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，使之進入原先沒有這類分子的寄主細胞內(nèi)并進行持續(xù)穩(wěn)定的繁殖和表達。基因工程技術(shù)是核酸操作技術(shù)的一部分，只不過它強調(diào)了外源核酸分子在另一種不同的寄主細胞中的繁衍與性狀表達。事實上，這種跨越物種屏障、把來自其它生物的基因置于新的寄主生物細胞之中的能力，是基因工程技術(shù)區(qū)別于其它生命科學技術(shù)的根本特征。5分子生物學研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)5.1基因操作的基本工具（一）限制性核酸內(nèi)切酶能夠識別DNA上的特定堿基序列并從這個位點切開DNA分子。第一個核酸內(nèi)切酶EcoRI是Boyer實驗室在1972年發(fā)現(xiàn)的，它能特異性識別GAATTC序列，將雙鏈DNA分子在這個位點切開并產(chǎn)生具有粘性末端的小片段。5分子生物學研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)5分子生物學研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)5分子生物學研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)5分子生物學研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)重組DNA實驗中常見的主要工具酶5分子生物學研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)（二）基因克隆的載體載體三要素：自我復制能力攜帶外源基因片段大小插入位點多少大腸桿菌質(zhì)粒載體：1、pSC101質(zhì)粒載體長9.09kb，帶有四環(huán)素抗性基因（tetr）及EcoRI、HindIII、BamHI、SalI、XhoI、PvuII以及SmaI等7種限制性核酸內(nèi)切酶的單酶切位點，在HindIII、BamHI和SalI等3個位點插入外源基因，會導致tetr失活。是第一個真核基因克隆載體。缺點：它是一種嚴緊型復制控制的低拷貝質(zhì)粒，平均每個寄主細胞僅有1~2個拷貝，從帶有該質(zhì)粒的寄主細胞中提取pSC101DNA，產(chǎn)量很低。5分子生物學研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)2、ColE1質(zhì)粒載體松弛型復制控制的多拷貝質(zhì)粒。一般情況下，當培養(yǎng)基中氨基酸被耗盡，或是在細胞培養(yǎng)物中加入氯霉素以抑制蛋白質(zhì)的合成，寄主染色體DNA的復制便被抑制，細胞的生長也隨之停止。松弛型質(zhì)粒DNA卻繼續(xù)復制數(shù)小時，使每個寄主細胞中ColE1質(zhì)粒的拷貝數(shù)達到1000~3000個，占細胞總DNA的50%左右。ColE1質(zhì)粒DNA復制起始部位調(diào)控因子之間關(guān)系前體RNA(RNAII)的轉(zhuǎn)錄起始于復制起點上游，需經(jīng)RNaseH加工后產(chǎn)生有555個核苷酸的引物，起始DNA合成。RNAI在RNAII的5’末端，轉(zhuǎn)錄方向相反，因此能通過氫鍵配對與后者相互作用，阻止RNaseH加工RNAII，使其不能轉(zhuǎn)化為有活性的引物，阻礙復制起始。沒有Rop蛋白，RNAI基因就不能起始轉(zhuǎn)錄。5分子生物學研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)3、pBR322質(zhì)粒載體由三個不同來源的部分組成的：第一部分來源于pSF2124質(zhì)粒易位子Tn3的氨芐青霉素抗性基因（AmpR）；第二部分來源于pSC101質(zhì)粒的四環(huán)素抗性基因（tetr）；第三部分則來源于ColE1的派生質(zhì)粒pMB1的DNA復制起點（ori）。優(yōu)點是具有較小的分子量(4363bp)，易于純化。即使攜帶了6-8kb的外源DNA片段，操作仍較便利。有兩種抗生素抗性基因作為轉(zhuǎn)化子的選擇標記。有較高的拷貝數(shù)，經(jīng)過氯霉素擴增，每個細胞可累積1000~3000個拷貝，便于制備重組體DNA。5分子生物學研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)4、pUC質(zhì)粒載體（包括四個部分）：來自pBR322質(zhì)粒的復制起點（ori）氨芐青霉素抗性基因（ampr）大腸桿菌β-半乳糖酶基因（lacZ）啟動子及編碼α-肽鏈的DNA序列。特稱為lacZ’基因位于lacZ’基因5’-端的一段多克隆位點（MCS），外源基因插入破壞lacZ’基因功能優(yōu)點：更小的分子量和更高的拷貝數(shù)。在pBR322基礎(chǔ)上構(gòu)建pUC質(zhì)粒載體時，僅保留下其中的氨芐青霉素抗性基因及復制起點，其分子小了許多，pUC8為2750bp，pUC18為2686bp。由于缺失rop基因，pUC質(zhì)粒不經(jīng)氯霉素擴增時，平均每個細胞即可達500~700個拷貝。5分子生物學研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)5分子生物學研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)LacZ編碼β-半乳糖苷酶氨基端146個氨基酸的α-肽，IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）誘導該基因表達，所合成的β-半乳糖苷酶α-肽與宿主細胞編碼的缺陷型β-半乳糖苷酶互補，產(chǎn)生有活性的β-半乳糖苷酶，水解培養(yǎng)基中的X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷），生成藍色的溴氯吲哚。含X-gal培養(yǎng)基中非轉(zhuǎn)化菌落呈藍色，含有重組DNA分子的菌落為白色。pUC8質(zhì)粒結(jié)構(gòu)中具有來自大腸桿菌lac操縱子的lacZ’基因，所編碼的α-肽鏈可參與α-互補作用。因此，可用X-gal顯色法實現(xiàn)對重組體轉(zhuǎn)化子的鑒定。具有多克隆位點MCS區(qū)段，可以把具兩種不同粘性末端（如EcoRI和BamHI）的外源DNA片段直接克隆到pUC8質(zhì)粒載體上。5分子生物學研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)5、pGEM-3Z質(zhì)粒長度為2743bp，編碼有一個氨芐青霉素抗性基因和一個lacZ'基因。含有兩個噬菌體啟動子(T7和SP6)，為RNA聚合酶的附著提供了特異性識別位點。加入T7或SP6RNA聚合酶，所克隆的外源基因便會轉(zhuǎn)錄出相應的mRNA。6、穿梭質(zhì)粒載體（shuttleplasmidvector）由人工構(gòu)建的具有兩種不同復制起點和選擇記號，可在兩種不同的寄主細胞中存活和復制的質(zhì)粒載體。這類質(zhì)粒載體可保證外源DNA序列在不同物種(原核和真核)的細胞間得到擴增，用途廣泛。5分子生物學研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)7、pBluescript噬菌粒載體pBluescript是一類從pUC載體派生而來的噬菌粒載體，簡稱為pBS（+/-），如今則更多地叫作pBluescriptKS（+/-）或pBluescriptSK（+/-）。SK表示多克隆位點區(qū)的取向，即lacZ基因是按照SacI→KpnI的方向轉(zhuǎn)錄；（+/-）表示單鏈噬菌體f1復制起點的兩種相反的取向。f1（+）起點表示當pBluescript噬菌粒載體和輔助噬菌體共感染寄主細胞時，能夠回收到lacZ基因的有意義鏈DNA；而f1（-）起點則表示當pBluesript噬菌粒載體與輔助噬菌體共感染寄主細胞時，可回收到lacZ基因的無意義鏈DNA。5分子生物學研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)(i)在多克隆位點區(qū)（MCS）的兩側(cè)，存在一對T3和T7噬菌體的啟動子，用以定向指導插入在多克隆位點上的外源基因的轉(zhuǎn)錄活動；(ii)具有單鏈噬菌體M13或f1的復制起點和一個來自ColE1質(zhì)粒的復制起點，保證pBluescript噬菌粒載體在有或無輔助噬菌體共感染的不同情況下，按照不同的復制形式分別合成出單鏈或雙鏈DNA；(iii)編碼有一個氨芐青霉素抗性基因，作為轉(zhuǎn)化子克隆的選擇標記；(iv)含有一個lacZ基因，可以按照X-gal-IPTG組織化學顯色法篩選噬菌粒載體的重組子。5分子生物學研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)DNA連接酶能把不同的DNA片段連接成一個整體5分子生物學研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)僅僅能在體外利用限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶進行DNA的切割和重組，還不能滿足基因工程的要求，只有將它們連接到具備自主復制能力的DNA分子上，才能在寄主細胞中進行繁殖。具備自主復制能力的DNA分子就是分子克隆的載體（vector）。病毒、噬菌體和質(zhì)粒等小分子量復制子都可以作為基因?qū)氲妮d體。獲得了用外源DNA片段和載體分子重組而成的雜種DNA分子后，還必須通過一個被稱為細菌轉(zhuǎn)化的過程將其重新導入到寄主細胞中，才能保證重組DNA分子的增殖。5分子生物學研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)5.2DNA基本操作技術(shù)1、核酸的凝膠電泳自從瓊脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝膠被引入核酸研究以來，按分子量大小分離DNA的凝膠電泳技術(shù)，已經(jīng)發(fā)展成為一種分析鑒定重組DNA分子及蛋白質(zhì)與核酸相互作用的重要實驗手段。一種分子被放置到電場中，它就會以一定的速度移向適當?shù)碾姌O。我們把這種電泳分子在電場作用下的遷移速度，叫做電泳的遷移率，它與電場強度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷數(shù)成正比，與片段大小成反比。生理條件下，核酸分子中的磷酸基團呈離子化狀態(tài)，所以，DNA和RNA又被稱為多聚陰離子（polyanions），在電場中向正電極的方向遷移。由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正電極方向遷移。瓊脂糖凝膠分辨DNA片段的范圍為0.2~50kb之間。聚丙烯酰胺凝膠的分辨范圍為1到1000個堿基對之間。凝膠濃度的高低影響凝膠介質(zhì)孔隙的大小，濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強。5分子生物學研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)5分子生物學研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)瓊脂糖及聚丙烯酰胺凝膠分辨DNA片段的能力溴化乙錠染料的化學結(jié)構(gòu)及其對DNA分子的插入作用。由于插入了溴化乙錠分子，在紫外光照射下，瓊脂糖凝膠電泳中DNA的條帶便呈現(xiàn)出橘黃色熒光，易于鑒定。5分子生物學研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)2、細菌轉(zhuǎn)化與目標DNA分子的增殖通過細菌轉(zhuǎn)化方法將體外構(gòu)建好的雜種DNA分子導入宿主細胞中。外源DNA通過自身載體上的復制起始點進行復制增殖，能在宿主細胞中長期保存下來，并能以完整的形式從細胞中被分離純化出來。細菌轉(zhuǎn)化（transformation），是指一種細菌菌株由于捕獲了來自供體菌株的DNA而導致性狀特征發(fā)生遺傳改變的過程。圖：細菌轉(zhuǎn)化及藍白斑篩選5分子生物學研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)為提高效率，可對受體菌進行物理或化學處理，增加其獲取DNA的能力。經(jīng)過這種處理的細胞被稱作感受態(tài)細胞（competentcells）。CaCl2法將快速生長期大腸桿菌置于經(jīng)0℃預處理的低滲CaCl2溶液中，細胞膨脹，膜通透性改變，易與外源DNA相粘附。將該體系轉(zhuǎn)移到42℃下做短暫的熱刺激，外源DNA就可能被細胞吸收。將經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的細胞置于選擇性培養(yǎng)基上，篩選陽性克隆。轉(zhuǎn)化效率可達到5×106~2×107個轉(zhuǎn)化子/μg超螺旋質(zhì)粒DNA。電擊法電脈沖可以在細胞膜上造成小凹陷，形成疏水孔洞。隨著跨膜電壓增加，大疏水性孔洞會轉(zhuǎn)變?yōu)橛H水性孔洞，介質(zhì)中的DNA進入細胞質(zhì)。將生長至對數(shù)中期的E.coli菌液冷卻至4℃后離心，洗菌后用10%的甘油懸浮，將高密度菌液（~2×1010/ml）置于特制的電極杯中進行電擊。獲得最大轉(zhuǎn)化效率時場強一般為12.5~15kV/cm，時間跨度一般為4.5~5.5毫秒。電擊轉(zhuǎn)化與溫度有關(guān)，一般在0~4℃進行。由于轉(zhuǎn)化載體上常帶有LacZ基因，多用帶有不同抗生素的選擇性培養(yǎng)基結(jié)合α-互補藍白斑篩選法鑒定轉(zhuǎn)化細胞。5分子生物學研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)3、聚合酶鏈式反應（PCR）技術(shù)聚合酶鏈式反應是快速擴增DNA序列最常用的方法。PCR反應的模板DNA若是基因組上的某個片段，就稱為genomicPCR，若是mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA，就稱為RT-PCR。5分子生物學研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)PCR的故事凱利·穆利斯（KaryMullis），1944年出生，1962年在佐治亞理工學院化學工程專業(yè)畢業(yè)。受同學們的蠱惑，1966年報考加州伯克利大學生化專業(yè)研究生被錄取。1968年一個人在《Nature》發(fā)表“時間反演的宇宙學意義”論文并僥幸通過了博士生資格考試。1972年，以“微生物鐵轉(zhuǎn)運因子的結(jié)構(gòu)與有機合成”獲得博士學位。畢業(yè)后，嘗試寫小說，但因“不能使一部分人物具有不幸的遭遇”而失敗，又因厭惡天天宰殺實驗小鼠而兩次丟掉工作。他有一條可能引起不少同學共鳴的學習曲線：剛開始時，對拓寬自身知識面表現(xiàn)出極大的興趣—知識迅速上升，然后徘徊不前，最終進入失望和不安階段—辭職。以后去一家小咖啡館當了兩年經(jīng)理。1979年加入西特斯公司，負責DNA合成。正是費時費力的DNA合成（單引物，以算術(shù)級數(shù)增長），激發(fā)了他的思維。5分子生物學研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)1983年8月，穆利斯第一次在公司正式作了一個有關(guān)PCR原理的學術(shù)報告。人們對這個報告的反應冷談，只有少數(shù)幾個實驗技術(shù)人員有些興趣。穆利斯回憶說，“絕大多數(shù)人要么在我結(jié)束報告之前就離開了會場，要么故意留下來給我出難題。他們認為這些肯定是胡說八道。”普遍的觀點是，雖然我不夠聰明，沒看出問題的要害所在，但肯定有理由證明這個方法不行，要不為什么從前沒人想到呢？《SCIENCE》在1985年發(fā)表了第一篇關(guān)于PCR的論文。1993年，穆利斯由于發(fā)明了PCR獲得諾貝爾化學獎。5分子生物學研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)PCR技術(shù)的原理首先將雙鏈DNA分子在臨近沸點的溫度下加熱分離成兩條單鏈DNA分子，DNA聚合酶以單鏈DNA為模板并利用反應混合物中的四種脫氧核苷三磷酸和實驗中提供的引物序列合成新生的DNA互補鏈。DNA解鏈（變性）引物與模板DNA相結(jié)合（退火）DNA合成（鏈的延伸）三步。經(jīng)不斷重復循環(huán)之后，反應混合物中所含有的雙鏈DNA分子數(shù)，即兩條引物結(jié)合位點之間的DNA區(qū)段的拷貝數(shù)，理論上的最高值應是2n,實得1.8n。5分子生物學研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)將含有待擴增DNA樣品的反應混合物放置在高溫（>94℃）環(huán)境下加熱1分鐘，使雙鏈DNA變性，形成單鏈模板DNA。降低反應溫度（退火，約50℃），約1分鐘，使寡核苷酸引物與兩條單鏈模板DNA結(jié)合在靶DNA區(qū)段兩端的互補序列位置上。將反應混合物的溫度上升到72℃左右保溫1-數(shù)分鐘，在DNA聚合酶的作用下，從引物的3'-端加入脫氧核苷三磷酸，并沿著模板分子按5'→3'方向延伸，合成新生DNA互補鏈。5分子生物學研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)常規(guī)PCR技術(shù)能擴增兩引物之間的DNA區(qū)段，然而，有時我們也希望擴增位于靶DNA區(qū)段之外的未知DNA序列，這就需要應用反向PCR（reversePCR）技術(shù)。用一種在靶序列上沒有酶切位點的核酸限制性內(nèi)切酶消化DNA；產(chǎn)生大小不同的線性DNA片段群體，其中靶DNA區(qū)段的DNA分子長度不超過2~3kb，經(jīng)連接后重新環(huán)化；按靶序列設(shè)計的一對引物與互補序列退火結(jié)合，其延伸方向如箭頭所指；左圖為反向PCR的基本操作程序。波紋線表示靶DNA區(qū)段，箭頭表示限制性內(nèi)切酶位點，分別用方框表示靶DNA區(qū)段的左側(cè)和右側(cè)序列。5分子生物學研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)4、實時定量PCR（realtimequantitativePCR，Q-PCR）由于PCR敏感性高，擴增產(chǎn)物總量變異系數(shù)大，定量不準確。90年代末期出現(xiàn)了Q-PCR，利用熒光檢測PCR儀繪制DNA擴增過程中的累積速率動態(tài)變化圖，基本消除在測定終端產(chǎn)物豐度時變異系數(shù)較大的問題。混合在PCR反應液中的熒光探針只有與大片段DNA結(jié)合后，才能夠被激發(fā)出熒光。隨著新合成DNA片段的增加，由于結(jié)合到DNA上的熒光探針增加，被激發(fā)產(chǎn)生的熒光相應增加。非序列特異性熒光染料SYBRGreenI,激發(fā)光波長520nm。左圖為SYBRGreenI作探針的實時定量PCR實驗過程圖示5分子生物學研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)Ct值是產(chǎn)物熒光強度首次超過設(shè)定閾值時，PCR反應所需的循環(huán)數(shù)。利用標準曲線，可以確定樣品中待檢測靶DNA的絕對含量。下圖為用實時定量PCR法分析未知樣品靶基因的絕對表達量。5分子生物學研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)為確保熒光檢測的確實是靶DNA，又設(shè)計了僅能與目的DNA特異結(jié)合的熒光探針。TaqMan探針是一段與靶DNA序列中間部位結(jié)合的單鏈DNA，長50bp-150bp，該DNA的5’和3’端帶有短波長和長波長兩個不同熒光基團，由于彼此距離靠近，在熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）作用下發(fā)生熒光淬滅，因而檢測不到熒光。隨著PCR反應的進行，TaqMan探針結(jié)合到目的DNA序列上，并且會被具有外切酶活性的TaqDNA聚合酶逐個切除而降解。切下來的熒光基團解除了熒光淬滅的束縛，會在激發(fā)光下發(fā)出熒光，因此，產(chǎn)生的熒光強度直接反映了所擴增靶DNA的總量。5分子生物學研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)5、基因組DNA文庫構(gòu)建把某種生物的基因組DNA切成適當大小，分別與載體組合，導入微生物細胞，形成克隆。匯集包含基因組中所有DNA序列的克隆（理論上每個序列至少有一個代表），這樣的克隆片段的總匯，稱為基因組DNA文庫。構(gòu)建基因組文庫最常用的是λ噬菌體載體（克隆能力約15-20kb）和限制性內(nèi)切酶部分消化法。例如用識別4個核苷酸的核酸限制性內(nèi)切酶Sau3A，與BamHI是一對同尾酶消化DNA，由Sau3A酶切產(chǎn)生的DNA片段可插入到經(jīng)BamHI消化的λ噬菌體載體上。此外，還有很多大容量克隆載體，如柯斯質(zhì)粒、細菌人工染色體（BAC）、P1源人工染色體（PAC）、酵母人工染色體（YAC）等都可用于基因組文庫的構(gòu)建。它們的優(yōu)點是可以插入更大片段DNA，但是穩(wěn)定性一般較差，在大量復制的過程中容易出現(xiàn)缺失現(xiàn)象。操作也相對較困難。5分子生物學研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)5分子生物學研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)5.3RNA基本操作技術(shù)真核生物基因組DNA龐大，有大量重復序列，很難直接分離得到靶基因片段。而cDNA來自反轉(zhuǎn)錄的mRNA，無冗余序列，通過篩選cDNA文庫，可較快地分離到相關(guān)基因。細胞中的總RNA包括mRNA，rRNA，tRNA以及一些小RNA（sRNA）。一個典型的動物細胞約含10-5μgRNA，其中：80%-85%為rRNA15%-20%為tRNA及sRNAmRNA約占總RNA的1%-5%rRNA分子具有確定的大小和核苷酸序列，特別是28S和18S特征性條帶是電泳鑒定總RNA純度和完整性的重要參數(shù)。RNA的濃度和純度可以通過測定其OD260和OD280來判斷。OD260為1時相當于濃度為40μg/ml，而OD260/OD280的比值如果在1.8-2.0之間，表示所提取的RNA純度較好，如果樣品中有蛋白質(zhì)或酚污染，則OD260/OD280的比值將明顯低于1.8。5分子生物學研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)PolyATtractmRNA的分離純化過程簡圖5分子生物學研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)由于RNA分子敏感脆弱，在自然狀態(tài)下難以被擴增，為了研究mRNA所包含的功能基因信息，一般將其反轉(zhuǎn)錄成穩(wěn)定的DNA雙螺旋（cDNA，complementaryDNA），再插入到可以自我復制的載體中。左圖為cDNA合成過程示意圖5分子生物學研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)定向cDNA合成及分子修飾因為絕大多數(shù)大腸桿菌細胞都會切除帶有5'-甲基胞嘧啶的外源DNA，所以實驗中常選用mcrA-mcrB-菌株以防止cDNA被降解。5分子生物學研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)cDNA文庫的構(gòu)建cDNA的長度一般在0.5-8kb之間，質(zhì)粒載體和噬菌體類載體都能滿足要求。cDNA文庫常用Uni-zapXR（一種λ噬菌粒載體）做載體，它具備噬菌體的高效性和質(zhì)粒載體系統(tǒng)利用藍白斑篩選的便利，可容納0-10kbDNA插入片段，含有pBluescript載體的全部序列。重組后可通過體內(nèi)剪切反應（InVivoExcision）將cDNA插入片段轉(zhuǎn)移到質(zhì)粒系統(tǒng)中進行篩選、克隆和序列分析。基因文庫的篩選基因文庫的篩選是指通過某種特殊方法從基因文庫中鑒定出含有所需重組DNA分子的特定克隆的過程。篩選的方法有很多種，如核酸雜交法，PCR篩選法和免疫篩選法等。5分子生物學研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)核酸雜交法：核酸雜交法以其廣泛的適用性和快速性成為基因文庫篩選中最常用的一種方法，用放射性標記的特異DNA探針適用于高密度的菌落雜交篩選。將待篩選菌落轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，適當溫育。同時保留原來的菌落平板作對照。取出已經(jīng)長有菌落的膜，用堿液處理，使菌落發(fā)生裂解，DNA隨之變性。用蛋白酶K處理硝酸纖維素膜去除蛋白質(zhì)，形成菌落DNA的印跡。80℃烘烤濾膜，將DNA固定在膜上。將濾膜與放射性標記的DNA或RNA探針雜交，通過放射性自顯影顯示雜交結(jié)果。通過對應于平板上的位置找到相應克隆。5分子生物學研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)PCR篩選法將整個文庫（以質(zhì)粒的形式或者細菌的形式均可）保存在多孔培養(yǎng)板上，用設(shè)計好的目的基因探針對每個孔進行PCR篩選，鑒定出陽性的孔，把每個陽性孔中的克隆再稀釋到次級多孔板中進行PCR篩選。重復以上程序，直到鑒定出與目的基因?qū)膯蝹€克隆為止。免疫篩選法該法僅適用于對表達文庫的篩選。若實驗中靶基因的序列完全未知但是有針對該基因產(chǎn)物的特異性抗體，就可以采用免疫篩選法。左圖為噬菌體表達文庫的免疫化學篩選法示意圖5分子生物學研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)5.4SNP的理論和應用第11章再講！5分子生物學研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)5.5基因克?。╟lone）技術(shù)在多細胞的高等生物個體水平上，克隆表示由具有相同基因型的同一物種的兩個或數(shù)個個體組成的群體。從同一受精卵分裂而來的單卵雙生子（monozygotictwins）便是屬于同一克隆。在細胞水平上，克隆一詞是指由同一個祖細胞（progenitorcell）分裂而來的一群帶有完全相同遺傳物質(zhì)的子細胞。在分子生物學上，人們把將外源DNA插入具有復制能力的載體DNA中，使之得以永久保存和復制這種過程稱為克隆。5分子生物學研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)1、RACE技術(shù)（rapidamplificationofcDNAends）在已知cDNA序列基礎(chǔ)上克隆5’或3’端缺失序列的技術(shù)。根據(jù)已知序列設(shè)計基因片段內(nèi)部特異引物，由該片段向外側(cè)進行PCR擴增得到目的序列。用于擴增5’端的方法稱為5’RACE，用于擴增3’端的稱為3’RACE。5’RACE在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以基因片段內(nèi)部特異性引物（GSP1）啟始cDNA第一條鏈合成。RNase降解模板鏈mRNA，純化第一鏈。用末端轉(zhuǎn)移酶在cDNA鏈3’端加入連續(xù)的dCTP。以連有oligo(dG)的錨定引物和基因片段內(nèi)部特異的nested引物進行PCR擴增，得到目的片段，用nestPCR檢測。5分子生物學研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)3’RACE1、用oligo(dT)錨定引物啟始cDNA第一鏈的合成。2、降解模板mRNA。3、用通用錨定引物和基因片段內(nèi)部特異引物進行PCR擴增得到目的3’片段，用nestPCR法檢測。5分子生物學研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)2、cDNA差示分析法(RDA,RepresentationDifferenceAnalysis)通過降低cDNA群體復雜性和更換cDNA兩端接頭等方法，特異性擴增目的基因片段。因為Tester和Driver在接受差示分析前均經(jīng)一個4堿基切割酶處理，形成平均長度256bp的代表群，保證絕大部分遺傳信息能被擴增。每次T減D反應后僅設(shè)置72℃復性與延伸，94℃變性這兩個參數(shù)共20個PCR循環(huán)，PCR產(chǎn)物的特異性和所得探針的純度高。5分子生物學研究法-上—DNA、RNA及蛋白質(zhì)3、Gatewa