微生物檢驗技術-病毒檢驗技術

1病毒分離與鑒定2病毒分離和鑒定的一般程序

臨床標本的收集標本處理后接種新生小鼠組織雞胚收獲尿囊液、羊膜腔液紅細胞凝集試驗CPE紅細胞吸附空斑試驗包涵體EM觀察發(fā)病3

組織細胞培養(yǎng)雞胚培養(yǎng)動物接種一、病毒的分離方法4

1.組織細胞培養(yǎng)

根據(jù)細胞的來源、特性和傳代次數(shù)分為：(1)原代細胞培養(yǎng)：將離體的新鮮組織器官經機械或胰蛋白酶處理，制成單個細胞懸液，加營養(yǎng)液在細胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。原代細胞再用胰蛋白酶或EDTA等消化后加營養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，稱次代細胞。

5(2)二倍體細胞株：原代細胞體外分裂50代仍保持二倍體特性，如人胚肺細胞。廣泛用于病毒分離和疫苗制備。(3)傳代細胞株：來于腫瘤細胞，染色體特征類似腫瘤細胞。常用的有人宮頸癌細胞(Hela)、人喉上皮癌細胞(Hep-2)。繁殖快，易于傳代保存。只能用于病毒分離，不能用于疫苗制備。6常用于病毒分離的細胞

細胞種類可分離的病毒

原代細胞非洲綠猴腎細胞人單核細胞人胚腎、肺細胞恒河猴獼猴腎細胞HSV、RSV、VZV、腮腺炎病毒、風疹病毒

HIV、HTLV、HHV-6腮腺炎病毒、腺病毒ECHO、脊髓灰質炎病毒、柯薩奇A、B組、RSV二倍體細胞株人胚肺成纖維細胞株

WI-38、MRC—5CMV、VZV、鼻病毒腮腺炎病毒、腺病毒傳代細胞系

HelaHep-2Vero

柯薩奇A、B組、RSV腺病毒、RSVHSV、RSV、風疹病毒、輪狀病毒、麻疹病毒7正常細胞細胞病變效應CPE8

雞胚是用于分離粘病毒科、皰疹病毒、痘類病毒的較為理想的材料。

優(yōu)點:有不同部位可以接種，易于病毒繁殖；來源充足，操作簡便；通常是無菌的；對接種病毒不產生抗體。

缺點:卵黃中含有抗家禽病原的抗體；可帶有某些病毒如雞白血病病毒；飼料中的抗生素也能傳遞給雞胚。2．雞胚接種9

雞胚的接種方法

卵黃囊接種羊膜腔接種尿囊腔接種絨毛尿囊膜接種腦內接種胚體接種1011常用動物:動物十分重要。小鼠、乳鼠、家兔、豚鼠、猴等常用于分離病毒。接種部位:靜脈、鼻咽腔、腹腔、腦內、皮內、皮下等。發(fā)病情況觀察:食欲、活動及糞便情況；局部和全身變化;神經系統(tǒng)感染可出現(xiàn)震顫、松毛，軟弱、不安、弓背、抽死亡；呼吸系統(tǒng)病毒可出現(xiàn)咳嗽、呼吸加快、少食等。不死，解剖后查病毒抗原，死亡，取病變組織傳代和鑒定。3．動物接種12

病毒鑒定的方法

1、病毒增殖后導致細胞形態(tài)變化:①細胞病變效應(CPE)：細胞腫大，變圓堆積成葡萄狀，細胞溶解出現(xiàn)空斑。13②多核巨細胞和包涵體。細胞融合形成多核巨細胞，胞漿內或核出現(xiàn)嗜酸性或嗜堿性包涵體等；

2.紅細胞吸附：血凝現(xiàn)象。

3.細胞培養(yǎng)液pH的變化。144.病毒的數(shù)量與感染性測定(1)空斑或蝕斑形成試驗

空斑是指在單層細胞中被病毒感染引起死亡的細胞區(qū)域，周圍被活細胞包圍。一般而言，一個空斑是由一個感染性病毒顆粒感染所引起的。15蝕斑（plaque）測定蝕斑形成單位（plaqueformingunit,PFU）病毒的數(shù)量與病毒毒力測定。(2)50%感染量或50%組織感染量（ID50或TCID50）測定

：用來估計病毒感染的強弱程度。164.其他實驗

(1)干擾現(xiàn)象:

某些病毒間存在著干擾現(xiàn)象，如某些型別的鼻病毒能干擾以后進入的副流感病毒的增殖，從而阻抑后者的紅細胞吸附作用。17(2)耐酸試驗

腸道病毒對酸有耐受力，而鼻病毒在酸性環(huán)境下易被滅活。(3)乙醚敏感試驗病毒外圍如有類脂包膜，則易被乙醚破壞，而失去感染性，不能感染細胞?？勺鳛椴《臼欠窬哂蓄愔さ囊罁?jù)，也可用氯仿或去膽酸鈉代替乙醚進行試驗。18

一、血清學診斷方法

（一）抗原的檢測：

病毒抗原是病毒特異性的標志，通過免疫學技術檢測標本中特異性抗原存在，可以早期診斷病毒感染。病毒血清學診斷及其他快速診斷方法191．免疫熒光技術適合于型別少，細胞培養(yǎng)難以成功的病毒，如流感病毒、副流感病毒、皰疹病毒、巨細胞病毒、腺病毒等。肝活檢組織中的肝炎病毒、神經組織中的單純皰疹病毒、腦組織中的狂犬病毒或其他脫落細胞和活檢組織中的病毒抗原檢測。202．酶免疫技術

有酶免疫組化和酶免疫吸附(ELlSA)試驗法。測定標本中游離的抗原或抗體。如檢測乙型肝炎病毒的表面抗原(HBsAg)，HIV感染病人的P24抗體等。213.其他技術

如固相放射免疫技術、發(fā)光免疫分析技術、膠體金標記的免疫層析技術等。22●標本采集時間、急性期單份血清IgM、雙份血清IgG●常用血清試驗原理和用途

1、中和試驗

（二）抗體檢測

2、補體結合試驗3、血凝及血凝抑制試驗4、免疫熒光試驗5、酶聯(lián)免疫吸附試驗6、免疫印跡實驗7、固相免疫放射測定23早期抗體檢測

檢測病毒感染機體后產生的早期特異性抗體，如測定特異性IgM可以快速明確診斷各種病毒引起的新生兒先天性感染，測定HAV感染后抗HAV的IgM抗體可以明確診斷HAV等。24

二、病毒的分子生物學檢測方法

只要有完整的特異基因片段存在，就可進行診斷。25（一）核酸分子雜交技術：1．斑點雜交法

將待測的DNA或RNA直接點在雜交濾膜上，變性后，用標記的核酸探針進行雜交。用32p或131I同位素標記的探針通過放射自顯影，可直接觀察?，F(xiàn)用地高辛、生物素等非同位素物質標記，然后采用酶反應或酶免疫技術進行檢測，已被越來越多的實驗室廣泛使用。262.原位分子雜交技術

在細胞原位暴露DNA或RNA，加入標記特異核酸探針進行雜交。通過顯色技術可顯示特定雜交探針在細胞內的位置和核酸的數(shù)量。27

3.Southern印跡和Northern印跡法

Southern印跡法用于DNA的雜交。提取DNA,用內切酶切割后，進行瓊脂糖電泳按分子量使DNA分開，將DNA移至硝酸纖維膜上，用標記探針進行雜交?？梢詸z測病毒DNA特異序列。

Northern印跡法用于RNA雜交分析。將瓊脂糖電泳后的RNA移至DBM膜上，用標記探針進行雜交。用于檢測RNA或mRNA。28

（二）聚合酶鏈反應(PCR)

選擇病毒的特異保守片段作為靶基因，進行引物設計和擴增可診斷病毒性感染。(1)DNA病毒：可直接進行PCR擴增其特異片段。(2)RNA病毒：可通過RT-PCR技術，將RNA逆轉錄為cDNA，再進行PCR擴增。29(3)定量PCR技術：對擴增的產物進行原始標本定量，對病毒感染的診斷起到了量化的作用。同時，對研究病毒和機體之間的關系提供了參考。30（三）基因芯片技術將數(shù)以萬計、乃至百萬計的特定序列的DNA片段（基因探針），有規(guī)律地排列固定于2平方厘米的硅片、玻片等支持物上，構成的一個二維DNA探針陣列，與計算機的電子芯片十分相似，所以被稱為基因芯片?；蛐酒饕糜诨驒z測工作。31

病毒形態(tài)學檢驗技術

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通過測定病毒的特異標志成分，如特殊形態(tài)、特異的抗原成分及病毒的核酸，早期確認病毒的感染，是病毒學診斷的重大發(fā)展。

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一、形態(tài)學檢查

1．光學顯微鏡：查包涵體。

狂犬病病毒在腦細胞出現(xiàn)嗜酸性的圓形或橢圓形包涵體，稱為內基小體。

巨細胞病毒在上皮細胞的細胞核內出現(xiàn)周圍繞有一輪暈似“貓頭鷹眼”樣大型嗜酸性包涵體。34Negribodyinaneuron352